Die Induktion von ischämischem Schlaganfall und Ischämie-Reperfusion bei Mäusen die Mittel Artery Occlusion Technik und Visualisierung von Infarktbereich verwenden

Das übergeordnete Ziel dieses chirurgischen Eingriffs ist es, offiziell und zuverlässig einen ischämischen Schlaganfall zu induzieren, während die äußere Hirnarterie intakt bleibt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Schlaganfallforschung zu beantworten, wie z.B. den Einfluss der Behandlung auf die Schwere des Schlaganfalls. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass nach der Schlaganfallinduktion die äußere Hirnarterie zur Verfügung steht, um die Behandlung direkt in die betroffene Hemisphäre zu infundieren.

Legen Sie eine mit Isofluran betäubte Maus auf die vorbereitete Operationsoberfläche und setzen Sie einen Nasenkonus ein, um Isofluran gemischt mit Sauerstoff zu verabreichen. Stellen Sie sicher, dass die Atemfrequenz etwa ein bis zwei Atemzüge pro Sekunde beträgt, ohne nach Luft zu schnappen. Stellen Sie außerdem sicher, dass das Tier keine Reaktion auf die Stimulation der Schnurrhaare oder den Pedalreflex zeigt.

Geben Sie einen Tropfen Gleitmittel auf jedes Auge und verwenden Sie einen sterilen Tupfer, um zu verhindern, dass es während des Eingriffs austrocknet. Desinfizieren Sie den Operationsbereich nach der Rasur gründlich mit 70%igem Ethanol und einer Lösung auf Chlorhexidinbasis. Halten Sie das Tier auf einer warmen Operationsfläche unter einem Stereomikroskop.

Führen Sie anschließend mit einer chirurgischen Schere und Pinzette einen flachen Mittellinienschnitt im Hals von oberhalb des Brustbeins bis unter den Kiefer durch. Trennen Sie mit einer Pinzette vorsichtig Fett- und Bindegewebe, um die Luftröhre freizulegen. Das Gewebe sollte sich leicht und natürlich zu beiden Seiten trennen.

Legen Sie dann ein Kissen oder einen anderen runden Gegenstand mit einem Durchmesser von etwa 0,5 Zentimetern unter den Nacken, um den Nacken zu verlängern und den Bereich für die Operation weiter freizulegen. Öffnen Sie den Schnitt entweder mit einem Geweberetraktor oder mit Haken. Zupfen Sie dann auf der linken Seite der Luftröhre das Bindegewebe vorsichtig auseinander, um die linke Halsschlagader freizulegen, ohne die benachbarten Nerven und großen Venen zu beschädigen.

Führen Sie dann die gebogene Pinzette unter die CCA ein, um das Bindegewebe zu durchstechen, und lassen Sie sie dann langsam öffnen, um die CCA freizugeben. Löse das CCA vom darunter liegenden Gewebe und lege die obere Verzweigung der Arteria cerebrale interna und der Arteria cerebral externa frei. Sobald das CCA freigelegt ist, führen Sie drei Segmente der Nylonnaht unter das CCA ein.

Achten Sie darauf, dass der CCA nicht verdreht ist, da dies das Einsetzen der Naht drastisch erschweren würde. Schließen Sie dann an der tiefstmöglichen Stelle die untere Naht mit einem dauerhaften Knoten. Binden Sie die obere Naht mit einem abnehmbaren Schlupfknoten direkt unter der Verzweigung des ICA und ECA.

Binden Sie als Nächstes die mittlere Naht mit einem abnehmbaren Schlupfknoten zusammen, aber halten Sie ihn weit offen. Erzeugen Sie dann mit einer Mikrodissektionsfederschere einen Abstand von 0,2 Millimetern in der CCA zwischen der unteren und mittleren Naht, die näher an der unteren Naht liegt. Führen Sie das MCAO-Nahtmaterial mit einer Pinzette in den CCA-Schnitt ein und führen Sie es zur oberen Naht.

Ziehen Sie dann den Schlupfknoten der mittleren Naht vorsichtig auf dem CCA fest, so dass er den Blutfluss um die MCAO-Naht einschränkt, aber locker genug ist, damit sich die MCAO-Naht frei bewegen kann. Löse nun vorsichtig die obere Naht und achte darauf, dass die MCAO-Naht nicht herausrutscht. Führen Sie das MCAO-Nahtmaterial einige Millimeter in den ICA ein und verschließen Sie dann die obere Naht wie zuvor wieder mit einem Schlupfknoten.

Führen Sie als Nächstes die MCAO-Naht in den Okklusionsbereich, indem Sie sie zuerst an der ECA vorbei in die ICA führen und dann sicherstellen, dass die Naht in der ICA verbleibt und die Arteria pterygopalatina umgeht. Die Insertion ist erfolgreich, wenn es zu einem geringen Blutrückfluss aus dem CCA-Schnitt kommt und wenn sich die silberne Neun-Millimeter-Markierung zwischen dem CCA-Schnitt und der Bifurkation von ICA und ECA befindet. Nach erfolgreicher Okklusion binden Sie die mittlere und obere Naht fest zusammen und stecken Sie die Nähte in den Schnittbereich.

Nachdem Sie den Retraktor oder die Gewebehaken und das Kissen entfernt haben, reinigen Sie den Nahtbereich mit steriler Kochsalzlösung auf einem Wattestäbchen. Dann verschließen Sie die Haut mit einer Nylonnaht. Platzieren Sie die Maus in einem sauberen Käfig auf einem beheizten Pad, um Unterkühlung zu verhindern und ad libitum Zugang zu Wasser und weichem Futter zu ermöglichen.

Überwachen Sie das Tier mindestens fünf bis 10 Minuten lang auf Anzeichen eines Schlaganfalls. Lassen Sie die MCAO-Naht je nach Ischämie-Reperfusionsprotokoll zwischen 30 Minuten und 120 Minuten oder länger an Ort und Stelle. Nachdem Sie das Tier wie zuvor betäubt und die wundenschließenden Nähte entfernt haben, verwenden Sie eine Pinzette und Gewebeseparatoren, um den Schnitt wieder zu öffnen und das CCA freizulegen.

Entfernen Sie dann vorsichtig die obere Naht und ziehen Sie vorsichtig an der MCAO-Naht, bis sich der silikonbeschichtete Teil am Mittelknoten befindet. Wiederholen Sie die obere Knotennaht, um zu verhindern, dass Blut durch die MCAO-Naht fließt. Löse dann vorsichtig den mittleren Knoten und ziehe das MCAO-Naht am oberen Knoten vorbei, wobei du es im CCA behältst.

Schließen Sie den oberen Knoten fest, um den Blutfluss der Arterien zu blockieren. Ziehen Sie als nächstes die MCAO-Naht vollständig heraus und schließen Sie den mittleren Knoten fest. Verschließen Sie die Wunde und führen Sie die postoperative Pflege wie bisher durch.

Dieses Schema zeigt den Okklusionsbereich, der sich aus dem in diesem Video demonstrierten Eingriff ergibt, in blau. Der Operationsbereich befindet sich am unteren Rand der Abbildung, was durch die ovale Form gekennzeichnet ist, und die Nahtplatzierung ist durch schwarze Linien gekennzeichnet. Die folgenden Bilder zeigen den TTC-Stand von Hirnschnitten.

Dieses Bild zeigt die typische Färbung nach einer Schein-Insertion. Das Bild ist repräsentativ für die Gewebeschädigung, die durch eine 60-minütige MCAO verursacht wird, gefolgt von einer 90-minütigen Reperfusion. Eine größere Gewebeschädigung wird nach 24-stündiger Reperfusion nach einer 60-minütigen MCAO beobachtet.

Die Immunfluoreszenzfärbung für den neuronalen Marker MAP2 ermöglicht es, den neuronalen Verlust ab 60 Minuten Okklusion, gefolgt von 23 Stunden Reperfusion, im Bild rechts deutlich sichtbar zu machen. Die Astrogliose ist nach Immunfluoreszenzfärbung mit GFAP sichtbar. Im Bild rechts sind die Astroglia in dem Bereich konzentriert, der an die Gewebeschädigung im Ischämie-Reperfusionsgehirn angrenzt, während bei der schamoperierten Kontrolle ein diffuses Färbungsmuster zu sehen ist.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, das Wohlbefinden der Tiere und die Okklusionszeit zu überwachen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Techniken wie die Analyse des seltsamen Verhaltens und die Immunfluoreszenz durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Gewebeverletzung und -genesung zu beantworten.