Elaboração e análise de In Vitro Três mama Dimensional Carcinoma Surrogates

O objetivo geral deste conjunto de procedimentos é gerar culturas de células tridimensionais para funcionar como substitutos de câncer de mama in vitro e apresentar um método para medir o crescimento celular em seções histológicas dos substitutos. A cultura de células tridimensional é um método fisiologicamente mais relevante de modelar o comportamento celular in vitro do que a cultura de células bidimensional. Ao alterar a composição celular em condições experimentais, esse conjunto de procedimentos pode ser adaptado para abordar uma variedade de questões biológicas e avaliar a eficácia de terapias candidatas.

Para incorporar as células na ECM, no gelo, adicione as células e os quatro primeiros componentes relacionados listados na tabela um do manuscrito anexo, em um tubo de microcentrífuga de dois milímetros. Em seguida, misture-os delicadamente pipetando e evite formar bolhas. Monitore o nível de pH usando o vermelho de fenol no 10XD MEM para garantir que a mistura mostre uma cor laranja-rosa, indicando um pH de sete.

Se a mistura parecer amarela e o pH estiver muito baixo, adicione lentamente 7,5% de bicarbonato de sódio, uma gota de cada vez, até que a cor apropriada seja alcançada. Lembre-se de manter a mistura no gelo e trabalhe rapidamente para evitar a polimerização prematura do ECM. Para culturas 3D sólidas, mantenha a lâmina da câmara no gelo para evitar a polimerização prematura da ECM.

Pipete lentamente 100 microlitros da mistura de ECM de células em cada poço da lâmina da câmara de oito poços e pipete a mistura de ECM de células ao redor das bordas do poço para ajudar a distribuir melhor a mistura. Em seguida, incube os substitutos a 37 graus Celsius, cinco por cento de CO2, por 45 minutos para permitir a polimerização do ECM. Após quarenta e cinco minutos, adicione 100 microlitros do meio de cultura a cada poço e incube a 37 graus Celsius e cinco por cento de CO2 durante o experimento.

Troque o meio de cultura a cada dois dias. Uma limitação da cultura 3D é que a difusão de oxigênio e nutrientes no volume pode ser inadequada para suportar a viabilidade celular. A adição de um sistema de biorreator pode ajudar a superar essa limitação e aumentar o crescimento.

Para profusar culturas 3D em um sistema de biorreator, prepare e monte a parte do sistema de biorreator que abriga os substitutos. Em uma coifa de cultura de células, usando uma seringa com uma agulha de calibre 26, injete a mistura de ECM de células na área do biorreator de perfusão projetado para conter células e prossiga rapidamente para a próxima etapa. Para garantir uma distribuição mais uniforme das células dentro dos substitutos, coloque o componente do biorreator que abriga os substitutos em um tubo cônico de 50 mililitros.

Gire continuamente os substitutos a 18 rpm enquanto incuba a 37 graus Celsius em um forno de hibridização in situ ou em uma incubadora por 45 minutos para permitir a polimerização do ECM. Após a polimerização e a adição do meio, conecte o conjunto do biorreator à bomba. Comece a perfusão média em uma incubadora a 37 graus Celsius, cinco por cento de CO2.

Continuar a perfusão do meio durante a experiência e alterar o meio de cultura conforme necessário para a concepção experimental específica. No final do experimento, envolva os substitutos em gel de processamento de amostras para mantê-los intactos durante o processamento e facilitar o corte histológico. Para fazer isso, derreta o gel de processamento de amostras em banho-maria a 60 graus Celsius até a hora de usar.

Em seguida, pipete aproximadamente 300 microlitros de gel de processamento de amostras no fundo de um criomolde rotulado. Usando uma lâmina de bisturi e uma pinça, remova cuidadosamente um substituto do biorreator ou do poço de uma lâmina de câmara de oito poços e coloque-o nos criomoldes contendo gel de processamento de amostras. Pipetar aproximadamente 300 microlitros de gel de processamento de amostras para cobrir o substituto no criomolde.

Em seguida, incube-o a quatro graus Celsius por 30 minutos. Assim que o gel de processamento da amostra solidificar, remova o gel de processamento da amostra contendo o substituto do criomoldor e coloque-o em um de tecido. Se mais de um substituto for colocado no mesmo de tecido, corantes de marcação de tecido podem ser usados para distinguir amostras após fixação e processamento.

Em seguida, coloque o de tecido contendo a barriga de aluguel em uma fórmula tamponada neutra de dez por cento por dez a doze horas em temperatura ambiente para permitir a fixação completa. Após a fixação, transfira o de tecido contendo o substituto para etanol a 70%. O substituto fixo está agora pronto para processamento em parafina e subsequente seccionamento histológico.

Para medir a densidade celular e as imagens fotomicroscópicas das seções coradas com H e E, abra um arquivo de imagem do substituto. Usando a ferramenta Polígono no ImageJ e as bordas do ECM como guia, contorne a área do substituto arrastando o mouse e clicando para criar pontos de ancoragem. Depois de delineado, selecione Medir na guia Analisar.

Em seguida, carregue os arquivos de imagem usados para medir a área substituta no Cell Profiler arrastando os arquivos de imagem para a lista de arquivos. Em seguida, atribua um nome a cada imagem importada no módulo Importação de nomes e tipos e selecione o tipo de imagem. Depois que o pipeline de análise for gerado, inicie o Modo de Teste e clique em Executar no Cell Profiler.

E avalie objetos filtrados para garantir que a maioria dos núcleos na imagem de teste seja identificada adequadamente e os parâmetros ideais sejam escolhidos para identificar as células. Os núcleos incluídos serão circulados em verde. Em seguida, salve o projeto, saia do modo de teste e clique em Analisar imagens.

Aqui é mostrada uma imagem representativa da seção corada de H e E de um substituto perfundido cultivado por sete dias. E esta é uma imagem representativa da seção corada H e E de um substituto sólido cultivado por sete dias com o meio trocado a cada dois dias. A celularidade é muito menor nos substitutos sólidos.

Este gráfico mostra a comparação do número médio de células nucleadas por área após sete dias de crescimento. Um substituto perfundido e sólido. Esses dados numéricos apóiam a celularidade nas micrografias fotográficas das seções coradas com H e E.

E este gráfico mostra a comparação do índice de marcação Ki-67, que é a medida da proliferação celular após sete dias de crescimento de substitutos perfundidos e sólidos. Esses dados novamente apóiam um maior crescimento de substitutos perfundidos. Após este procedimento, outros métodos, como hibridização in situ e amino-histoquímica, podem ser realizados em seções histológicas dos substitutos para responder a perguntas como expressão de RNA e proteína.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e processar substitutos de tecido tridimensionais in vitro e realizar análises substitutas em seções histológicas coradas com H e E.