الظهارية إعادة تعمير خلية وإعداد القوارض خارج الخلية مصفوفة السقالات للتنمية نسيج الكلى

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعادة تعمير سقالات المصفوفة خارج الخلوية لكلى القوارض ثلاثية الأبعاد الخالية من الخلايا باستخدام خلايا ظهارية كلوية بشرية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة الخلايا من كلية جرذ من نوع haw باستخدام سلسلة من المحاليل المنظفة التي يتم ترويتها عبر الشريان الكلوي على مدار 26 ساعة. ثم يتم تعقيم الكلية وحقن سقالات المصفوفة خارج الخلوية الكلوية الخالية من الخلايا بـ 40 مليون خلية ظهارية أنبوبية قشرية كلوية بشرية أو خلايا RCTE، وذلك تحت تروية شريانية أمامية مستمرة داخل نظام مفاعل حيوي مصمم خصيصاً.

في نهاية المطاف، يمكن تقييم قدرة خلايا RCTE على إعادة استيطان ساند الكلية من خلال التصوير الشعاعي (ER) ومقايسة التروية والتحليل الكيميائي النسيجي المناعي. تتيح تقنية زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد هذه للباحثين إعادة استيطان المصفوفة خارج الخلية للعضو بأكمله. يتم ترسيب خلايا الساند ضمن الحيز المحيط بالأنبوب داخل المصفوفة خارج الخلية للسماح بدراسة وعوامل الارتباط التي تؤثر على نمو الخلايا وتمايزها ونضجها.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق البديلة، مثل تصنيع السقالات البوليمرية الاصطناعية، في أن المصفوفة خارج الخلية الكلوية تسهل التصاق الخلايا المروية وتكاثرها ونضجها ضمن شبكة معقدة من البروتينات الهيكلية الطبيعية وعوامل النمو والمكونات البيولوجية الأخرى. ابدأ إجراء إزالة الخلايا بتوصيل قثطرة الشريان الكلوي لكل كلية مذابة بنهاية أنابيب دائرة التروية بعد المضخة، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء محتجزة في القثطرة. وفي حال وجود فقاعات هواء في القثطرة، استخدم ماصة دقيقة سعة 200 µL لسحب الفقاعات وملء القثطرة بالسائل.

قم بتعليق الكلية على طول الجدار الداخلي لدورق فارغ سعة خمسة لترات بحيث لا يكون الشريان الكلوي ملتوياً أو متجعداً، واضبط محرك المضخة على خمسة ملليلتر في الدقيقة. ثم اضغط على زر البدء بعد التأكد من تروية كل كلية من خلال ملاحظة تقطير المحاليل من أسفل العضو، بالإضافة إلى تزويد كل كلية بالمحاليل المناسبة كما هو محدد في المخطط الانسيابي؛ وفي نهاية عملية التروية، تُحفظ الكلى منزوعة الخلايا في PBS في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية لمدة أقصاها يومين. بعد تجميع دائرة التروية، قم بإزالة الغطاء اللولبي الأحمر الموجود على رأس المفاعل الحيوي وانقل 50 ملليلتر من محلول حمض per acetic بنسبة 0.1% وإيثانول بنسبة 4% إلى خزان الوسط عبر الفتحة.

باستخدام خرطوشة مضخة كبيرة، قم بتوصيل جزء أنبوب المضخة التمعجية برأس المضخة. ثم اضبط معدل التدفق على 5 mL في الدقيقة. اضغط على زر البدء واترك الدائرة تتهيأ عندما يملأ السائل خط التدفق ويصل إلى المنفذ المفتوح المتبقي في صمام الإيقاف ثلاثي الاتجاهات.

استخدم سدادة توصيل (lure plug) ذكر لسد المنفذ. اترك الدائرة حتى تكتمل عملية التحضير تمامًا إلى أن يختفي الهواء من أنابيب دائرة التروية أو من الجانب الداخلي للمدخل. قم بطرد الفقاعات من دائرة التروية عن طريق زيادة معدل تدفق المضخة مؤقتًا.

عندما يتم تحضير النظام بالكامل، أوقف تشغيل مضخة الدفع وعقم ملقطاً بطول ست بوصات. قم بتوصيل الطرف الأنثوي (lure) لقسطرة الشريان الكلوي بعناية في المدخل الذكري (lure acceptor) الموجود على السطح الداخلي لرأس المفاعل الحيوي، مع التأكد من إحكام التوصيل وعدم وجود أي هواء داخل القسطرة. اترك الكلية تتدلى بلطف من قسطرة الشريان الكلوي بحيث لا يلتوي الشريان الكلوي أو ينثني.

بعد ذلك، أحكم ربط المشبك المعدني الذي يثبت رأس المفاعل الحيوي وجسمه معاً لضمان إحكام غلق خزان المفاعل الحيوي، ثم أغلق الغطاء اللولبي. الآن، قم بتعقيم الكلى عن طريق التروية في درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول حمض البيرأسيتيك والإيثانول بمعدل 5 mL في الدقيقة. وبعد مرور ساعة واحدة، أوقف المضخة وافتح الغطاء اللولبي الأحمر.

باستخدام مِصّة معقمة، اسحب بعناية كل المحلول من خزان المفاعل الحيوي. ثم انقل 50 milliliters من محلول PBS الطازج إلى خزان المفاعل الحيوي. أغلق الغطاء اللولبي وقم بتشغيل المضخة لإجراء ثلاث عمليات تروية متتالية لمدة ساعة واحدة لكل منها في درجة حرارة الغرفة وبمعدل خمس milliliters في الدقيقة.

بعد الشطف النهائي بمحلول PBS، اسحب المحلول الملحي من الخزان وأضف 50 milliliters من الوسط الغذائي إلى الخزان مع إغلاق الغطاء اللولبي. انقل المفاعل الحيوي مع دائرة التروية المتصلة به إلى حاضنة ذات سعة كبيرة عند 37 degrees Celsius و 5% carbon dioxide. ثم قم بتوصيل دائرة تروية المفاعل الحيوي بالمضخة وقم بتروية الكلى بمعدل four milliliters per minute لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل عملية الاستزراع.

لإجراء عملية التخليّة، يتم تجميع عدد كافٍ من دوارق الزرع لتحقيق تركيز التوطين المطلوب. بعد ذلك، وبعد شفط وسط الزرع من كل دورق، استخدم 10 milliliters من إنزيم تفكيك الخلايا المناسب لفصل خلايا الظهارة الأنبوبية القشرية الكلوية من الدورق عند درجة حرارة 37 °C. بعد مرور 10 دقائق، ابدأ بفحص الدوارق باستخدام مجهر تباين الأطوار كل دقيقتين حتى يُلاحظ انفصال الثنيات.

بعد ذلك، وبعد أخذ عينة صغيرة من الخلايا لعدّها، قم بتخفيف معلق الخلايا المرتبط في حجم مساوٍ من وسط premed، ثم قم بطرد الخلايا مركزة. قم بإعادة تعليق الراسب بحجم مناسب من وسط الزرع للحصول على تركيز نهائي قدره 2 × 10⁷ خلية/مل. انقل 2 مل من معلق التوزيع إلى طبق زرع بقطر 35 مم، ثم اسحب حجم 2 مل في محقنة معقمة سعة 5 مل.

انقل المفاعل الحيوي للتروية إلى خزانة السلامة البيولوجية، ثم أدر صمام القفل لإغلاق التدفق إلى منفذ التثبيت. قم بإزالة سدادة اللور الذكرية من صمام القفل وقم بتوصيل المحقنة. بعد ذلك، انقل دائرة التروية بسرعة مرة أخرى إلى الحاضنة، واستخدم خرطوشة المضخة الكبيرة لتثبيت جزء أنبوب المضخة 연دية (peristaltic pump) برأس المضخة لتثبيت الخلايا في مكانها.

أغلق فتحة صمام المحبس الموجهة نحو المضخة واحقن الخلايا ببطء في سكلة الكلية. بعد ذلك، أدر صمام المحبس لإغلاق التدفق من المحقنة وشغّل المضخة بمعدل 25 milliliters لكل دقيقة. وبعد مرور 15 دقيقة، خفّض معدل تدفق المضخة إلى four milliliters لكل دقيقة، مع استبدال الوسط في اليوم التالي وكل يومين بعد ذلك.

لتقييم حيوية الخلايا وتكاثرها، استبدل وسط الزرع بطريقة معقمة بـ 10 milliliters من محلول zarin العامل، مع إجراء تروية للسقالات الكلوية بمعدل أربعة milliliters في الدقيقة. بعد مرور ساعة واحدة بالضبط، اجمع محلول zarin المكيف والمختزل جزئياً وقم بإجراء تروية أخرى بمعدل أربعة milliliters في الدقيقة. وباستخدام 100 milliliters من وسط زرع طازج، أصبحت الكلى التي خضعت لتروية متتالية بالماء ومحاليل المنظفات المخففة أكثر شفافية تدريجياً على مدار فترة زمنية مدتها 26 ساعة. وبحلول التروية النهائية بالمنظف، ظهرت الشبكة الوعائية للكلى، وبشكل خاص الأوعية بين الفصيصات، بشكل بارز في السقالة منزوعة الخلايا. يتم تخليص العضو بأكمله من الخلايا الأصلية، مما يترك خلفه شبكة الغشاء القاعدي السليمة للكبيبات والأنابيب والقنوات الجامعة، بالإضافة إلى المصفوفة خارج الخلية للأوعية الدموية منزوعة الخلايا.

بالإضافة إلى الأوعية الكبيرة، تحتفظ الأغشية القاعدية للأوعية الدقيقة داخل الكبيبات بسلامتها الهيكلية أيضاً. وتتوطن خلايا RCTE التي تم استزراعها في سِقالة الكلية، كما تم توضيحه للتو، بشكل أساسي في المناطق القشرية من سِقالة الكلية، حيث تعيد استعمار الأنابيب المحيطة بالكبيبات بشكل تفضيلي. وينغرس عدد قليل من الخلايا داخل الكبيبات في اليوم الأول بعد الاستزراع، وبحلول اليوم السابع، تصبح الكبيبات خالية من الخلايا تقريباً، بينما تشغل غالبية هذه الخلايا المناطق القشرية للمصفوفة خارج الخلية الكلوية.

بعد سبعة أيام من استزراع التروية الأمامية، تظهر العديد من أنيببات خط RCTE في الأنيبيبات النخاعية الخارجية والحليمية والقنوات الجامعة بعد إعادة استيطان خلايا RCTE وأسبوع واحد من استزراع التروية. ومع ذلك، تُفقد الشفافية التي لوحظت بعد إزالة الخلايا، وتظهر الكلية المُعاد استيطانها معتمة وأقرب في المظهر إلى حالتها الطبيعية. وبعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التحليل الكيميائي المناعي لأوساط الاستزراع المكيّفة للإجابة على أسئلة إضافية مثل: كيف تتغير الحالات الأيضية أو المظهرية لهذه الخلايا داخل المصفوفة خارج الخلية الكلوية؟

تتيح القدرة على تطوير سقالات خارج خلوية وإعادة إضافة خلايا مانحة إلى المصفوفة للباحثين تحديد ملامح النمو والنضج في ثلاثة أبعاد ضمن سقالات المصفوفة الخارجية الكلوية الطبيعية. ويتمثل الهدف النهائي في استخدام هذه التقنية كأداة لفهم آليات الإصلاح والتجديد الكلوي بشكل أفضل.