エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

次の実験の全体的な目標は、少量の末梢血から統合フリーの人工多能性幹細胞を生成することです。これは、分離された末梢血単核細胞を定義された成長因子で培養し、リプログラミングに非常に反応する赤血球前駆細胞集団を生成することによって達成されます。第2のステップとして、リプログラミング遺伝子を運ぶ非統合エピソームプラスミドが核の愛情によって赤芽細胞に導入され、リプログラミングプロセスを開始します。

次に、核に罹患した細胞を照射したマウス胚性線維芽細胞の層に播種し、最終的に成功裏に継続的なリプログラミングを可能にします。再プログラムされた誘導多能性幹細胞コロニーは、その形態学的特性、アルカリホスファターゼ活性、多能性マーカーの陽性免疫化学、および内因性多能性遺伝子の発現に基づいて同定できます。ウイルスベースのリプログラミングのような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、このプロトコルが統合フリーIPSCの一貫した生成を保証することです。

研究室の技術者 まず、DPBSで末梢血を1対1の比率で希釈します。次に、15ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブで、希釈した血液の7ミリリットルを3ミリリットルの室温のfi call hiパックに慎重に重ねます。サンプルを400 GSおよび室温で30分間分離した後、pbmcはプラズマとfialハイパックの間の曇った白い界面層に落ち着きます。

滅菌トランスファーピペットを使用して、P BMCを15ミリリットルの円錐管に移し、新鮮なDPBSで容量を最大10ミリリットルにします。次に、細胞を数えた後、新しい15ミリリットルの円錐管に6つのP BMCに2回10を移し、残りの細胞をスピンダウンし、ペレット化された細胞を10%ジメチルスルホキシドを含む90%ウシ胎児血清中の6pbmc/ミリリットル濃度に2倍10で凍結します。次に、取っておいたP BMCsをスピンダウンした後、新たに調製した膨張培地の2ミリリットルでペレットを懸濁し、12ウェルの組織培養プレートの1つのウェルにプレートし、酸素5%、二酸化炭素5%、窒素90%の雰囲気で摂氏37度の加湿インキュベーターで細胞をインキュベー

次に、3日目と6日目に、ウェルから細胞を採取して培地を交換します。2ミリリットルのQBSF 60でウェルを洗浄して残りの細胞を収集し、遠心分離によって細胞をペレット化し、次にペレットを2ミリリットルの新鮮な膨張培地に懸濁させます。その後、細胞を同じ12ウェルプレートに戻し、インキュベーションを続けます 9日目に、表に示されているように、リプログラミングプラスミドを滅菌済みの1.5ミリリットルのeinorチューブにピペットで移します。

次に、核酸包接液を製造業者から提供されたサプリメントと混合し、混合物を滅菌済みの1.5ミリリットルのアップエンドDPHチューブに移します。次に、2ミリリットルの拡張培地を新しい12ウェルプレートの1つのウェルに分注し、加湿した摂氏37度のインキュベーターで培地を平衡化します。細胞を採取し、示したばかりのように細胞培養物をよく洗浄し、5ミリリットルのDPBSで細胞を洗浄します。

その後、細胞ペレットを100マイクロリットルの核愛情溶液に加えて、気泡が発生しないように注意しながらサプリメントに懸濁し、細胞懸濁液をリプログラミングプラスミドを含むチューブに移します。ピペッティングで1回上下させて細胞を混合し、溶液全体を核愛情獣医の底に移します。次に、veteをNucle愛情マシンに入れ、プログラムT 0 1 9を実行します。

次に、100マイクロリットルのEQUILIBRATED拡張培地を核愛情培地に加え、すぐにサンプル全体を収集して、白い浮遊死細胞の破片を避け、プレウォーム培地のウェルに沈殿させます。その後、10日目または11日目に細胞を加湿インキュベーターに戻します。6ウェル組織培養プレートの各ウェルをゼラチンでコーティングし、HBSS中の0.1%ゼラチン1ミリリットルでゼラチンでコーティングし、次いでプレートを加湿インキュベーターに入れるか、またはインキュベーション中に少なくとも5分間、1バイアルの解凍液を10回、6つの3000°C照射マウス、胚性、線維芽細胞、またはmesに10ミリリットルの予熱メス培地に移し、 次に、細胞がスピンダウンしている間に細胞を遠心分離します。

6ウェルプレートからゼラチン溶液を吸引し、次いで12ミリリットルの新鮮な覚醒剤培地にメスを再懸濁する。すぐに2ミリリットルのOFMをゼラチンコーティングの各ウェルに分注します。.6。ウェルプレートをプレートし、プレートを加湿インキュベーターに12日目まで戻します。

12日目に、ウェルから核影響を受けた細胞を1つの15ミリリットルの円錐管に収集し、ウェルを洗浄し、残りの細胞を収集することが実証されました。細胞をスピンダウンした後、新たに調製した12ミリリットルのリプログラミング培地にペレットを懸濁し、フィーダー細胞の各ウェルに2ミリリットルの細胞を分注します。次に、6ウェルプレートでプレートを75GSおよび室温で30分間遠心分離し、プレートを加湿インキュベーターに戻し、1〜2週間隔日で培地を交換します。

誘導性多能性細胞コロニーが出現したら、核の愛情の3日後、およびプレーティングする前に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む新たに調製されたヒト胚性幹細胞培地を細胞に供給し始め、核は誘導性メスに影響を受けた細胞をプレーティングします。成功したNU核の愛情の効率は、蛍光顕微鏡法によって推定されるべきである 例えば、ここに示されているのは、EGFPを発現する全細胞集団の約5〜10%の典型的な核の愛情実験であり、再プログラムされた誘導性多能性幹細胞コロニーは、NUの核の愛情の約2週間後に現れ始める。コロニーは一般に、明確に定義された境界を持つ円形であり、核と細胞質の比率が高い小さな密集した細胞や、完全に特徴付けられた代表的な系統の可視核小体など、特徴的なヒト胚性幹細胞の形態によって識別できます。

アルカリホスファターゼ活性が陽性の全ての検査は、標準的な多能性マーカーを発現し、一度習得すると内因性多能性遺伝子を再活性化します。この手法は、適切に実行すれば、4週間で統合フリーのIPSCを一貫して生成できます。この手順に続いて、あらゆる組織タイプに関する質問に答えるために、分化研究を実施することができます。