Avaliando Murino Resistência Função Usando Miografia Pressão Arterial

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar a reatividade vascular em tempo real de artéria resistente de camundongo in vitro em condições próximas às fisiológicas. Isso é alcançado ao montar um pequeno segmento do vaso em duas cânulas microscópicas e mantê-lo sob pressão luminal fisiológica. O vaso é então constrito com um agonista do receptor alfa um, fenilefrina, para estudar a capacidade de qualquer fármaco em dilatar o vaso.

Desafiar o vaso contraído com acetilcolina avalia sua capacidade de dilatar em tempo real por meio de um mecanismo dependente do endotélio. Os resultados mostram a porcentagem de alteração no diâmetro da luz em resposta à acetilcolina e confirmam que a deficiência da SGC alfa um resulta em vasodilatação dependente do endotélio prejudicada. A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como a mamografia com fio, é que a mamografia de pressão permite a caracterização de pequenos vasos microscópicos, que são mais relevantes na manutenção da homeostase da pressão arterial do que os vasos de maior calibre.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área cardiovascular, como a hipertensão, na qual os vasos resistentes macro desempenham um papel crítico. Comece por eutanasiar um camundongo com pentobarbital. Em seguida, abra a cavidade abdominal e inicie a dissecação do tecido mesentérico.

Agora identifique uma artéria mesentérica de terceira ordem e isole-a do tecido conjuntivo e adiposo. A diferenciação entre artérias e veias no nível dos microvasos é problemática quando não há sangue nos vasos. Portanto, realizar isso no animal intacto é preferível.

Em seguida, corte um segmento de dois a três milímetros de comprimento de artéria mesentérica de terceira ordem e coloque-o em uma placa contendo tampão PSS. O segmento arterial não deve conter ramificações.

Prepare a câmara mióica enchendo suavemente as cânulas através das válvulas de entrada e saída com solução PSS a partir de uma seringa de 10 mililitros, tendo cuidado pois pressão excessiva pode danificar o transdutor frágil conectado às cânulas. Após encher completamente as cânulas, feche ambas as válvulas. Em seguida, transfira o segmento arterial isolado para a câmara e fixe uma das extremidades do vaso na cânula direita.

Fixe cuidadosamente com um fino fio de sutura de náilon, utilizando uma seringa para lavar e encher o vaso com solução heap através da válvula de entrada. Agora, monte a outra extremidade do vaso na cânula esquerda e fixe a cânula ao vaso com a sutura de náilon. Encha a câmara com até 10 mililitros de solução heap.

Verifique se há vazamento empurrando suavemente a solução de heap pela válvula de entrada com a ajuda de uma seringa. Agora, posicione a câmara sob a câmera de vídeo. Inicie o fornecimento de oxigênio e aqueça a câmara a 37 graus Celsius enquanto a válvula de entrada estiver fechada e conectada ao tubo P1 do reservatório da primeira solução de heap.

Deixe qualquer bolha e solução passar pelo tubo até que não haja bolhas no interior do tubo. Em seguida, abra a válvula. Conecte-se à válvula esquerda da câmara com o tubo P dois.

Proveniente do regulador de pressão, certifique-se de que não há bolhas ou vazamentos em todo o sistema. Acesse o menu de pressão no painel da interface myo ou no software e ligue a bomba enquanto desliga o fluxo. Abra o programa e clique em coletar.

O monitoramento e a análise do lúmen vascular, do diâmetro do vaso e da espessura da parede agora são possíveis. Para aumentar gradualmente a pressão intraluminal, selecione a pressão P1 e insira uma sequência de pressões ascendentes. Valores de cinco a 60 milímetros de mercúrio podem fazer com que os vasos girem ou se tornem convolutos enquanto a pressão aumenta, portanto, ajuste a tensão ou a deformação conforme necessário com a ajuda de um microposicionador vertical ou longitudinal.

Uma vez que a pressão esteja em 60 milímetros e o banho em 37 graus Celsius, equilibre o vaso por pelo menos 45 minutos e até uma hora durante o período de equilíbrio. Troque a solução do banho uma vez com solução pré-aquecida. Agora que a seção arterial está equilibrada, aplique 10 mililitros de solução despolarizante de cloreto de potássio a 37 graus Celsius.

O músculo liso irá despolarizar completamente e atingir a constrição máxima. Após obter uma constrição estável, lave o banho com solução heap três vezes em intervalos de 10 minutos. Agora, verifique a viabilidade do vaso e a integridade do endotélio.

Primeiro, pré-constrinja o vaso adicionando fenilefrina até atingir a concentração de 10⁻⁵ mol/L. Quando for obtida uma constrição estável, realize uma curva cumulativa de resposta de vasodilatação por adição sequencial de doses crescentes de acetilcolina, variando de 10⁻⁹ a 10⁻⁵ mol/L. Após a última dose de acetilcolina, lave o preparo três vezes com solução de Krebs em intervalos de 10 minutos.

Agora, determine o diâmetro luminal passivo aplicando PSS livre de cálcio contendo dois milimoles de EGTA por litro a partir dos traçados registrados. Meça o diâmetro luminal para cada resposta à dose, que será usado para calcular todos os parâmetros. Expresse a resposta de relaxamento da acetilcolina como uma comparação entre o tratamento com o agonista e o tampão livre de cálcio em termos da magnitude em que cada um alterou o diâmetro luminal a partir da constrição induzida pela fenilefrina.

A miografia por pressão foi utilizada para estudar o relaxamento vascular em resposta à acetilcolina em artérias de resistência mesentéricas isoladas de camundongos selvagens e camundongos knockout para SGC alfa um nas linhagens S seis e black seis, previamente contraídas com fenilefrina. A deficiência de SGC alfa um esteve associada à diminuição da capacidade da acetilcolina de induzir relaxamento vascular, independentemente do background genético dos camundongos estudados. No entanto, o relaxamento dependente do endotélio em camundongos nulos para SGC alfa um foi mais acentuadamente prejudicado na linhagem S seis do que na linhagem black seis.

Em conjunto, esses achados sugerem que a diminuição da sensibilidade da vasculatura ao relaxamento dependente do endotélio pode contribuir para a hipertensão específica da linhagem em camundongos knockout para o gene SGC Alpha one. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma ou duas horas, se for executada corretamente. Além deste procedimento, outros métodos, como a microscopia confocal, podem ser realizados simultaneamente em vasos sanguíneos vivos. Isso permitiria, por exemplo, a medição das concentrações intracelulares de ferro, o que pode ajudar a identificar os mecanismos de sinalização subjacentes.