Chirurgische Ansatz für Arteria cerebri media Occlusion und Reperfusion fokaler zerebraler Ischämie bei Mäusen

Das übergeordnete Ziel der Longa-Methode ist es, die Ischämie an der Wurzel der mittleren Hirnarterie (MCA) zu reproduzieren, da ischämische Schlaganfälle beim Menschen am häufigsten aufgrund des Verschlusses der MCA auftreten. Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen im Schlaganfallbereich zu beantworten, z. B. wie man ein geeignetes therapeutisches Ziel für die Behandlung dieser Krankheit findet. Der Hauptvorteil der Longa-Methode gegenüber alternativen Techniken ist die Überlebensrate.

Bei dieser Technik kommt es auch zu einer Zunahme der Interaktionen zwischen Leukozyten und Endothelzellen und des Infarktvolumens. Dieses Verfahren wird von Shantel Vital, dem Leiter meines Labors, demonstriert. Überwachen Sie nach der Einleitung der Anästhesie bei einer männlichen C57 Black Six-Maus gemäß dem Textprotokoll die Anästhesietiefe durch ein Kneifen des Fußes und tragen Sie eine sterile Augensalbe auf, um Trockenheit zu verhindern.

Rasieren Sie dann den Hals des Tieres. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine temperaturregulierte Matte und führen Sie eine Rektalsonde ein, um eine Körpertemperatur von 36,5 plus oder minus 0,1 Grad Celsius zu überwachen und aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie dann 70%igen Ethylalkohol, um die Haut zu desinfizieren.

Machen Sie dann mit einer geraden Irisschere einen Schnitt in der Mittellinie und ziehen Sie die Weichteile zurück, um die Gefäße freizulegen. Präparieren Sie mit einer Dumont-Pinzette die Arteria carotis communis (CCA) und die Arteria carotis externa (ECA) vom umgebenden Gewebe, ohne den Vagusnerv zu beschädigen. Machen Sie mit 7-0 Seide eine provisorische Naht, indem Sie einen losen Knoten um den CCA binden.

Machen Sie dann eine dauerhafte Naht um die ECA und die kleineren Gefäße, die von ihr ausgehen, indem Sie die Gefäße fest ligieren. Machen Sie nun eine Naht um den ECA proximal zur CCA-Bifurkation. Platzieren Sie dann einen Mikrogefäßclip um die Arteria carotis interna (ICA) und die Arteria pterygopalatinin (PPA).

Setzen Sie mit einer mikrodisparierenden Federschere einen kleinen Schnitt in der ECA so nah wie möglich an der bleibenden Naht und führen Sie ein 180 Mikrometer großes, silikonbestücktes Monofilament ein. Wenn das Filament eingesetzt ist, ziehen Sie die provisorische Naht um den ECA fest und entfernen Sie den Mikrogefäßclip. Schneiden Sie mit der Mikrodisparierfederschere die ECA zwischen der permanenten distalen Naht und dem Eintrittspunkt des Filaments ab.

Führen Sie das Filament durch den ICA, bis ein Widerstand im MCA zu spüren ist. Weitere Informationen finden Sie im Textprotokoll. Entfernen Sie nach einer 30-minütigen Okklusionsphase das Filament, indem Sie es mit einer Dumont-Pinzette vorsichtig zurückziehen und die Naht um das offene Ende der ECA sichern.

Entfernen Sie die provisorische Naht um die CCA, indem Sie die Ligatur vorsichtig lösen, damit der Blutfluss durch die CCA wieder aufgenommen werden kann. Entfernen Sie die Retraktoren und verwenden Sie dann eine durchgehende chirurgische Naht, um den Schnitt zu schließen. Injizieren Sie der Maus einen Milliliter Kochsalzlösung subkutan zur Volumenauffüllung und das Analgetikum Carprofen zur Linderung von Schmerzen und Beschwerden nach dem chirurgischen Eingriff.

Beobachten Sie die Maus während der Genesung von der Narkose in einem speziellen Käfig, der auf 30 Grad Celsius beheizt wurde, und legen Sie das pürierte Futter in einer Petrischale auf den Boden des Käfigs, um das Fressen zu fördern. Unter Verwendung eines 18-Punkte-Bewertungssystems werden Mäuse nach der entsprechenden Reperfusionsphase neurologisch bewertet, wobei die allgemeinen, motorischen, sensorischen und Propriozeptionswerte bewertet werden. Ein höherer neurologischer Score entspricht einer verminderten neurologischen Funktion.

Um das Volumen des Kleieinfarkts zu messen, bringen Sie die Maus nach Einleitung der Anästhesie und Überwachung der Tiefe gemäß dem Textprotokoll in Rückenlage und schneiden Sie mit einer geraden Irisschere die Haut vom Bauch bis zum Hals, bevor Sie das Peritoneum durchschneiden. Heben Sie mit einer Dumont-Pinzette das Brustbein an und schneiden Sie die Rippen auf. Verwenden Sie dann zwei Paar Hämostaten, um die linke und rechte Seite der Brust zu öffnen und das Herz freizulegen.

Führen Sie eine 26-Gauge-Nadel, die an einer Fünf-Millimeter-Spritze befestigt ist, in den linken Ventrikel ein und schneiden Sie den rechten Vorhof. Perfusionieren Sie dann das Herz mit normaler Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur, bis die Flüssigkeit klar wird. Entfernen Sie mit der geraden Irisschere und -zange den Kopf des Tieres und entfernen Sie vorsichtig das Gehirn aus dem Schädel.

Schneide dann mit einer Rasierklinge den Riechkolben und das Kleinhirn ab, so dass das Gehirn in die Matrix passt. Nachdem Sie die Matrix abgekühlt haben, legen Sie das Gehirn hinein und legen Sie es auf Eis. Machen Sie dann mit einer Rasierklinge einen ersten Schnitt im Gehirn zwei Millimeter von der Spitze entfernt und lassen Sie die Klinge an Ort und Stelle.

Machen Sie mit einer zweiten Rasierklinge einen weiteren zwei Millimeter langen Schnitt hinter der ersten. Entferne dann die erste Rasierklinge mit dem daran befestigten Taschentuch. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte Gewebe in Scheiben geschnitten ist.

Legen Sie jedes Segment in der Reihenfolge, in der es geschnitten wurde, in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die 2 %zwei, drei, fünf Triphenyltetrazoliumchlorid oder TTC enthält, und legen Sie die Platte 20 Minuten lang in ein flaches Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Nach 10 Minuten Inkubation die Scheiben umdrehen. Geben Sie dann eine kleine Menge 10 % Formalin in die Vertiefungen einer neuen 24-Well-Platte und übertragen Sie die Segmente in der Reihenfolge, in der sie geschnitten wurden, in die Vertiefungen mit Formalin.

Nachdem Sie die Segmente in den Computer eingescannt haben, verwenden Sie die Analysesoftware ImageJ, um die Infarktgröße als Prozentsatz des gesamten Hirnschnitts zu analysieren, indem Sie den Infarktbereich umreißen und eine Flächenmessung erstellen. Messen Sie anschließend die gesamte kontralaterale Hemisphäre, um die Fläche zu bestimmen. Zum Schluss dividieren Sie die Infarktfläche durch die Fläche der kontralateralen Hemisphäre und multiplizieren sie mit 100, um das Infarktvolumen zu bestimmen.

Wie hier gezeigt, wurde die Laser-Doppler-Flowmetrie verwendet, um die Blutflussperfusion im MCA-Gebiet vor und nach der MCA-Reperfusion zu bestätigen. Wenn die temporäre CCA-Bindung nach 30 Minuten Ischämie gelöst wird, damit die Filamententfernung und die Reperfusion stattfinden können, kommt es zu einem Perfusionsanstieg, der fünf Minuten nach der Reperfusion knapp 100 % der Ausgangsperfusion erreicht. In dieser Tabelle sind die neurologischen Scores aufgeführt, die sich auf die Beurteilung allgemeiner, sensorischer, motorischer und propriozeptiver Defizite beziehen.

Diese Grafik zeigt, dass der Score für 27 Mäuse nach 24 Stunden 12,56 plus oder minus 0,7 betrug und eine Woche später mit 11,50 plus oder minus 1,5 hoch blieb. Ein höherer neurologischer Score steht für eine verminderte neurologische Funktion. Die Infarktvolumina zeigten ähnliche Muster wie der neurologische Score nach 24 Stunden.

Wie hier vorgestellt, hatten Mäuse 24 Stunden nach MCAo große Infarktvolumina, die eine Woche nach dem Schlaganfall erhöht waren. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von 15 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, die Temperatur bei 36,5 Grad Celsius zu halten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können auch andere Methoden wie Zölligatur und Punktion durchgeführt werden. So können wir weitere Fragen beantworten, wie z.B. die Auswirkungen einer Sepsis vor und nach einem Schlaganfall. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Ischämie auslösen können, indem Sie ein Monofilament in die mittlere Hirnarterie einführen und entfernen, um eine Reperfusion zu ermöglichen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Instrumenten wie Iris, Schere und Pinzette gefährlich sein kann und immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.