Bestimmung der Sehzellen Spektrale Empfindlichkeit in einem Insekt Modell aus

Das übergeordnete Ziel dieser Methode der intrazellulären Ableitung besteht darin, die spektrale Empfindlichkeit einzelner Photorezeptorzellen im zusammengesetzten Auge eines Insekts in vivo zu bestimmen. Mit dieser Methode können wir feststellen, ob die Wellenlängen des Lichts, auf die eine Zelle empfindlich reagiert, durch Filterpigmente beeinflusst werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir anhand der spektralen Empfindlichkeiten einzelner Photorezeptoren vorhersagen können, welchen Farbbereich ein Tier wahrnehmen kann.

Um sich auf die Aufnahme vorzubereiten, schalten Sie die Xenonlampe mindestens 45 Minuten vor dem Experiment ein und schalten Sie den Mikroelektrodenzieher mindestens 30 Minuten vor dem Ziehen der Glaselektroden ein. Schalten Sie danach die gesamte Aufnahmeelektronik ein. Stellen Sie sicher, dass der Verschluss standardmäßig geschlossen ist, sodass kein Licht durch das Glasfaserkabel gelangt.

Danach feine Borosilikatglasmikroelektroden mit dem Mikroelektrodenzieher ziehen. Die Elektroden mit dreimolarer Kaliumchloridlösung rückwärts befüllen. Um die Probe vorzubereiten, unter dem Mikroskop einen einzelnen Schmetterling mit heißem Wachs in einem kleinen Plastikröhrchen befestigen, sodass der Kopf bewegungsunfähig ist und aus einem Ende des Röhrchens hervorragt.

Fixieren Sie dann den Rüssel, die Fühler und die Flügel mit Wachs. Danach drücken Sie das Abdomen mit einem trockenen Wachsstück nach unten. Halten Sie die Röhre feucht, indem Sie ein angefeuchtetes Papiertuch in die Röhre hinter das Abdomen des Exemplars legen.

Stellen Sie sicher, dass das Präparat vollständig bewegungslos ist. Befestigen Sie anschließend das Röhrchen mit einem kleinen Wachsstück auf einer kleinen Plattform mit Kugelgelenk, die an einer magnetischen Basis befestigt ist. Setzen Sie unter einem Stereomikroskop einen Silberdraht über den Mundteil in den Kopf ein, der als Referenzelektrode dient.

Bevor das Experiment beginnt, befestigen Sie den Draht dauerhaft an der Plattform. Schneiden Sie anschließend mit einer Rasierklinge ein kleines Loch in die linke Hornhaut und verschließen Sie es mit Vaseline, um Austrocknung zu verhindern. Sobald die Hornhaut geöffnet ist, führen Sie die Ableitelektrode so schnell wie möglich ins Auge ein, da die Hämolymphe im Auge rasch verhärtet und das Einführen einer Elektrode unmöglich macht.

Führen Sie die Dissektion nach Möglichkeit an dem Gerät durch, an dem auch die Aufzeichnung erfolgen soll. Anschließend verbinden Sie den Masseanschluss der Verstärkereinheit mit der Referenzelektrode auf der Präparatplattform mithilfe der Krokodilklemmen. Befestigen Sie die Elektrode am Elektrodenhalter.

Setzen Sie anschließend den Silberdraht in die Kaliumchloridlösung innerhalb der Mikroelektrode ein. Beleuchten Sie die Probe unter einem Stereomikroskop mit einer Lichtquelle, die mit Schwanenhals-Anschlüssen ausgestattet ist, während Sie die Elektrode in das Auge einführen. Stellen Sie den Elektrodenhalter so ein, dass die Mikroelektrode genau über der zuvor in die Hornhaut geschnittenen Öffnung positioniert ist.

Danach senken Sie die Mikroelektrode mit Hilfe des Mikromanipulators in das Auge ab, bis ein Stromkreis geschlossen wird. Sobald sich die Elektrode im Auge befindet, schwenken Sie das Stereomikroskop aus dem Faradayschen Käfig heraus. Schalten Sie die Lichtquelle, die das Präparat beleuchtet, aus und lassen Sie das Insekt 10 bis 20 Minuten im Dunkeln, um eine Dunkeladaption zu ermöglichen.

Überprüfen Sie den Widerstand der Elektrode, indem Sie einen Nanoampere-Strom anlegen und die Spannungsänderung notieren. Der Widerstand sollte typischerweise zwischen 100 und 250 Megaohm liegen. Aktivieren Sie anschließend den Pulsgeber, um während der gesamten Dauer des Experiments einen Lichtblitz auszulösen, und richten Sie das Glasfaserkabel auf das Auge aus.

Überprüfen Sie das Oszilloskop auf Spannungsänderungen bei jedem Lichtblitz. Eine negative Spannungsänderung bedeutet, dass die Elektrode die Zelle noch nicht erreicht hat. Bewegen Sie das Glasfaserkabel um das Präparat, bis eine maximale Spannungsantwort beobachtet wird.

Um eine depolarisierende Lichtantwort zu erzeugen, bewegen Sie den Mikromanipulator hin und her, wodurch sich die Elektrode geringfügig vertikal bewegt, während Sie leicht auf den Sockel des Elektrodenhalters klopfen oder die „Buzz“-Funktion auf dem Vorverstärker verwenden. Nehmen Sie solange kleine Einstellungen vor, bis eine depolarisierende Lichtantwort auf dem Oszilloskop erscheint. Anschließend justieren Sie den Glasfaserkabel, um das größte depolarisierende Signal zu finden.

Nehmen Sie kleine Einstellungen mit einem Mikromanipulator vor und nutzen Sie bei Bedarf die „Buzz“-Funktion des Verstärkers, um sicherzustellen, dass die Elektrode die Zelle stabil aufzeichnet. Eine stabile Aufzeichnung sollte kaum oder gar keine Änderungen im Ruhepotential aufweisen, ein geringes Hintergrundrauschen aufweisen und eine stets große depolarisierende Antwort zeigen. Es ist entscheidend, eine stabile Aufzeichnung zu haben, bei der das Ruhepotential der Membran nicht verrauscht ist und sich im Zeitverlauf nicht verändert.

Die Antworten sollten groß und positiv sein, ohne Hyperpolarisation. Sobald die Einrichtung stabil ist, öffnen Sie die Software und schließen Sie das Dialogfeld namens „Experiments Gallery“, um ein Popup-Fenster mit vier Kanälen zu öffnen. Stellen Sie die Spannungsskala in der oberen rechten Ecke des Softwarefensters auf 500 Millivolt ein.

Klicken Sie dann unten rechts auf „Start“, um die Aufnahme zu beginnen. Minimieren Sie die Kanäle drei und vier, und stellen Sie die X- und Y-Skala ein. Lassen Sie die Software anschließend für die gesamte Dauer des Experiments laufen.

Bei der Stimulation mit weißem Licht werden bis zu 10 einzelne Antworten aufgezeichnet, wobei das ND-Filterrad auf der höchsten Extinktion (OD) steht, die noch eine Antwort hervorruft. Hier wird die Änderung der Antwort bei 3,0 OD und 2,0 OD gezeigt. Danach werden die gleiche Anzahl von Antworten von 3,5 bis 0,0 OD in jeder Kombination aufgezeichnet, um eine Antwort-Log-Intensitätskurve zu erstellen. Bevor die Antwort der Zelle auf alle Wellenlängen mithilfe der Interferenzfilter aufgezeichnet wird, bestimmt man zunächst schnell die Spitzenwellenlänge.

Ohne ND-Filter im Lichtweg setzen Sie einen UV-durchlässigen Filter ein und beobachten kurz die Amplitude der Antwort. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem blau-durchlässigen, einem grün-durchlässigen und einem rot-durchlässigen Filter, um eine Vorstellung davon zu erhalten, bei welcher Wellenlänge die maximale Antwort liegt. Notieren Sie die Aufzeichnung unter der Filterwellenlänge, die die maximale Antwort liefert, bevor Sie zu einem anderen Interferenzfilter wechseln.

Zwischen den Aufnahmen mit nachfolgenden Filtern sollte die Zelle auf ein bis zwei Blitze mit weißem Licht ohne Filter im Lichtweg reagieren, um zu überwachen, ob die Spitzenantwort im Laufe der Zeit abnimmt. Danach Aufnahmen mit anderen Interferenzfiltern durchführen und bis zu 10 Antworten pro Filter zulassen. Dies ist ein Beispiel für eine große negative Spannungsänderung, die unmittelbar vor dem Eindringen in eine Zelle beobachtet wird.

Hier ist eine saubere Aufnahme gezeigt, die wenig Hintergrundrauschen aufweist und eine große depolarisierende Antwort, typischerweise von mindestens 40 Millivolt. Und hier ist ein Beispiel einer schlechten Aufnahme, bedingt durch die negative Potentialänderung nach dem Hauptpeak. Dies ist ein weiteres Beispiel einer schlechten Aufnahme.

Das Ruhepotential zeigt starke Schwankungen, und die hohe Menge an Hintergrundrauschen kann die Amplitude der Antwort verdecken. Dies ist ein repräsentatives Beispiel für die spektrale Empfindlichkeit, abgeleitet aus einer einzelnen Ableitung. Die Zelltypen werden anhand der maximalen Empfindlichkeit bei einer ähnlichen Wellenlänge sowie der Gesamtform des Empfindlichkeitsspektrums klassifiziert.

Die gleichen Zelltypen werden anschließend gemittelt, und die mittlere Empfindlichkeit wird mit Standardfehlerbalken bei jeder Wellenlänge dargestellt. Dieses Diagramm zeigt die spektralen Empfindlichkeiten von drei typischen Zelltypen, die bei einem Insekt vorkommen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in etwa zwei Stunden durchgeführt werden.

Mit dieser Methode können Verhaltensexperimente durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob alle Typen von Photorezeptorzellen zur Farbdiskriminierung beitragen oder nicht.