マイクロ Rna と受ける DNA の組換えをクラス スイッチしてプラズマ細胞の分化誘導された B 細胞における Mrna のゲノム解析の HDAC 阻害剤を介した変調

この実験の全体的な目標は、Bリンパ球に抗体クラススイッチングと形質細胞分化を起こさせ、B細胞におけるHDAC阻害剤mRNAとmicroRNAの発現による調節とエピジェネティックな制御を解析することです。この方法は、免疫グロブリンのクラススイッチングのエピジェネティックな調節や形質細胞の分化など、B細胞抗体応答分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、B細胞機能を調節する簡単な方法を提供し、エピジェネティックな調節因子によるマイクロRNAおよびmRNAの変化を定義することです。

特定の病原体を含まないC57BL6Jマウスを安楽死させ、テキストプロトコルに従って皮膚を滅菌した後、オートクレーブ滅菌した鉗子と解剖ハサミを使用して胸郭のすぐ下の皮膚を切り取り、腹部の左側、肝臓のすぐ下にある脾臓を視覚化します。臓器を摘出する前に、脾臓をそっと固定し、すべての接続組織を切り取ります。次に、脾臓を1, 000マイクロリットルの完全なRPMI 1640培地を含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブに入れます。

次に、50ミリリットルのポリプロピレン製円錐形遠心チューブに70ミクロンのセルストレーナーを挿入し、微量遠心チューブからセルストレーナーに脾臓を注ぎます。15ミリリットルのポリプロピレン製円錐形遠心チューブの先端を使用して、ストレーナーを通して脾臓を優しくメッシュします。次に、15〜20ミリリットルの完全な培地で、ストレーナーをすすぎます。

細胞を350 x Gで5分間スピンダウンします。上清を捨てます。1ミリリットルのACK溶解バッファーを使用して細胞ペレットを再懸濁し、1分間インキュベートします。

次に、4ミリリットルのACKを加え、懸濁液をインキュベートして、脾臓懸濁液から赤血球をさらに4分間、室温で時々振とうします。次に、25ミリリットルの完全培地を加えて、溶解反応を急冷します。細胞を350 x Gで5分間スピンダウンします。

上清を捨て、1ミリリットルの完全培地を加えて細胞ペレットを再懸濁します。次に、血球計算盤を使用して、生存細胞を数えます。滅菌済みの5ミリリットルポリスチレン丸底チューブに、1 x 10〜8 cells/mLの0.25〜2ミリリットルの細胞懸濁液を完全な培地で調製します。

正常なラット血清をサンプルに加えます。次に、アイソレーションカクテルのミリリットルあたり50マイクロリットルをチューブに追加します。次に、2〜3回ピペッティングで静かに上下させて細胞を混合し、サンプルを室温で10分間インキュベートします。

ストレプトアビジン被覆磁性粒子のミリリットルあたり75マイクロリットルをチューブに加えます。ピペットで2〜3回静かに上下させ、サンプルを室温で2分半インキュベートします。完全なRPMI 1640培地を使用して容量を最大2.5ミリリットルにし、2〜3回静かにピペットで混ぜます。

開いたチューブを磁石に入れ、室温で2分半インキュベートします。次に、手つかずのB細胞を含む上清を新しい15ミリリットルの円錐管に注ぎます。トリパンブルーと血球計算盤を使用して細胞をカウントします。

精製したB細胞を完全なRPMI 1640培地に、最終濃度0.3 x 10から1ミリリットルあたり6番目の細胞まで再懸濁します。次に、48ウェルプレートのウェルに、0.3 x 10で1ミリリットルの精製B細胞を0.3 x 10で6番目の細胞に加えます。大腸菌のLPSは1ミリリットルあたり3マイクログラム、IL4は1ミリリットルあたり5ナノグラム、およびゼロまたは500マイクロモルのHDIです。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で60時間、QRT PCRおよびハイスループットmRNAおよびmiRNAシーケンシング解析の場合は96時間インキュベートします。

96時間の培養後、細胞を数回ピペッティングして各ウェルから細胞を分離します。細胞懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。次に、ベンチトップ遠心分離機を使用して、細胞を350 x Gで5分間スピンダウンします。

次に、上清を捨てます。HBSS緩衝液と以下の試薬のカクテルを混合します、1%BSA、0.5ナノグラム/ミリリットルの標識ヤギ抗マウスIgM抗体、0.2ナノグラム/ミリリットルの標識ラット抗マウスIgG1モノクローナル抗体、0.2ナノグラム/ミリリットルの標識ラット抗マウスB220モノクローナル抗体、0.2ナノグラム/ミリリットルのPE-Cy7標識ラット抗マウスCD138モノクローナル抗体、および7-AADのミリリットルあたり2ナノグラム。細胞を暗所で室温で30分間インキュベートします。

次に、1ミリリットルのHBSSと1%BSAを使用して細胞を洗浄します。ベンチトップ遠心分離機を使用して、細胞を1, 500 x Gで5分間スピンダウンします。上清を廃棄した後、300マイクロリットルのHBSSと1%BSAを使用して細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を丸底ポリスチレンチューブに移します。

光が当たらないように、チューブをホイルで覆います。mRNAのQRT PCR解析を行うには、DNAse 1処理ステップを含めます。次に、製造元の指示に従って、small RNAを回収できる市販のtotal RNA単離キットを使用して、0.2〜5 x 10から6番目の細胞までRNAを抽出します。

cDNAを合成し、mRNA上でQRT PCRを行った後、室温で解凍したサイバーグリーンリアルタイムPCRマスターミックス、2x PCRマスターミックス、250ナノモルmiRNA特異的フォワードプライマー、ユニバーサルリバースプライマーを用いて、microRNAのRT PCRを行います。テキストプロトコルに従って25マイクロリットルの反応混合物を調製した後、96ウェルPCRプレートにウェルあたり22.5マイクロリットルのアリコートを加えます。次に、2.5マイクロリットルのテンプレートcDNAを個々のウェルに加えます。

プレートフィルムをしっかりと密封します。次に、プレートを室温で1, 000 x Gで1分間遠心分離します。プレートをリアルタイムサイクラーに置き、テキストプロトコルにあるサイクリングプログラムを開始します。

このビデオで実証されたプロトコルを使用して、PS NIL4なしで96時間インキュベートした精製B細胞は、IgG1に対するCSRの30〜40%、形質細胞の分化の約10%を誘導できます。HDIによる治療後、IgG1へのCSRは10〜20%に減少し、形質細胞の分化は約2%に減少しました。さらに、組換え後I mu Cγ1および成熟VHDJHCγ1転写産物の数の減少により、CSRの阻害が確認されました。QRT PCRで測定したところ、CSR SHMに重要なAicdaの発現と、形質細胞の分化に重要なPrdm1とXbp1の発現がVPAによって阻害されることが示されました。

PS Nil4なしで刺激されたB細胞のmRNAシーケンシングによって測定されたところ、これらの高発現mRNAのうち0.3%のみがHDIによって2倍以上アップレギュレーションされ、Aicda、Prdm1、Xbp1を含む高発現mRNAのわずか0.36%のみがHDIによって50%以上減少しましたHDIまたはNilで処理されたB細胞におけるmiRNAプロファイリングのmiRNAシーケンシング解析、 HDIがmiRNAを標的とするAicdaとPrdm1を選択的にアップレギュレーションすることを示しました。一度習得すれば、このテクニックは4時間半から5時間で完了します。この手順を試みるときは、無菌の作業環境を維持することを覚えておくことが重要です。

このビデオを見れば、B細胞にクラススイッチングと形質細胞の分化を誘導する方法と、エピジェネティックな調節因子によってこれらの機能を調節する方法について十分に理解できるはずです。