Analyse van de Brain Mitochondriën gebruik van Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Het algemene doel van de techniek van seriële block-face scanning elektronenmicroscopie is het analyseren van de morfologie, structuur, distributie, het volume en het aantal mitochondriën in een gedefinieerd gebied van het muizenbrein. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van veel kernvragen in de neurobiologie, zoals de vraag of veranderingen in de structuur, het aantal en de distributie van mitochondriën in de hersenen wezenlijk bijdragen aan neurodegeneratieve en neuro-ontwikkelingsstoornissen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het proces van het beelden van seriële coupes wordt geautomatiseerd door een op maat gemaakte ultramicrotoom te integreren in de kamer van de laagvacuüm scanning elektronenmicroscoop.

Om het experiment te starten, wast u de eerder bereide met glutaraldehyde gefixeerde weefsels drie keer gedurende vijf minuten in 0,1 molar cacodylaatbuffer. Fixeer de weefsels vervolgens met 1 milliliter cacodylaatgebufferde 0,1% tanninezuur gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de weefsels na de nacfixatie in cacodylaatbuffer.

Los 0,3 gram kaliumferrocyanide en 0,86 gram natriumcacodylaat op in 10 milliliter gedestilleerd water. Voeg vlak voor gebruik 10 milliliter 4%osmiumtetroxide toe en kleur de weefsels gedurende 90 minuten op ijs met een 2%osmiumferrocyanide-oplossing. Was het weefsel na het kleuren met gedestilleerd water.

Behandel de monsters gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met vers bereide 1% thiocarbohydrazide- of TCH-oplossing. Was vervolgens de monsters. Kleur daarna de weefsels gedurende één uur met 2% waterige osmiumtetroxide.

Was de weefsels na het kleuren met gedestilleerd water. Incubeer de monsters gedurende de nacht in 1% uranylacetate in gedestilleerd water bij 4 °C. Spoel de weefsels de volgende dag af met gedestilleerd water en incubeer ze in een oven met Welton's lead aspartate-kleuring.

Het verkrijgen van de best mogelijke kleuringen van weefsels is cruciaal voor beeldvorming, aangezien een slechte kleuring leidt tot een opladingsfenomeen op het monster dat beeldvorming bemoeilijkt of onmogelijk maakt. Was het weefsel in gedestilleerd water. Dehydrateer de monsters via een oplopende reeks alcoholen met behulp van gekoelde ethanoloplossingen gedurende telkens vijf minuten, gevolgd door drie dehydraties met 100% ethanol van telkens 10 minuten.

Was de monsters twee keer gedurende 15 minuten in propyleenoxide. Plaats de weefsels in een 1:1 mengsel van inbeddingshars en propyleenoxide, sluit het flaconnetje en incubeer de weefsels een nacht. Verwijder na twee uur de dop van het flaconnetje zodat het propyleenoxide gedurende de periode van negen uur kan verdampen.

Breng de weefsels gedurende twee uur over naar 100% verse inbeddingshars in schone vials. Bed de monsters in verse inbeddingshars in platte vormen met geprinte papieren labels en hard ze uit in een oven. Controleer na één uur de plaatsing en uitlijning van het weefsel en pas dit indien nodig aan.

Trim de monsters tot het gebied van belang en monteer ze op een aluminium pin met gellende cyanoacrylaat superlijm. Bedek vervolgens het monster rond de zijkanten van het blok met colloïdaal zilverpasta om een geleidend pad naar de aluminium pin te creëren. Onderzoek de weefselmonsters met een scanning elektronenmicroscoopsysteem dat is uitgerust met een ultramicrotoom-tafel in de kamer en een detector voor terugverstrooide elektronen met een laag kilovolt.

Neem beelden van de monsters met deze instellingen. Begin de analyse door Image, Type en vervolgens 8-bit te selecteren om de beelden om te zetten van het oorspronkelijke propriëtaire 16-bit formaat naar het 8-bit TIFF-formaat. Als de automatische conversie van contrast en/of helderheid tijdens deze stap niet ideaal is voor de beelden, open dan de 16-bit beelden opnieuw en selecteer Image, Adjust, Brightness/Contrast.

Selecteer een bereik dat voor alle afbeeldingen werkt en druk op Apply. Voer vervolgens de conversie uit. Als er een onaanvaardbare beweging van de afbeelding tussen de coupes was, lijn dan de afbeeldingsstacks uit door Plugins, Registration en Linear Stack Alignment with SIFT te selecteren en stel de uitlijning in op de modus translation-only in plaats van rigid body.

Vergroot de canvasgrootte vóór de registratie door Afbeelding, Aanpassen, Canvasgrootte te selecteren. Alternatief kan de afbeelding worden beperkt tot een gebied van belang door de gewenste regio te selecteren en deze vervolgens bij te snijden. Schaal afbeeldingen indien nodig naar een kleiner, beter beheersbaar formaat met ImageJ door Afbeelding en Schalen te selecteren.

Confocale microscopie op neuronale culturen met lage dichtheid toonde aan dat mitochondria in het neuronale soma een reticulair netwerk vormen, terwijl mitochondria in distale neurieten een discrete, verlengde morfologie vertonen. Met behulp van de serial block-face scanning electron microscopy, of SBFSEM-techniek, werden de mitochondria, dendrieten en axonale varicositeiten in de muizenhersenen duidelijk waargenomen. Driedimensionale reconstructies van mitochondria in de neurieten van muizenhersenweefsel toonden een verschil in grootte aan tussen dendritische en axonale mitochondria.

Gegevens geëxtraheerd uit een representatieve 2-D SBFSEM-afbeelding onthulden dat het volume of de grootte van mitochondriën in de neuronale presynapsen significant kleiner was dan die in de extrasynaptische regio. De afbeeldingen verkregen via SBFSEM-analyse bieden een verhoogde resolutie om de ultrastructurele kenmerken van individuele mitochondriën te visualiseren. Het is mogelijk om het cellulaire compartiment van mitochondriën te classificeren door de nabijheid tot gemakkelijk identificeerbare structuren te bepalen, zoals niet-synaptische somatische mitochondriën en presynaptische mitochondriën.

Deze techniek kan in ongeveer zeven dagen worden uitgevoerd, wat drie dagen kleuren, twee dagen uitharden van de hars, één dag beeldvorming om een stack te produceren die geschikt is voor deze analyse, en ongeveer twee tot vier uur nabewerking van beelden ter voorbereiding op de analyse omvat. Deze procedure kan ook worden gebruikt in combinatie met andere methoden voor de beeldvorming van mitochondria, zoals live imaging met genetisch gelabelde mitochondria, om vragen te beantwoorden over mitochondriaal transport en de dynamiek van hun deling en fusie.