Quantification du commerce intra-péritonéale Cancer de l'ovaire Métastase

L’objectif global de cette expérience est de déterminer la charge tumorale relative des métastases du cancer de l’ovaire intra-péritonéal dans un modèle murin de xénogreffe orthotopique syngénique. Cette nouvelle méthode d’imagerie et de quantification de la charge tumorale relative peut nous aider à répondre à des questions clés sur la régulation des métastases du cancer de l’ovaire. L’avantage fondamental de cette technique est qu’en démélangeant les spectres fluorescents, l’autofluorescence tissulaire est supprimée des images, ce qui permet de mesurer la charge tumorale relative standardisée.

Cette technique permet de mieux comprendre les métastases du cancer de l’ovaire humain, ce qui a des implications pour le suivi de l’efficacité des traitements. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car nous associons une technique d’imagerie robuste à une procédure analytique pour extraire des données quantitatives des images. La démonstration de la procédure d’aujourd’hui sera assurée par Yueying Liu, responsable du programme de laboratoire pour le Stack Lab.

Après 10 semaines de croissance des cellules tumorales, placez le corps de chaque souris anesthésiée dans un petit système d’imagerie optique animale, un à la fois. Analysez toutes les souris de la cohorte à chaque point temporel. Pour observer des cellules tumorales marquées par fluorescence, exécutez une acquisition multispectrale pour collecter un total de cinq images.

Sélectionnez une exposition standard de 15 secondes, un binning deux par deux, un champ de vision de 16 centimètres et une butée F de 1,1. Ensuite, acquérez une image de réflectance de l’animal entier à l’aide de la lumière blanche à partir d’un filtre d’excitation ouvert, d’un filtre d’émission ouvert, d’une exposition standard de 0,2 seconde avec binning deux par deux et d’un champ de vision de 16 centimètres, avec une butée F de 2,8. Après l’euthanasie, utilisez des ciseaux à dissection pointus pour couper la peau vers l’avant le long de la ligne médiane ventrale de la souris, du haut des cuisses au bas de la cage thoracique.

Séparez doucement la peau du tissu péritonéal, en veillant à ne pas perforer la paroi péritonéale. Ensuite, coupez latéralement, à la fois le long du bas de la cage thoracique et du haut des cuisses, pour créer deux rabats de peau. Placez la souris sur sa face ventrale dans le scanner, de sorte que la cavité péritonéale soit tournée vers le bas avec les rabats de peau ouverts.

Scannez la souris avec ses organes in situ, en utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés précédemment pour la souris vivante. Maintenant, continuez à disséquer la souris en extrayant le foie, l’épiploon, le pancréas, l’estomac, le diaphragme et l’intestin grêle et le gros intestin à l’aide de techniques standard. De plus, enlevez le péritoine gauche et droit, les ovaires, les reins, le mésentère et enfin, le coussinet adipeux.

Observez, énumérez et enregistrez chacune des tumeurs visibles sur les organes. Utilisez un pied à coulisse pour mesurer le diamètre de chaque tumeur. Désignez les tumeurs de moins de deux millimètres de diamètre comme petites, entre deux et cinq millimètres comme moyennes et supérieures à cinq millimètres comme grandes.

Ensuite, placez les organes sur le modèle de balayage d’organe, qui se trouve à la figure quatre du protocole de texte ci-joint, et utilisez-le pour organiser l’emplacement de chaque organe lors du prochain balayage. Utilisez PBS pour garder les organes humides. Numérisez chaque feuille d’organes à l’aide du système d’imagerie optique des petits animaux et des paramètres précédemment utilisés.

Après le balayage, placez les organes dans du formaldéhyde à 10 % et traitez-les pour l’histologie à l’aide de techniques standard. Afin de réduire la quantité d’autofluorescence dans chaque balayage multispectral, chargez d’abord le fichier spectral in vivo de la protéine fluorescente rouge, puis le fichier rouge in vivo du sol automatique dans la fenêtre des images non mélangées, puis sélectionnez Démélanger. Exportez ensuite les fichiers dot bip dans un format dot tif non mis à l’échelle de 16 bits et chargez-les dans l’image J, en allant dans fichier, en l’ouvrant, puis en sélectionnant le fichier dot tif 16 bits correct.

Ensuite, allez dans le menu de l’image, et sélectionnez ajuster, puis contraste de luminosité, et réglez la valeur minimale affichée sur zéro et la valeur maximale affichée sur plus 35353. Ensuite, sous le menu image, allez dans la recherche de tables, et sélectionnez red hot. Différents modèles d’animaux nécessitent différents niveaux de luminosité, mais il est important de maintenir la luminosité constante tout au long d’une étude donnée.

À l’aide de l’outil de sélection à main levée, dessinez une sélection de région d’intérêt de forme libre autour de chaque organe. La région de forme libre d’intérêt doit être tracée près des limites des organes. Ensuite, tapez control et M pour utiliser l’outil de mesure afin de calculer la surface de chaque organe.

Enregistrez ces données dans une feuille de calcul. Avec la région d’intérêt qui a été dessinée autour de chaque organe, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez dupliquer pour inclure uniquement l’organe. Ensuite, sous l’image, allez dans ajuster, puis seuil, et réglez le niveau de seuil inférieur sur plus 1, 200 et le niveau de seuil supérieur sur plus 1 700.

Vérifiez également l’arrière-plan sombre, puis sélectionnez OK. Cela ne sélectionnera que les régions les plus fluorescentes. Les images peuvent nécessiter une manipulation manuelle des curseurs de seuil dans l’image J afin que les zones précédemment les plus claires soient sélectionnées pour l’étape d’analyse, comme indiqué ci-dessus.

Différents modèles de maladies nécessiteront des contraintes de seuil différentes, mais il est important de maintenir les niveaux de seuil cohérents tout au long d’une étude donnée. Sous Analyser, sélectionnez Analyser les particules et modifiez la taille du pixel au carré de 10 à l’infini. Choisissez d’afficher les contours et cochez l’option Afficher uniquement les résultats, puis cliquez sur OK.

Cela mesurera à la fois les zones et les densités intégrées brutes des régions brillantes considérées comme des tumeurs. Enregistrez les valeurs de la surface et de la densité intégrée brute de chaque sélection de tumeurs dans la même feuille de calcul contenant les surfaces des organes. Ensuite, sous Analyser, sélectionnez Outils et accédez à la barre d’étalonnage.

Ajoutez une barre d’échelle d’étalonnage aux images des organes. Les montages peuvent contenir un nombre plus ou moins grand d’organes selon une étude donnée. Ensuite, sous fichier, allez dans Enregistrer sous, et enregistrez le montage à la fois en tant que point tif et en tant que point jpeg.

Ensuite, ouvrez le fichier point jpeg des organes, et allez dans le menu d’insertion pour ajouter une zone de texte à chaque image. Ajoutez des étiquettes d’orgue en créant une zone de texte sous chacune des trois rangées d’organes. Ouvrez chacun des fichiers de points tif de 16 bits des balayages corporels complets dans l’image J par ordre de numéro de souris.

Ensuite, allez dans le menu de l’image, puis sélectionnez Ajuster, puis Contraste de la luminosité. Définissez la valeur minimale affichée sur zéro et la valeur maximale affichée sur plus 35353. Ensuite, revenez au menu des images et recherchez des tables, puis sélectionnez red hot.

Une fois cette opération terminée, enregistrez le montage sous forme de fichier dot tif et de fichier dot jpeg. La lignée cellulaire murine du cancer de l’ovaire ID8 qui est injectée dans les souris 10 semaines avant l’imagerie devient fluorescente dans le canal rouge et continue de le faire tout au long de la croissance. L’imagerie en direct à l’aide d’un système d’imagerie optique pour petits animaux est capable de visualiser les cellules ID8 en expansion chez la souris et fournit une approche plus précise que le simple pesage de la souris afin d’évaluer la charge tumorale.

Après l’euthanasie et l’ablation de la couche ventrale de la peau, les organes intacts peuvent être visualisés plus en détail. Cependant, les organes individuels placés sur le modèle de numérisation d’organe affichent clairement la charge tumorale dans chaque organe. La charge tumorale dans l’épiploon et le pancréas, les ovaires et le mésentère de la souris montrée à gauche est beaucoup plus importante que ces mêmes organes chez la souris montrée à droite.

L’observation de la charge tumorale différentielle est confirmée quantitativement à la fois en termes de surface de service tumorale et d’intensité du signal tumoral. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour imager jusqu’à 18 souris vivantes par heure. La dissection et l’imagerie ex vivo d’organes individuels prennent environ 20 minutes par échantillon.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme la résonance magnétique quantitative peuvent être effectuées afin de répondre à des hypothèses telles que l’impact de l’obésité sur les métastases du cancer de l’ovaire, comme le montre notre article de recherche sur le cancer de 2015.