Name: Une approche efficace et Facile pour la production de micelles réversible Disulfure réticulés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Apprenez à synthétiser des micelles réticulées par ponts disulfure chargées en médicaments pour la libération ciblée dans les tumeurs. Cette méthode par oxydation au peroxyde d'hydrogène permet une production à grande échelle.

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Les auteurs remercient Mme Alisha Knudson pour l’aide rédactionnelle. Ils tiennent également à souligner le soutien financier du NIH/NCI (3R01CA115483, à K.S.L.), du DoD PRMRP Award (W81XWH-13-1-0490, à K.S.L.), du NIH/NCI (1R01CA199668, à Y.L.) et du NIH/NICHD (1R01HD086195, à Y.L.).

déclaration éthique: Femme souris nude athymiques (souche Nu / Nu), 6-8 semaines, ont été achetés et conservés dans des conditions exemptes d&#39;agents pathogènes selon les directives AAALAC et ont été autorisés à s&#39;acclimater pendant au moins 4 jours avant toute expérience. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives institutionnelles et conformément au protocole n ° 07-13119 et n ° 09-15584, approuvé par l&#39;utilisation des animaux et le Comité consultatif d&#39;administration de soins à l&#39;Université de Californie, Davis. 1. Synthèse de TD PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 <ol><li> Dans un ballon à fond rond, dissoudre MeO-PEG 5K NH2 (2 g, 0,4 mmol) dans 10-20 ml de diméthylformamide anhydre (DMF) et de froid sur la glace. </li><li> Dans un récipient en verre, dissoudre 3 équiv. de 1-hydroxy-6-chloro-benzotriazole (HOBt), 3 équiv. de N, N &#39;-diisopropylcarbodiimide (DIC) et 3 équiv. de (Fmoc) 2 Lys-OH anhydre DMF (10-15 ml). Agiter pendant 15-20 min sur une plaque d&#39;agitation magnétique. </li><li> Ajouter le mélange dans le ballon de réaction contenant le MeO-PEG 5K -NH 2. Retirer le bain de glace et on agite le mélange réactionnel pendant une nuit à température ambiante. </li><li> Confirmer l&#39;achèvement de la réaction par chromatographie sur couche mince (CCM) 16 et le test de Kaiser 17 (une couleur jaune indique l&#39;absence de NH2 libre). Précipiter le produit polymère 1 (MeO-PEG 5 K Lys (Fmoc NH-2)) par addition d&#39; environ 200 ml d&#39;éther refroidi à la glace dans le ballon de réaction. Séparer le polymère précipité par centrifugation (6 min à 6000 x g et 4 ° C). <ol><li> Pour effectuer TLC, repérer les échantillons sur des plaques de CCM de gel de silice revêtues. En utilisant du dichlorométhane / méthanol (9: 1) comme phase mobile. Observer les taches sous une lampe UV après avoir développé les plaques de CCM. On peut également utiliser ninhydrine réactif de coloration pour visualiser les taches amine sur une plaque chauffante. </li><li> Pour KaiLe test de ser, placez un peu de l&#39;échantillon dans le tube de verre contenant le réactif de Kaiser. Faire chauffer à 100 ° C pendant 5 minutes et recherchez le changement de couleur (si la couleur de la solution reste jaune, puis la réaction est terminée). </li></ol></li><li> Re-dissoudre le produit dans du DMF anhydre (10-20 ml) et répéter la précipitation et centrifugation (voir étape 1.4). </li><li> Répétez l&#39;étape 1.5, puis laver le précipité de polymère à trois reprises avec de l&#39;éther glacé. </li><li> Transférer le précipité de polymère 1 à un ballon de réaction propre et raccorder le ballon à une source de vide élevé pour éliminer l&#39;éther résiduel. </li><li> Préparer et ajouter environ 20-30 ml de 20% (v / v) 4-méthylpipéridine dans le DMF en polymère intermédiaire 1. Remuer jusqu&#39;à dissolution complète. Exécutez la réaction pendant 3 heures. </li><li> Effectuer TLC 16 et le test de Kaiser (une couleur bleue confirme la présence de NH 2 libre) 17 (voir étape 1.4) pour confirmer la achèvementsn de la réaction. Si la réaction est terminée, passez à la précipitation de l&#39; éther, tel que mentionné pour le produit 1 (étapes 1,4-1,6). </li><li> Sécher le produit polymère 2 (MeO-PEG 5K - Lys (NH 2) 2) sous vide. </li><li> Effectuer un tour de plus de (Fmoc) 2 Lys-OH-accouplement sur l&#39; intermédiaire 2 (étapes 1,1-1,7) pour générer des produits 3 (MeO-PEG 5K Lys (Lys (NH-Fmoc) 2) 2). De-protéger (étapes 01.08 à 01.10) les groupes Fmoc (4, Meo-PEG 5K Lys (Lys (NH 2) 2) 2) et deux (étapes 1,1-1,7) le (Fmoc) Lys (Boc) -OH à générer une polylysine dendritique de troisième génération (5, MeO-PEG-Lys - Lys 5k 2 - ((Fmoc) Lys (Boc)) 4) terminé par quatre groupes Boc et Fmoc sur une extrémité de la chaîne de PEG. </li><li> Transférer le polymère intermédiaire obtenu 5 dans un ballon de réaction. dans la mesureballon de réaction eparate, préparer 1: 1 (v / v) d&#39;acide trifluoroacétique (TFA) dans du dichlorométhane (DCM). Ajouter 15-20 ml d&#39;un mélange 1: 1 TFA / DCM (volume / volume) du polymère intermédiaire 5. On agite le mélange jusqu&#39;à ce que le polymère soit complètement dissous. Agiter pendant une 3 heures supplémentaires. </li><li> Effectuer TLC 16 et le test de Kaiser (une couleur bleue confirme la présence de NH 2 libre) 17 (voir l&#39; étape 1.4) pour confirmer l&#39;achèvement de la réaction. Si la réaction est terminée, on évapore le mélange de polymère-dans-TFA / DCM avec de l&#39;air jusqu&#39;à l&#39;obtention d&#39;une solution visqueuse. Procéder à la précipitation de l&#39; éther, tel que mentionné pour le produit 1 (étapes 1,4-1,6). Sécher le produit polymère 6 (MeO-PEG 5k Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (NH 2)) 4) sous vide. </li><li> Polymère intermédiaire 6 dans un ballon de réaction de transfert. Utilisez environ 40 ml de DMF anhydre contenant 8 équiv. de N, N -diisopropylethylamine (DIEA) pour dissoudre le polymère intermédiaire 6. Dans un récipient en verre, dissoudre 12 équiv. de HOBt, 12 équiv. de DIC, et 12 équiv. de (Fmoc), Cys (Trt) -OH dans 20 à 25 ml de DMF anhydre. Agiter pendant 10-15 min, puis ajouter le mélange réactionnel dans le ballon de réaction contenant 6. Exécutez la réaction pendant la nuit. </li><li> Confirmer l&#39;achèvement de la réaction avec TLC 16 et le test de Kaiser (voir l&#39; étape 1.4; une couleur jaune indique l&#39;absence de NH2 libre) 17. Si la réaction est terminée, passez à la précipitation de l&#39; éther, tel que mentionné pour le produit 1 (étape 1,4-1,6), pour isoler le produit 7 (MEO-PEG 5K Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys - ((Fmoc) Cys (Trt))) 4. </li><li> Effectuer Fmoc de protection sur 7, comme indiqué à l&#39; étape 1.8, pour obtenir un produit 8 (PEG 5K Lys-Lys 2 - (Lys (NH 2) - (Cys (NH 2) (Trt))) 4). Couple (Fmoc) -PEG 2 -Suc-OH (linker &quot;Ebes&quot;, 24 équiv.) Sur un couplage polymère intermédiaire en utilisant la procédure décrite ci - dessus pour HOBt / DIC médiation pour obtenir l&#39; intermédiaire 9 (MEO-PEG 5K Lys-Lys 2 Lys 4 - (Cys (Trt) ) 4 (Ebes (NH-Fmoc)) 8). </li><li> Effectuer un tour de plus de Fmoc de protection (étapes 1,6-1,8) pour obtenir l&#39; intermédiaire 10 (MEO-PEG 5K Lys-Lys 2 Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 (Ebes (NH 2)) 8). </li><li> Transférer le polymère intermédiaire 10 dans un ballon de réaction et ajouter du DMF anhydre (environ 30 à 40 ml) pour le dissoudre. Dans un autre ballon de réaction, dissoudre 24 équiv. de CAOSu (préparé selon le mode opératoire publié antérieurement) dans du DMF anhydre (20-30 ml) 18. Ajouter 48 équiv. de N, N - diisopropyléthylamine et laisser agiter pendant 10-15 min. Transférer le contenu dans le flacon de réaction contenant 10 et laisser la réaction run overnight. </li><li> Confirmez l&#39;achèvement de la réaction avec TLC 16 et le test de Kaiser (voir l&#39; étape 1.4; une couleur jaune indique l&#39;absence de NH2 libre) 17. Si la réaction est terminée, passez à la précipitation de l&#39; éther, tel que mentionné pour le produit 1 (étapes 1,4-1,6) pour isoler le produit 11 (MEO-PEG 5K Lys-Lys 2 Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 -Ebes 8 -CA 8). Dialyser dans de l&#39;eau désionisée et on lyophilise l&#39;échantillon pour donner une poudre blanche. </li><li> Placer le polymère intermédiaire 11 dans un ballon de réaction. Préparer et ajouter 20 ml de TFA / 1,2-éthanedithiol (EDT) / triéthylsilane (SIT) / H 2 O (94 / 2,5 / 1 / 2,5, v / v) dans la solution de polymère. Incorporer le mélange jusqu&#39;à dissolution complète. Exécutez la réaction pendant 4 heures. Confirmer l&#39;achèvement de la réaction par CCM 16. </li><li> Sous la hotte, souffler de l&#39; air dans le polymère-TFA / EDT / TIS / H 2mélange O jusqu&#39;à ce que la solution devient visqueuse. Procéder à la précipitation de l&#39; éther, comme indiqué pour le produit 1 (étapes 1.4 à 1.6), pour isoler le produit final, 12 (PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8). Dissoudre dans de l&#39;acétonitrile et lyophilisé pour donner une poudre blanche. </li></ol> 2. Préparation de micelles PTX-chargés <ol><li> Préparer un PTX-chargé PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 micelles en utilisant la méthode d&#39;évaporation standard. <ol><li> Dissoudre 20 mg de DT avec une quantité différente de PTX (1-9 mg) dans 1 ml de chloroforme (CHCI3). Éliminer le solvant en utilisant un évaporateur rotatif pour obtenir un film de polymère homogène et sec. Reconstituer le film avec 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) par vortex, puis par traitement aux ultrasons pendant 30 min à 40 kHz, le cas échéant, pour permettre la formation de micelles chargées de médicament. </li><li> Ajouter 6 ul de 3% (p / p) H 2 O 2 (1 équiv. De free les groupes thiol) pour oxyder les groupes thiol sur le TD. Utilisez la solution micellaire pour une caractérisation plus poussée une fois que le niveau des groupes thiol libres reste à des valeurs constantes faibles, comme indiqué par le test de Ellman 19. </li><li> On filtre la solution avec un filtre de 0,22 pm pour stériliser l&#39;échantillon. Analyser la quantité de médicament chargée dans les micelles d&#39;un 20 système HPLC après la libération des médicaments à partir des micelles en y ajoutant 9 fois l&#39; acétonitrile et en effectuant 10 minutes de sonication. Utiliser une colonne HPLC C18 avec un mélange acétonitrile / eau comme phase mobile. </li><li> Calculer la charge de médicament en fonction de la courbe d&#39;étalonnage entre les valeurs de surface par HPLC et les concentrations du médicament standard 11. NOTE: L&#39;efficacité de chargement est défini comme le rapport du médicament chargé dans les micelles de la teneur initiale en médicament. </li></ol></li></ol> 3. Caractérisations de micelles <ol><li> Mesurer la répartition de la taille et de taille micelles avec une diffusion de lumière dynamique (DLS) instrument 29. Effectuer les mesures à la température ambiante et de maintenir la concentration de micelles à 1 mg / ml. REMARQUE: Pour effectuer l&#39;analyse granulométrique, utilisez PBS comme vide, puis enregistrer la taille des particules pour les échantillons réels. Prenez les lectures en triple pour les échantillons, puis la moyenne des lectures. </li><li> Utilisez les spectres de fluorescence pour mesurer la concentration micellaire critique (CMC) de PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 avant et après réticulation avec pyrène comme sonde fluorescente hydrophobe, comme décrit précédemment 13,21. NOTE: En règle générale, la concentration micellaire est comprise entre 5 × 10 -7 à 5 × 10 -4 M. </li></ol> 4. Stabilité des micelles en SDS avec ou sans agents réducteurs <ol><li> Préparer des solutions mères de dodécylsulfate de sodium (SDS) à une solution (7,5 mg / ml) et de disulfure de micelles réticulées (1,5 mg / ml) dans du PBS. Ensuite, uchanter les solutions mères, faire un mélange de solution dans laquelle la concentration finale SDS est à 2,5 mg / ml et la concentration de micelles est à 1,0 mg / ml. </li><li> Mesurer la distribution de taille et la taille (comme indiqué à l&#39;étape 3.1), des solutions micellaires, à des intervalles de temps prédéterminés, avec ou sans la présence de glutathion 10 mM (GSH). </li></ol> 5. hémolyse Assay <ol><li> Évaluer le potentiel hémolytique de micelles PTX-chargé, non-réticulés (PTX-MR) préparé selon une procédure publiée précédemment 11 et micelles réticulées PTX-chargés (PTX-RDR) en utilisant du sang frais citraté de souris nues recueillies à partir de la queue voile. <ol><li> Collecter des globules rouges par centrifugation des échantillons de sang (1,0 ml) à 1000 g pendant 10 min, les laver trois fois avec du PBS, puis remettre en suspension les culots cellulaires avec du PBS jusqu&#39;à une concentration finale de 2%. </li></ol></li><li> Mélanger 200 pi de suspension d&#39;érythrocytes avec des concentrations différentes (0,2 et 1,0mg / ml) de PTX-MR et PTX-DCMs, respectivement, et incuber pendant 4 heures à 37 ° C dans un agitateur incubateur. </li><li> Centrifuger les mélanges micelles-érythrocytaires à 3000 xg pendant 5 min. Transférer 100 pl de surnageant de tous les échantillons dans une plaque à 96 puits. Mesurer l&#39;absorbance de l&#39;hémoglobine libre dans le surnageant à 540 nm en utilisant un lecteur de micro-plaque. NOTE: Les globules rouges incubées avec le Triton-100 (2%) et du PBS doivent être utilisées en tant que témoins positifs et négatifs, respectivement. Le pour cent de l&#39;hémolyse des globules rouges est calculée avec la formule suivante: RBC hémolyse = (OD échantillon - OD contrôle négatif) / (contrôle positif OD - témoin négatif OD) x 100%. </li></ol>

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<li>Karala, A. R., Lappi, A. K., Saaranen, M. J., Ruddock, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+peroxide-mediated+oxidative+refolding+of+a+protein+at+physiological+pH+and+implications+for+oxidative+folding+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Efficient peroxide-mediated oxidative refolding of a protein at physiological pH and implications for oxidative folding in the endoplasmic reticulum.</a> Antioxid. Redox Signal. 11, 963-970 (2009).</li>
<li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+nanomedicines%3A+closing+the+translational+gap%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cancer nanomedicines: closing the translational gap.</a> Lancet. 384, 2175-2176 (2014).</li>
<li>Nanotrac Nanotechnology Particle Size Measurement Solutions. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf">http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf</a> (2006).</li>
</ol>

Y. Li et K.S.L. sont les inventeurs d’un brevet en instance sur des systèmes micellaires réticulés de manière réversible (demande de brevet américain 61/485,774). K.S.L. est le scientifique fondateur de LamnoTherapeutics Inc., qui prévoit de développer les nanothérapies décrites dans le manuscrit. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Plusieurs nanoparticules ont été étudiés pour leur utilisation potentielle dans l&#39;administration de médicaments. doxorubicine liposomale et le paclitaxel (PTX) chargé en sérumalbumine nano-agrégats humains sont parmi les nanotherapeutics approuvés par la FDA pour le traitement du cancer. Cependant, bien que cliniquement efficace, ces deux nanotherapeutics sont relativement &quot;grande&quot; taille, et ils ont tendance à s&#39;accumuler dans le foie et les poumons. micelles polymériques avec des tailles de particule...

La nanotechnologie est un domaine en pleine émergence qui a bénéficié d&#39; un certain nombre de domaines biomédicaux 1. Nanoparticules offrent des possibilités pour la conception et le réglage des propriétés qui ne sont pas réalisables avec d&#39;autres types de traitements conventionnels. Nano-transporteurs améliorent la stabilité des médicaments contre la biodégradation, prolonger le temps de circulation de la drogue, à surmonter les problèmes de solubilité médicaments, et peuvent être ajustés pour la livraison ciblée de médicaments et pour les agents de co-distribution imagerie 1,2. systèmes de distribution à base de nanoparticules sont prometteurs dans l&#39;imagerie et le traitement du cancer. Vasculatures tumorales sont leaky aux macromolécules et peuvent conduire à une accumulation préférentielle de circulation des nanoparticules sur les sites tumoraux par la perméabilité accrue et la rétention (EPR) Effet 3. Parmi les différents nano-supports (par exemple, des liposomes, des hydrogels, des polymères et des micelles) qui sont activement poursuivies comme supports pour des médicaments anticancéreux, des micelles polymères ont acquis une grande popularité au cours ee dernière décennie 4,5. Les micelles polymériques sont un système thermodynamique qui, lors de l&#39;administration par voie intraveineuse, peut éventuellement être diluée au-dessous de la concentration micellaire critique (CMC), conduisant à leur dissociation en unimères. stratégies de réticulation ont été utilisées pour réduire au minimum la dissociation micellaire en unimères. Cependant, les micelles excessivement stabilisées peuvent empêcher de libérer le médicament aux sites cibles, réduisant ainsi l&#39;efficacité thérapeutique globale. Plusieurs approches chimiques ont été explorées pour rendre la réticulation dégradable en réponse à redox ou à des stimuli externes, tels que des liaisons disulfures réductibles 6,7 et pH-clivable 8 ou ester hydrolysable obligations 9,10. Nous avons précédemment rapporté la conception et la synthèse de nanoparticules micellaires , comprenant de l&#39; acide cholique dendritique (CA) et des séquences linéaires de polyéthylène glycol (PEG) , les copolymères appelés telodendrimers (TD) 15/11 </sup&gt;. Ces TDs sont représentés comme PEG nK -Cay (où n = poids moléculaire en kilodaltons (K), y = nombre d&#39;acide cholique (CA) unités). Ils sont caractérisés par leur petite taille, longue durée de conservation, et une grande efficacité dans les médicaments encapsulant tels que le paclitaxel (PTX) et doxorubicine (DOX) dans le noyau hydrophobe. Les éléments constitutifs de la TD, tels que le PEG, la lysine, et CA, sont biocompatibles, et la présence d&#39;une couronne de PEG peut conférer un caractère nanoparticulaire &quot;furtif&quot;, ce qui empêche l&#39;absorption non spécifique des nanoparticules micellaires par le système réticulo-endothélial. polymères linéaires-dendritique thiolées peuvent facilement être générés par l&#39;introduction de cysteines dans le squelette du oligo-lysine dendritique de notre TDs standard. Cet article présente un protocole facile pour la production d&#39;un système de délivrance de médicament micellaire réversiblement réticulé par introduction reticulations disulfure dans le noyau hydrophobe de Tou (figure 1).

<table><tbody><tr><td>MeO-PEG5K-NH2</td><td>Rapp Polymere</td><td>125000-2</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Fmoc)-OH</td><td>Aaptec</td><td>AFK107</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Anaspec</td><td>AS-20132</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Aapptec</td><td>AAC105</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylformamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td></td></tr><tr><td>Éther éthylique</td><td>Fisher Scientific</td><td>E134-20</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td>Corrosif, manipuler avec précaution</td></tr><tr><td>4-méthyl pipéridine</td><td>Alfa-Aesar</td><td>L-02709</td><td></td></tr><tr><td>Ebes linker</td><td>Anaspec</td><td>AS-61924</td><td></td></tr><tr><td>Acide cholique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1129</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02390</td><td>Poignée à l’intérieur de la hotte. Gants d’eau de Javel après utilisation.</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme (anhydre)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Solution de peroxyde d’hydrogène 30 %</td><td>Aaron Industries</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HoBt-Cl</td><td>Aaptec</td><td>CXZ096</td><td></td></tr><tr><td>DIC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125407</td><td></td></tr><tr><td>Souris nues athymiques femelles (souche Nu/Nu), 6&ndash ; 8 semaines</td><td>Harlan (Livermore, CA)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une approche efficace et facile pour la production de micelles réversible disulfure réticulés

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomédecine est une nouvelle forme de thérapie qui exploite les propriétés uniques des particules qui sont nanomètres échelle pour application biomédicale. Améliorer l&#39;administration de médicaments pour maximiser les résultats thérapeutiques et de réduire les effets secondaires associés au médicament sont quelques-unes des pierres angulaires de la nanomédecine actuelle. Nanoparticules en particulier, ont trouvé une large application dans le traitement du cancer. Nanoparticules qui offrent un haut degré de flexibilité dans la conception, l&#39;application et la production sur la base du microenvironnement de la tumeur devraient être plus efficaces avec la traduction rapide dans la pratique clinique. Le micellaire nano-support polymère est un choix populaire pour les applications de distribution de médicaments. Dans cet article, nous décrivons un protocole simple et efficace pour la synthèse, des micelles réticulées disulfure drogue chargé basé sur l&#39;auto-assemblage d&#39;un copolymère bien défini amphiphile linéaire-dendritique (telodendrimer, TD). TD est constituée de polyéthylène glycol (PEG) comme segment hydrophile et un groupe d&#39;acide cholique thiolé comme la fraction hydrophobe attachée par étapes de formation de noyau à un PEG de terminaison amine en utilisant la chimie des peptides à base de solutions. Les médicaments chimiothérapeutiques, tels que le paclitaxel (PTX), peuvent être chargés à l&#39;aide d&#39;un procédé d&#39;évaporation de solvant standard. Le O 2 oxydation médiée a déjà été utilisé pour former disulfures liaisons transversales intra-micellaires de groupes thiol libres sur le TDs. Cependant, la réaction a été lente et pas réalisable pour la production à grande échelle. Récemment, une méthode d&#39;oxydation de l&#39; H 2 O 2 médiée a été explorée comme une approche plus réaliste et efficace, et il était 96 fois plus rapide que la méthode précédemment. En utilisant cette approche, 50 g de PTX-chargés, les nanoparticules réticulées disulfure ont été produits avec succès avec la distribution granulométrique étroite et une efficacité élevée de chargement de drogue. La stabilité de la solution micellaire obtenue est analysée en utilisant des conditions perturbatrices telles que la co-incubation avecvec un détergent dodécylsulfate de sodium, avec ou sans agent réducteur. Les micelles, réticulés disulfure chargés en médicament ont démontré une activité hémolytique inférieure par rapport à leurs homologues non réticulées.

Préparation et caractérisation des drogues chargé, micelles Disulfure réticulés Amphiphiles polymères PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 est un dendrimère susceptible de former un système micellaire disulfure réticulé pour la délivrance de médicaments anticancéreux. Structurellement, il est défini comme un oligomère dendritique d'acide cholique (domaine hydrophobe) reliés à une extrémité de la molécule liné...

Pour administrer des médicaments anticancéreux aux sites tumoraux avec une spécificité élevée et des effets secondaires réduits, de nouvelles méthodes basées sur les nanoparticules sont nécessaires. Ici, nous décrivons des micelles réticulées de disulfure qui peuvent être facilement préparées par oxydation médiée par le peroxyde d’hydrogène et sont capables de se dissocier efficacement dans un environnement tumoral réducteur pour libérer des charges utiles.

Une approche efficace et Facile pour la production de micelles réversible Disulfure réticulés

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

L’objectif global de cette procédure est de fournir un protocole simple et efficace pour synthétiser des micelles réticulées de disulfure chargées de médicaments pour l’administration ciblée de médicaments. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de la nanomédecine. Par exemple, comment produire efficacement des nano-formulations stables.Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de synthétiser facilement des micelles réticulées de disulfure à grande échelle, ce qui est extrêmement souhaitable pour les études cliniques chez les patients. Pour commencer cette procédure, ajoutez deux grammes de monoamine de polyéthylène glycol à terminaison monométhyle dans une fiole à fond rond. Ajoutez dix millilitres de DMF anhydre pour le dissoudre.Refroidir sur glace. Ajouter trois équivalents d’hydroxybenzotriazole, trois équivalents de DIC et trois équivalents de lysine protégée par le di-eth-moc dans une fiole à fond rond. Ensuite, ajoutez dix millilitres de DMF anhydre.Remuez le mélange pendant 20 minutes sur une plaque d’agitation magnétique. Ajouter ensuite le mélange dans la fiole à fond rond contenant du polyéthylène glycol à terminaison monométhyle. Retirez la fiole à fond rond du bain de glace, puis remuez toute une nuit à température ambiante.Une fois l’agitation terminée, confirmez la fin de la réaction comme détaillé dans le protocole de texte. Ajoutez 200 millilitres d’éther glacé dans la fiole de réaction. Centrifugeuse à 6 000 x g pendant six minutes à quatre degrés Celsius Pour séparer le polymère précipité.Répétez le processus de précipitation et de centrifugation deux fois, en dissolvant le produit dans 10 millilitres de DMF, à chaque fois avant la précipitation. Ensuite, lavez le polymère trois fois avec de l’éther glacé. Connectez le tube à une source de vide poussé pour éliminer l’éther résiduel.Après cela, ajoutez 20 millilitres de 20%4-méthylpipéridine dans du DMF au polymère. Remuer jusqu’à ce que la dissolution soit complète. Laissez la réaction s’amuser pendant trois heures.Après avoir confirmé l’achèvement de la réaction, séchez le produit polymère. Maintenant, composez l’intermédiaire polymère numéro deux sous vide, puis effectuez des étapes supplémentaires de synthèse du polymère comme indiqué dans le protocole de texte. Une fois que l’intermédiaire polymère numéro 10 est produit, transférez-le dans une fiole de réaction.Ajouter 30 millilitres de DMF anhydre. Dans un nouveau flacon, dissoudre 24 équivalents d’acide cholique activé dans 20 millilitres de DMF. Ajoutez ensuite 48 équivalents de N, N-Diisopropyléthylamine.Remuer pendant 10 minutes. Une fois l’agitation terminée, transvaser le mélange dans la fiole réactionnelle contenant l’intermédiaire polymère numéro 10. Laissez la réaction fonctionner pendant la nuit.Le lendemain, confirmez l’achèvement de la réaction et précipitez l’intermédiaire polymère numéro 11, comme indiqué dans le protocole de texte. Composez ensuite l’intermédiaire polymère dans de l’eau désionisée. Lyophilisez l’échantillon pour obtenir une poudre blanche.Après avoir préparé les micelles, dissoudre 20 milligrammes de télodendrimère et cinq milligrammes de PTX dans un millilitre de chloroforme. Éliminer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif pour obtenir un film polymère sec homogène. Reconstituer le film avec un millilitre de PBS par vortexing.Puis sonicate pendant 30 minutes à 40 kilohertz. Ajoutez 3 % de peroxyde d’hydrogène pour oxyder les groupes thiols sur le télodendrimmer. Effectuer les étapes supplémentaires de préparation et de vérification décrites dans le protocole textuel.Une fois la préparation des micelles terminée, mesurez la taille et la distribution granulométrique des micelles à l’aide d’un instrument de diffusion dynamique de la lumière. Effectuez les mesures à température ambiante et maintenez la concentration micelle à un milligramme par millilitre. Préparez ensuite une solution mère de 7,5 milligrammes par millilitre de dodécylsulfate de sodium dans du PBS.Préparez ensuite une solution mère de 1,5 milligramme par millilitre de micellules réticulées de disulfure dans du PBS. L’utilisation de ces solutions mères crée un mélange dans lequel la concentration finale de SDS est de 2,5 milligrammes par millilitre. Et la concentration micellaire est de 1,0 milligramme par millilitre.Chargez l’échantillon et mesurez la taille et la distribution granulométrique de la solution micellaire à deux minutes d’intervalle. Après avoir prélevé du sang frais citraté de souris nues, centrifugez un échantillon de sang d’un millilitre à 1 000 x g pendant 10 minutes pour collecter des globules rouges. Lavez-les trois fois avec du PBS, puis remettez en suspension la pastille cellulaire avec du PBS jusqu’à une concentration finale de 2 %Mélangez 200 microlitres de suspension érythrocytaire avec une solution de 1,0 milligramme par millilitre de PTX NCM.Mélangez ensuite 200 microlitres de suspension érythrocytaire avec une solution de 1,0 milligramme par millilitre de DCM PTX. Incuber ces mélanges dans un agitateur d’incubateur pendant quatre heures à 37 degrés Celsius. Une fois l’incubation terminée, centrifugez les mélanges à 3 000 x g pendant cinq minutes.Transférez 100 microlitres du surnageant de chaque échantillon dans une plaque à 96 puits. Ensuite, utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer l’absorbance de l’hémoglobine libre à 540 nanomètres. Tel que mesuré par le test d’Ellman, le taux de conversion des groupes thiols libres en liaisons disulfure a atteint 85 % après 48 heures d’oxydation médiée par l’oxygène.Ici, une méthode d’oxydation médiée par le peroxyde d’hydrogène est utilisée comme méthode alternative. Le taux de conversion atteint 88 % en 30 minutes. Ce qui est 96 fois plus rapide que l’approche médiée par l’oxygène.En utilisant cette approche plus efficace, plus de 50 grammes de nanoparticules ont été produits avec une taille de particule mesurée de 27 nanomètres avec une distribution de taille étroite. La stabilité des micelles réticulées disufide chargées de PTX est également étudiée dans des conditions sévères de perturbation des micelles. La taille des particules des micelles est restée stable au fil du temps, ce qui indique qu’elles sont restées intactes.Après l’introduction de GSH à une concentration intracellulaire, la taille des micelles réticulées de disulfure chargées de médicament reste intacte pendant 30 minutes, puis diminue brusquement à un nanomètre. Cela signifie la réduction d’un nombre critique de liaisons disulfure, condition préalable à la dissociation rapide des micelles. Les résultats représentatifs de l’activité hémolytique des micelles chargées de PTX sont présentés ici.Les NCM PTX ont un nombre de lyses des globules rouges dose-dépendant. Cependant, les DCM PTX qui ont une réticulation disulfure ne montrent aucune activité hémolytique observable. Une fois maîtrisée, cette technique peut être pratiquée dans une autre si elle est exécutée correctement.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’ajouter une quantité égale de peroxyde d’hydrogène à 3 % pour la formation de disulfure. Suite à cette procédure, un test d’hémolyse peut être effectué afin d’évaluer la compatibilité sanguine des micelles réticulées de disulfure. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser efficacement des micelles réticulées de disulfure chargées de médicaments.N’oubliez pas que certains de ces produits chimiques peuvent être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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