Síntesis de nanopartículas de oro liposomas Integrado fotosensible y la medición de su microburbujas cavitación al pulso láser de excitación

El objetivo general de este protocolo es demostrar la síntesis de liposomas sensibles a la luz y revelar el mecanismo para la liberación de fármacos controlados por la luz de estos liposomas. Este método ayuda a responder las preguntas clave en una respuesta de luz figurativa de los liposomas para la administración de fármacos, donde los desafíos clave son sintetizar los liposomas y mejorar el magnesio de liberación controlada. La principal ventaja de esta técnica es la síntesis celular de liposomas sensibles a la luz con los materiales disponibles en el mercado.

La implicación de esta tecnología se extiende hacia la terapia de tejidos superficiales. El uso de procedimientos evasivos mínimos, así como una parte del dispositivo láser, hará que la plataforma tecnológica sea más accesible para los pacientes. Además de proporcionar información sobre el cuidado superior y la administración precisa de medicamentos, nuestro sistema también se puede aplicar a otros sistemas, como el ani-ma-mo-rose pequeño, así como el sistema de moco a través de láseres guiados.

Primero limpie un matraz de fondo redondo de 100 mililitros con Aqua regia. Después de lavar con agua desionizada y esterilizar en autoclave, seque el matraz en un horno de aire caliente a 100 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, envuelva y guarde el matraz estéril hasta su uso.

Esterilice un juego de miniextrusoras de mano con etanol al 70%. A continuación, encienda el evaporador rotativo y ajuste la temperatura del baño de agua caliente y la torre de enfriamiento a 37 y 4 grados centígrados, respectivamente. Prepare una solución madre de calcio de 60 milimolares disolviendo 374 miligramos de calceína y 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato 0,1 milimolar o PBS.

Ajuste el pH a 7.4 usando una solución de hidróxido de sodio mollar. Retire los lípidos del congelador y descongélelos a temperatura ambiente. Una vez descongelados los lípidos se disuelven 15,9 miligramos de DPPC, 1,3 miligramos de MPPC y 2,8 miligramos de DSPE-PEG2000 y dos mililitros de cloroformo.

Después de transferir la solución de cloroformo a un matraz estéril de fondo redondo, evapore el solvente usando el evaporador rotativo a presión reducida para formar una capa delgada de lípidos secos. A continuación, hidratar la capa lipídica a 45 grados centígrados con dos mililitros de solución acuosa que contenga 1,95 mililitros de la solución de calcio de 60 milimolares previamente preparada y 50 microlitros de nanopartículas de oro durante 30 minutos. Precaliente un bloque calefactor a 45 grados centígrados.

Coloque un filtro de membrana de policarbonato de 200 nanómetros entre los soportes de los filtros y ensamble el juego de mini extrusora. A continuación, compruebe si hay posibles fugas con agua desionizada. Llene una de las jeringas con un mililitro de la solución de liposomas previamente preparada y extruya la muestra pasando la solución a través de la jeringa en el otro extremo del mini extrusor ensamblado.

Después de repetir el paso anterior 11 veces, ejecute los liposomas sintetizados a través de una columna de desalinización PD-10 para eliminar las nanopartículas de oro libres, los lípidos y la calceína, utilizando PBS como eluyente de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuando terminen, almacene las muestras en tubos estériles a cuatro grados centígrados. En este punto, calcule la molaridad lipídica de la solución madre sumando las molaridades de DPPC, MPPC y DSPE-PEG2000.

Diluya la solución madre de liposomas a una concentración de lípidos de 5 milimolares utilizando PBS de 0,1 milimolares, luego transfiera las muestras a tubos de centrífuga de 2 mililitros. A continuación, coloque los tubos en un baño de agua caliente y eleve la temperatura gradualmente de 25 a 70 grados centígrados. Recoge 10 alícuotas de microlitros en diferentes puntos de temperatura.

A 10 microlitros de tritón al dos por ciento x-100 a una alícuota de dos mililitros de solución liposomal para digerir los liposomas durante 10 minutos a temperatura ambiente y lograr la liberación completa de calceína. Después de esto, transfiera 200 microlitros de la solución liposomal a cada pocillo en una microplaca de 96 pocillos. Mida la intensidad de fluorescencia de las muestras recogidas utilizando un lector de microplacas de fluorescencia.

Tomando la intensidad de fluorescencia de las muestras tratadas con triton x-100 como liberación del 100 por ciento, calcule el porcentaje de calceína liberada en cada punto de tiempo utilizando la siguiente fórmula:Transfiera 100 microlitros de la solución de liposoma a una cubeta de cuarzo y coloque la cubeta en un soporte para cubetas. Guíe el rayo láser colimado a través de la cubeta de modo que la luz pase a través de la solución Liposme. Luego recoja las alícuotas después de varios pulsos.

A continuación, agregue 10 microlitros de tritón al 2% x-100, a una alícuota de 2 mililitros de solución liposomal para digerir los liposomas durante 10 minutos a temperatura ambiente y lograr la liberación completa de calceína. Para medir previamente el efecto de blanqueo del láser en la solución de calceína, exponga la solución a un láser posterior con una frecuencia de 1 hercio para variar los números de pulso. Mida la intensidad de fluorescencia de la calceína con longitudes de onda de excitación y emisión de 480 y 515 nanómetros respectivamente antes y después de la exposición al láser.

Después de calcular las cantidades de blanqueo, utilice este factor para normalizar los valores obtenidos de las muestras de liposomas multiplicando la intensidad de fluorescencia de los liposomas por el factor. A continuación, mida la intensidad de fluorescencia de la muestra recogida utilizando un lector de microplacas de fluorescencia a longitudes de onda de excitación y emisión de 480 y 515 nanómetros respectivamente. Tomando la intensidad de fluorescencia de las muestras tratadas con tritón x-100 como liberación del 100 por ciento, calcule el porcentaje de la calceína liberada en cada número de pulso.

Coloque 100 microlitros de la muestra en un portaobjetos de microscopio y luego fije el enfoque del láser en la muestra. El láser se guía a través de la muestra manualmente, por lo que es importante asegurarse de que el punto focal del haz esté bien dentro de la muestra y no en el portaobjetos microscópico para evitar experimentos posteriores. Después de esto, sumerja un hidrófono de aguja en la solución.

La punta del hidrófono se introduce en la muestra a una distancia suficiente del punto focal del láser. Esto se hace para evitar cualquier daño inducido por el láser con el hidrófono. Irradie la muestra con el láser de pulso con números de pulso y energía de pulso variables.

Por último, registre las señales de presión con un osciloscopio digital. No se observan diferencias significativas en el porcentaje de liberación para los liposomas con y sin nanopartículas de oro. Los liposomas estaban casi intactos a temperatura fisiológica, con un porcentaje de fuga de menos del 10 por ciento, con o sin nanopartículas de oro.

Cuando la temperatura se incrementó a 42 grados Celsius, entre el 60 y el 80 por ciento de la calceína encapsulada se liberó de los liposomas en dos minutos. Los liposomas con nanopartículas de oro liberaron la calceína encapsulada tras la excitación, en la que la cantidad de calceína liberada aumentó a medida que aumentaba el número de pulsos. Las señales acústicas registradas para las nanopartículas de oro, los liposomas con nanopartículas de oro y los liposomas sin nanopartículas de oro se muestran aquí:El impulso de presión contiene fases positivas y negativas y sugiere que se forman microburbujas y se interrumpen en la solución.

Como era de esperar, la amplitud de la señal acústica aumentó gradualmente con el aumento de la energía del láser y debería deberse a la mayor intensidad de la oscilación de las partículas, atribuida a la posterior expansión y contracción termoelástica. Una vez dominado, la fabricación de liposomas se puede realizar en 3 horas, siempre que toda la cristalería y el equipo se preparen con anticipación. Al intentar la liberación controlada por láser, es importante recordar que el rayo láser se enfoca completamente en la muestra para evitar la pérdida de energía láser.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros experimentos, como la liberación controlada por láser in vitro e in viol, para responder preguntas adicionales, como cómo las condiciones fisiológicas afectarán la liberación controlada por láser. Después de este desarrollo, esta técnica será ingeniosa en el campo de la reactividad para explorar, localizar y controlar la liberación a la piel, los ojos y la membrana mucosa.