Name: エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学ぶエピソームベースの非統合型iPS細胞生成法。末梢血単核球を培養し、HDAC阻害剤と共にエリスロブラストへ nucleofection して再プログラミング効率を高め、統合リスクのないiPS細胞を樹立する技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、この研究を支援するため、NIHから次の助成認めることを望む：K08DK082783（AR）、P30DK56465（BTS）、U01HL099993（BTS）、T32HL00715036（SKS）、およびK12HL0806406（SKS）を。とJPマッカーシー財団（AR）。

フレッド·ハッチンソンがん研究センターの治験審査ボードと子どもの &quot;sフィラデルフィアの病院で承認され、インフォームドコンセントを書かれ、末梢血サンプルを採取する前に、患者から得られた。すべての施設のガイドラインが観察された。MEF生成を含む全ての動物実験と奇形腫形成は施設内動物管理使用委員会によって承認された。 PBMCおよび赤芽球の拡大1.フィコール分離 - 0日<ol><li>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で1：末梢血1に希釈する。 15ミリリットル丸底ポリスチレンチューブでは、慎重に室温フィコール - ハイパックの3ミリリットルに希釈した血液7mlのレイヤ。 </li><li> 30分間400×gでサンプルを遠心。 </li><li> PBMCをプラズマと曇った白色層として見フィコール - ハイパックとの間のインタフェースに定住しているでしょう。滅菌したトランスファーピペットを使用して、PBを収集1 15ミリリットルコニカルチューブにMCを。 DPBSを用いて10 mlにボリュームを持参してください。 </li><li>血球計を使用して、PBMCをカウント。 </li><li>ピペットで5分間300×gで別々の15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に2×10 6のPBMC。 90％ウシ胎児血清（FBS）/ 10％ジメチルスルホキシド（DMSO）中で2×10 6のPBMC / mlの濃度で残存する細胞凍結スピンダウンする。 </li><li> QBSF 60無血清培地（光から保護）+ペニシリン/ストレプトマイシン（1％）+アスコルビン酸（50 ng / ml）を+細胞因子（SCF、50 ng / ml）を+インターロイキン3（IL-幹：増殖培地を準備3、10 ng / ml）を+エリスロポエチン（EPO、2 U / ml）を+インスリン様成長因子1（IGF-1、40 ng / ml）を+デキサメタゾン（1μM、光から保護し、新鮮なアリコートを解凍し、各メディア変化する）。 </li><li>作りたての拡張培地2mlおよび再懸濁2×10 6 PBMCを12ウェル組織培養プレートの1ウェルに置き、5の雰囲気を37℃の加湿インキュベーター中でインキュベート％O 2、5％CO 2、90％N 2。 </li><li> 3日目と6日目に、培地を交換してください。 <ol><li>細胞を回収し、残りの細胞を収集するためにQBSF-60の2ミリリットルとよく洗う。 </li><li> 5分間300×gで細胞懸濁液を遠心し、上清を吸引除去する。 </li><li>新しい増殖培地2mlに細胞を再懸濁し、同じ12ウェルプレートに戻す。 </li></ol></li></ol>ヌクレオ2.リプログラミング細胞 - 9日目<ol><li>滅菌した1.5mlのエッペンドルフチューブ（ 表1）に再プログラミングプラスミドをピペット。 </li><li>滅菌1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに補足（メーカーにより供給）とピペットでヌクレオソリューションを混ぜる。 </li><li>ピペット2加湿37℃インキュベーター中で12ウェルプレートの場所の1つのウェルに増殖培地（5％O 2、5％CO 2および90％N 2）の前に細胞を添加する平衡化のための溶液。 </li><li>集める培養した細胞と、残りの細胞を収集するためにQBSF-60の2ミリリットルとよく洗う。 </li><li> 5分間300×gで細胞を遠心し、上清を吸引除去する。 </li><li> DPBS 5mlに再懸濁し、5分間300×gで遠心分離して細胞を洗浄する。 </li><li>上清を吸引除去する。 </li><li>生成気泡を避けるように注意しながら、クレオ液+サプリメント100μlの細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li> 、リプログラミングプラスミドを含有するチューブに細胞懸濁液をピペットピペット上下回、およびヌクレオキュベットの底にサンプルをピペット。 </li><li>クレオマシンにキュベットを配置し、プログラムのT-019を実行します。 </li><li>クレオキュベットに（ステップ2.3で平衡化プレートから）予め温め拡大培地100μlを移す。 </li><li>すぐに予め温め増殖培地のウェルにサンプル全体と預金を集める。白、フローティング死んだ細胞の破片を集めることは避けてください。 </li&gt; <li>成長のために加湿した37℃インキュベーター（5％O 2、5％CO 2、90％N 2）にプレートを置き。 </li></ol> 3.メッキフィーダー細胞 - 10日または11 <ol><li> 10日目に、プレートフィーダー細胞。 <ol><li>ゼラチンコート1 6ウェル組織培養プレート。 <ol><li>プレートの各ウェル中にハンクス緩衝生理食塩溶液（HBSS）中の0.1％ゼラチンのピペットから1m </li><li>少なくとも5分間、加湿した37℃のインキュベーターでプレートを置きます。 </li><li>使用直前に、プレートからゼラチン溶液を吸引する。 </li></ol></li><li>予め温めMEF培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ FBS（10％）+ペニシリン/ストレプトマイシン（1％））の10ミリリットルに3000 cGyをで照射し、2×10 6マウス胚線維芽細胞の1バイアルを解凍する。 </li><li> 5分間300×gで細胞を遠心し、上清を吸引除去する。 12 MEF培地mlのピペット2mlに細胞を再懸濁Iゼラチンコート6ウェルプレートの各ウェルNtoの。 12日目まで、加湿した37℃インキュベーター（5％O 2、5％CO 2、90％N 2）にプレートを置き。 </li></ol></li></ol> 4.フィーダー細胞上で細胞をプレーティングし、培地を交換 - 12日目<ol><li> 1 15ミリリットルコニカルチューブにヌクレオフェクト細胞を収集し、QBSF-60の2ミリリットルとよく洗浄することにより、残った細胞を収集します。 5分間300×gでサンプルを遠心。 </li><li>準備再プログラミング中：イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）+ FBS（10％）+非動物L-グルタミン（1mM）を+非必須アミノ酸（NEAA、1％）+ペニシリン/ストレプトマイシン（1％）+β β-メルカプトエタノール（0.1ミリモル）+塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF、摂食、10ng / mlの新鮮な追加）+アスコルビン酸（摂食、50μg/ mlの新鮮な追加された）。 </li><li>上清を吸引し、リプログラミング培地12ミリリットルで細胞を懸濁します。細胞懸濁液をウェルあたりピペットを2mlにフィーダー細胞の6ウェルプレート（セクション3で調製した）。室温で30分間、50×gでプレートを遠心する。 </li><li>成長のために加湿した37℃インキュベーター（5％O 2、5％CO 2、90％N 2）にプレートを置き。 IPSCコロニーは（1-2週間）に出現し始めるまで、一日おきにリプログラミングミディアムに変更します。 </li><li>準備したhESC培地：DMEM / F12 1：1 +ノックアウト血清代替（20％）+ペニシリン/ストレプトマイシン（1％）+ NEAA（1％）+非動物L-グルタミン（1mM）を+ピルビン酸ナトリウム（1％） +炭酸水素ナトリウム（0.12％）+βメルカプトエタノール（0.1 mM）の+のbFGF（給餌、10ng / mlの新鮮な追加） </li><li> HDAC阻害剤を準備します（給餌で​​新鮮な追加、100μM）酪酸ナトリウム、suberanilohydroxamic酸（SAHAは、200 nMの、給餌で新鮮な追加された）。 IPSCコロニーが出現したら、毎日培地を交換、hESCの培地+ HDAC阻害剤で細胞を供給し始める。 NOTE：ナトリウム酪酸プラスチックチューブに吸着する小分子であり、tはherefore 4℃でホウケイ酸ガラス管に入れて保管してください。 </li></ol> 5.切り分けIPSCクローン<ol><li> IPSCのコロニー（20-25細胞）を単離するのに十分な大きさになったら、P20ピペットでそれらを選ぶ。 </li><li> HDAC阻害剤の準備：酪酸ナトリウム（給餌、100μMで新鮮な追加された）を、SAHAは（摂食、200 nmで新鮮な追加） </li><li>のhESC培地+ HDAC阻害剤+クローニングとリカバリサプリメントを含む個々の35mm皿でiMEFs上に分離したコロニーを置きます。 </li><li>コロニーをピッキングした翌日には、ヒトES細胞培地+ HDAC阻害剤に培地を変更します。 </li><li> IPSCコロニーは継代のために準備が整うまで、毎日培地を変更してください。 </li><li>コロニーが継代2-3で安定いったん媒体からHDAC阻害剤を除去します。 </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Koche, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+expression+initiates+widespread+targeted+chromatin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).</li>
<li>Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+oncogenesis+by+chromosomal+insertion+of+gene+transfer+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors.</a> Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324 (5928), 797-801 (2009).</li>
<li>Hong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+induced+pluripotent+stem+cell+generation+by+the+p53-p21+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.</a> Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+replication+of+plasmids+derived+from+Epstein-Barr+virus+in+various+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells.</a> Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).</li>
<li>Ware, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+elicits+an+evolutionarily+conserved+self-renewal+program+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).</li>
<li>Azuara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+pluripotent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of pluripotent cell lines.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Embryonic+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.</a> Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).</li>
<li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors%3A+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。

このプロトコルを使用するときに成功したIPSCの生成のために、考慮すべきいくつかの重要な注意事項があります。偏差が目標前駆細胞集団の非効率的な刺激およびIPSCの生成の低い効率につながる可能性がある赤芽球の膨張段階で、培地交換スケジュールは厳密に従わなければならない。各培地交換新鮮デキサメタゾンで新しい増殖培地を作ることが重要である。そしてQBSF-60基本培地およびデキサメタゾンは、貯蔵中に光から保護されるべきである。ヌクレオ中、DPBS洗浄は広範な細胞死を生じる、アークヌクレオから電流が発生することがあり、細胞懸濁液から過剰の溶質を除去することが重要である。約10日後にヌクレオ、プレートはIPSCコロニーの外観のために毎日検査しなければならない。いくつかの小さなコロニーが存在していると、リプログラミング培地はprolongeとして（HDAC阻害剤で）のhESC中]に変更する必要があります血清に対するdの曝露は、自発的な分化を誘導することができる。 実験用のセットアップおよび使用可能なリソースに応じて、プロトコルへの変更が考えられる。低酸素状態は、IPSCの生成13</...

iPS細胞は、多能性遺伝子の最小限のセットの異所性発現を介して細胞組織から誘導される。この技術は、最初に非常に多能性状態1で表現されるOCT4、SOX2、KLF4、およびcMYCはヒト線維芽細胞のレトロウイルス形質導入によって実証された。これらの一時的に発現「再プログラミング因子」は、ヒト胚性幹細胞2に、標的細胞のエピジェネティックな風景や遺伝子発現プロファイルが類似して変更する。作成後は、性IPSCは、潜在的に、さらなる調査のための任意の組織型に分化させることができる。したがって、それらは、再生医療、疾患モデル、および遺伝子治療用途において使用するための有望。しかし、統合ウイルスのゲノムを破壊することは、内因性遺伝子発現、細胞の表現型の影響を変化させる可能性があり、最終的に科学的な結果にバイアスをかける。さらに、ランダムウイルス統合は有害な携帯電子につながる可能性悪性形質転換3または発癌導入遺伝子4の再発現の可能含めffects、。将来の臨床応用は、非組み込みIPSCの生成が必要になります。 染色体外環状DNA分子であるエピソーム、効果的なコストを発生させるための戦略を提供し、統合のないiPS細胞5。 表1に示したエピソームベクターの組み合わせは、再プログラミングは、OCT4、SOX2、KLF4、MYCL、およびLIN28A因子発現する。 pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-Fプラスミドは、細胞リプログラミング6を強化するため、TP53の一時的な抑制のためのp53 shRNAを含まれています。複製欠損pCXWB-EBNA1ベクターは、EBNA1式 7の一過性の増加を提供することで、初期化因子の増幅および増加初期化の効率を促進する。 pCXLE_EGFPプラスミドはDETEの目的のためにヌクレオ混合物に加えることができるトランスフェクション効率をrminingまたはセルソーティングアプリケーションに最適です。 p個のCXWB-EBNA1を除いて、このプロトコルで使用されるエピソームプラスミドは、宿主細胞の分裂8中エピソームの複製およびパーティションを媒介する、ウイルス複製およびEBNA1遺伝子のエプスタイン-バーウイルス起点を含む。エピソームは自然に連続したIPSC拡張7で失われます。サブクローニングおよびeGFP発現の損失から推測できるエピソームベクターの損失を有するiPS細胞の特徴付けは、将来の臨床応用のための完全に統合フリー性IPSCをもたらすことができる。 IPSCの生成のプロセスに固有の系統特異的遺伝子および多能性関連遺伝子の再活性化の抑制である。遺伝子発現の調節は、転写因子、調節DNAエレメント、およびRNAポリメラーゼのアクセスが対象とすることを可能にするDNAとクロマチンの修飾を含む、核内の複数のレベルで生じる遺伝子。グローバルクロマチン修飾を介したエピジェネティックな風景のリモデリングは、多能性遺伝的プログラムの再発現に重要なコンポーネントです。遺伝子発現の調節に重要である特定のクロマチン修飾は、ヒストンDNAコイルの減少緊張を通して遺伝子を標的とするためのアクセスを許可する特定のリジン残基でのヒストンのアセチル化である。 HDAC阻害剤は、アセチル化状態11を支持する可能性が、IPSCの再プログラミングおよびhESCの自己再生9,10を増強することが示されている小分子である。統合レンチ12を用いて、公開前から適合以下に記載されるプロトコルは、エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて、末梢血から最適化IPSCを生成するためのステップバイステップの方法を提供する。ここで使用されるHDAC阻害剤の濃度は、ウェアによって記載されたものの半分であるら 9、日常標準にわたって完全に再プログラムIPSCコロニーにおける2倍の増加につながっているHDAC阻害剤なしでエピソーム再プログラミングプロトコル。再プログラミングのこのレベルは、我々は、レンチウイルスの方法で観察する効率と同等である。このプロトコルを用いて、効率的に年齢87歳と同じくらい古い個人からのIPSCを生成した。

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-750</td> 4<td>°Cで保存してください。</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>4°Cで保管。</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>4°Cで保管</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>10437028-20°Cで保存。必要な場合までC。解凍、アリコート、4°Cで保管します。</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154938</td><td>室温で保存してください。</td></tr><tr><td>QBSF-60 無血清培地</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-983-234</td><td>4°Cで保存</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Life Technologies 15140122</td><td></td><td>4°Cで保存</td></tr><tr><td>Cell Line Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td> 4<td>°Cで保存します。</td></tr><tr><td>2%ゼラチン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td>4°Cで保存。C、37°Cで液化します。使用前のCウォーターバス。</td></tr><tr><td>ハンクスバランス生理食塩水(HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td>4°Cで保管します。</td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>4°Cで保存</td></tr><tr><td>Iscoveの変更されたDulbeccoの媒体(IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-061</td>は<td>4 &deg;Cで店。</td></tr><tr><td>L-グルタミン、200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>アリコート、-20°Cで凍結。</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸(NEAA)、100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>4°Cで保管。C、光から離れて。</td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12、1:1</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30023.02</td><td>4°Cで保存</td></tr><tr><td>ノックアウト血清交換</td><td>ライフ</td><td>テクノロジー10828-028</td><td>アリコート、-20°Cで凍結します。</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム、100 mM</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>4°Cで保存。</td></tr><tr><td>重曹、7.5%</td><td>Life Technologies</td><td>25080094</td><td>4°Cで保存。</td></tr><tr><td>基本的な線維芽細胞成長因子(bFGF)</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0263</td><td>DPBSに10 mg / mlのストックを作成し、分注し、-20°Cで凍結します。解凍後、4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887-1G</td><td>DPBSで2000倍ストック(400 mM)を製造し、分注し、-20°Cで凍結します。解凍後、4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>hES細胞クローニング&リカバリーサプリメント</td><td>ステムジェント</td><td>01-0014-500</td><td>-20°Cで販売。必要な場合までC。解凍後、4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>ESC認定のBDマトリゲル</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>35-4277</td>氷<td>上で4°Cで一晩解凍します。C、事前に冷却したピペットチップを使用して、事前に冷却したチューブに分注します。-20°Cで保管します。必要な場合までC。4°Cで解凍します。C、すぐに使用してください。</td></tr><tr><td>ステムスパンSFEM&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9650</td><td>アリコート、-20°Cで凍結します。</td></tr><tr><td>アスコルビン酸、粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403-100MG</td><td>DPBSに5 mg / mlのストックを作り、滅菌フィルター、4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>組換えヒト幹細胞因子(SCF)</td><td>R &Dシステム</td>ズ<td>255-SC-010</td><td>100 &mu;SFEMのg / mストック、アリコート、-20°Cで凍結します。解凍後、4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>組換えヒトインターロイキン3(IL-3)</td><td>R &Dシステム</td><td>ズ203-IL-010</td><td>100 &mu;SFEM中のg / mlストック、アリコート、-20°Cで凍結します。解凍後、4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>エリスロポエチン(EPO)</td><td>R&D Systems</td><td>287-TC-500</td><td>SFEMで1000 U/mlの在庫を作り、分注し、-20°Cで凍結します。解凍後、4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>組換えヒトインスリン様成長因子1(IGF-1)</td><td>R &Dシステム</td>ズ<td>291-G1-200</td><td>100 &mu;SFEM中のg / mlストック、アリコート、-20°Cで凍結します。解凍後、4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>DPBSで1000倍ストック(100 mM)を作ります。</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902-25MG</td><td>Make 50x stock (50 &mu;M)DPBSでは、滅菌フィルター、4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>SAHA(ボリノスタット)</td><td>ケイマンケミカル</td><td>149647-78-9</td><td>DPBSで2,000倍ストック(400 mM)を作り、分注し、-20°Cで凍結します。解凍後、4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>12ウェル組織培養プレート</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 円錐管</td><td>Sarstedt</td><td>62553002</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml エッペンドルフ管</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル組織培養プレート</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>35 mm ティスエ培養プレート</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 使い捨て血清ピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 使い捨て血清ピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-675-22</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 使い捨て血清ピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>13-675-17</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;l ピペットチップ、バリアチップ</td><td>Genessee</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>ピペットエイド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-681-15</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-EGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>pCXWB-EBNA1</td><td>Addgene</td><td>37624</td><td></td></tr></tbody></table>

エピソームおよびhdac阻害剤を用いて血液からの効率的なips細胞の生成

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

この原稿を効率的にエピソームプラスミドおよびヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤を用いて末梢血からの統合を含まないヒト誘導多能性幹細胞（iPS細胞）を作成するためのプロトコルを示す。このアプローチの利点は、（1）原料として、末梢血の最小量の使用。 （2）リプログラミングベクター非統合。 （3）ベクトルフリー性IPSCを生成するための費用効果的な方法。 （4）シングルトランスフェクション。 （5）小分子の使用は、エピジェネティックな再プログラミングを容易にする。簡単に述べると、末梢血単核細胞（PBMC）ルーチン瀉血サンプルから単離し、次いで、再プログラミングに著しく適している、高度に増殖性の赤血球前駆細胞集団を得た定義された成長因子の中で培養される。非統合、OCT4、SOX2、KLF4、MYCL、LIN28A、およびp53の短いヘアピン（SH）RNAを発現する非伝播エピソームのプラスミドはintroduですシングルクレオによって派生赤芽球へのced。強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現するエピソームの同時トランスフェクションは、トランスフェクションされた細胞の容易な同定を可能にする。エプスタイン-バー核抗原1（EBNA1）を発現する独立した複製欠損プラスミドはまた、エピソームのタンパク質の増大した発現のための反応混合物に添加される。トランスフェクションされた細胞は、その後の継続的再プログラミングのために照射したマウス胚性線維芽細胞（iMEFs）の層上にメッキされている。否やIPSC様コロニーはヌクレオ後約12日目に現れるように、HDAC阻害剤は、エピジェネティックなリモデリングを促進するために培地に添加される。我々は、HDAC阻害剤を含めることが日常的に2倍にすることによって完全に再プログラムIPSCコロニーの生成を増加させることを見出した。 IPSCのコロニーは典型的なヒト胚性幹細胞（hESCの）形態を示したら、それらを穏やかに継続的な成長および増殖のための個々のiMEFコーティングした組織培養プレートに移す。

三日後、およびヌクレオiMEFsにヌクレオフェクト細胞を播種する前に、成功したヌクレオの効率は、eGFPのために蛍光顕微鏡によって推定されるべきである。 図1のeGFPを発現する全細胞集団の約5〜10％の典型的なヌクレオ実験を示す。 再プログラムIPSCコロニーは約2週間後にヌクレオ表示されるようになります。コロニーが明確に定義された境界線を有するほぼ円形であり、高い核-細胞質比、（2）可視小体（ 図2、明視野）（1）小さい、密に詰まった細胞を含む特徴的なhESC形態によって同定することができる。不完全に再プログラムされた細胞が劣化したり、容易に真のIPSCコロニーとは区別される不均一な細胞塊を形成することになるのどちらか。 我々は完全に特徴づけるために選択した代表的な株のうち、すべては、sを表現tandard多能性マーカー（ 図2）、（図2）の内因性多能性遺伝子を再活性化、およびフォーム奇形腫NOD-SCIDマウスに注射した...

ここでは、再プログラミング戦略とヒス​​トンデアセチラーゼ阻害剤ベースのエピソームを用いて末梢血からのヒト人工多能性幹細胞を生成するためのプロトコルを記述している。

エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

次の実験の全体的な目標は、少量の末梢血から統合フリーの人工多能性幹細胞を生成することです。これは、分離された末梢血単核細胞を定義された成長因子で培養し、リプログラミングに非常に反応する赤血球前駆細胞集団を生成することによって達成されます。第2のステップとして、リプログラミング遺伝子を運ぶ非統合エピソームプラスミドが核の愛情によって赤芽細胞に導入され、リプログラミングプロセスを開始します。次に、核に罹患した細胞を照射したマウス胚性線維芽細胞の層に播種し、最終的に成功裏に継続的なリプログラミングを可能にします。再プログラムされた誘導多能性幹細胞コロニーは、その形態学的特性、アルカリホスファターゼ活性、多能性マーカーの陽性免疫化学、および内因性多能性遺伝子の発現に基づいて同定できます。ウイルスベースのリプログラミングのような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、このプロトコルが統合フリーIPSCの一貫した生成を保証することです。研究室の技術者 まず、DPBSで末梢血を1対1の比率で希釈します。次に、15ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブで、希釈した血液の7ミリリットルを3ミリリットルの室温のfi call hiパックに慎重に重ねます。サンプルを400 GSおよび室温で30分間分離した後、pbmcはプラズマとfialハイパックの間の曇った白い界面層に落ち着きます。滅菌トランスファーピペットを使用して、P BMCを15ミリリットルの円錐管に移し、新鮮なDPBSで容量を最大10ミリリットルにします。次に、細胞を数えた後、新しい15ミリリットルの円錐管に6つのP BMCに2回10を移し、残りの細胞をスピンダウンし、ペレット化された細胞を10%ジメチルスルホキシドを含む90%ウシ胎児血清中の6pbmc/ミリリットル濃度に2倍10で凍結します。次に、取っておいたP BMCsをスピンダウンした後、新たに調製した膨張培地の2ミリリットルでペレットを懸濁し、12ウェルの組織培養プレートの1つのウェルにプレートし、酸素5%、二酸化炭素5%、窒素90%の雰囲気で摂氏37度の加湿インキュベーターで細胞をインキュベートします。次に、3日目と6日目に、ウェルから細胞を採取して培地を交換します。2ミリリットルのQBSF 60でウェルを洗浄して残りの細胞を収集し、遠心分離によって細胞をペレット化し、次にペレットを2ミリリットルの新鮮な膨張培地に懸濁させます。その後、細胞を同じ12ウェルプレートに戻し、インキュベーションを続けます 9日目に、表に示されているように、リプログラミングプラスミドを滅菌済みの1.5ミリリットルのeinorチューブにピペットで移します。次に、核酸包接液を製造業者から提供されたサプリメントと混合し、混合物を滅菌済みの1.5ミリリットルのアップエンドDPHチューブに移します。次に、2ミリリットルの拡張培地を新しい12ウェルプレートの1つのウェルに分注し、加湿した摂氏37度のインキュベーターで培地を平衡化します。細胞を採取し、示したばかりのように細胞培養物をよく洗浄し、5ミリリットルのDPBSで細胞を洗浄します。その後、細胞ペレットを100マイクロリットルの核愛情溶液に加えて、気泡が発生しないように注意しながらサプリメントに懸濁し、細胞懸濁液をリプログラミングプラスミドを含むチューブに移します。ピペッティングで1回上下させて細胞を混合し、溶液全体を核愛情獣医の底に移します。次に、veteをNucle愛情マシンに入れ、プログラムT 0 1 9を実行します。次に、100マイクロリットルのEQUILIBRATED拡張培地を核愛情培地に加え、すぐにサンプル全体を収集して、白い浮遊死細胞の破片を避け、プレウォーム培地のウェルに沈殿させます。その後、10日目または11日目に細胞を加湿インキュベーターに戻します。6ウェル組織培養プレートの各ウェルをゼラチンでコーティングし、HBSS中の0.1%ゼラチン1ミリリットルでゼラチンでコーティングし、次いでプレートを加湿インキュベーターに入れるか、またはインキュベーション中に少なくとも5分間、1バイアルの解凍液を10回、6つの3000°C照射マウス、胚性、線維芽細胞、またはmesに10ミリリットルの予熱メス培地に移し、 次に、細胞がスピンダウンしている間に細胞を遠心分離します。6ウェルプレートからゼラチン溶液を吸引し、次いで12ミリリットルの新鮮な覚醒剤培地にメスを再懸濁する。すぐに2ミリリットルのOFMをゼラチンコーティングの各ウェルに分注します。.6。ウェルプレートをプレートし、プレートを加湿インキュベーターに12日目まで戻します。12日目に、ウェルから核影響を受けた細胞を1つの15ミリリットルの円錐管に収集し、ウェルを洗浄し、残りの細胞を収集することが実証されました。細胞をスピンダウンした後、新たに調製した12ミリリットルのリプログラミング培地にペレットを懸濁し、フィーダー細胞の各ウェルに2ミリリットルの細胞を分注します。次に、6ウェルプレートでプレートを75GSおよび室温で30分間遠心分離し、プレートを加湿インキュベーターに戻し、1〜2週間隔日で培地を交換します。誘導性多能性細胞コロニーが出現したら、核の愛情の3日後、およびプレーティングする前に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む新たに調製されたヒト胚性幹細胞培地を細胞に供給し始め、核は誘導性メスに影響を受けた細胞をプレーティングします。成功したNU核の愛情の効率は、蛍光顕微鏡法によって推定されるべきである 例えば、ここに示されているのは、EGFPを発現する全細胞集団の約5〜10%の典型的な核の愛情実験であり、再プログラムされた誘導性多能性幹細胞コロニーは、NUの核の愛情の約2週間後に現れ始める。コロニーは一般に、明確に定義された境界を持つ円形であり、核と細胞質の比率が高い小さな密集した細胞や、完全に特徴付けられた代表的な系統の可視核小体など、特徴的なヒト胚性幹細胞の形態によって識別できます。アルカリホスファターゼ活性が陽性の全ての検査は、標準的な多能性マーカーを発現し、一度習得すると内因性多能性遺伝子を再活性化します。この手法は、適切に実行すれば、4週間で統合フリーのIPSCを一貫して生成できます。この手順に続いて、あらゆる組織タイプに関する質問に答えるために、分化研究を実施することができます。

efficient-ips-cell-generation-from-blood-using-episomes-hdac

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

彼らは多能性のための標準的なテストを通過した時、誘導多能性幹細胞（IPSC）ラインを生成することはあっても発生能の異なる行が生成されます。ここでは、所有している完全な多能性としてIPSC行を定義性IPSC、から完全に由来するマウスを作製するためのプロトコルを記述する...

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

ここでは、単一のレンチウイルスベクターを用いたプログラミング末梢血の3-4...

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

ここでは、一貫性のある成果と効率向上を示しているセンダイウイルスと導入遺伝子のない人間性IPSCにヒト体細胞を再プログラムする当社の確立された手法を提案する。...

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

誘導多能性幹細胞（iPS細胞）が臨床応用および基礎研究のための患者特有の組織のソースを表します。ここでは、非組み込みエピソームプラスミドを用いてウイルスを含まないiPS細胞に凍結バフィーコートから得たヒト末梢血単核細胞（PBMNCs）を再プログラムするために詳細なプロトコルを提示します。...

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

末梢血単核細胞(PBMC)を人工多能性幹細胞(iPSC)に再プログラミングするためのプロトコルを提案します。形質導入した血液細胞をマトリックスコーティングプレートに遠心分離で播種することにより、浮遊細胞からiPS細胞を成功裏に誘導します。この技術は、PBMCやCBMCなどの細胞に対するシンプルで効果的なリプログラミングプロトコルを示唆しています。...

センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

このプロトコルは、ヒトの成人末梢血細胞から統合フリーのiPS細胞を効率的に生成するための詳細な方法を説明しています。4つのoriP/EBNAベースのエピソームベクターを使用してリプログラミング因子(KLF4、MYC、BCL-XL、またはOCT4およびSOX2)を発現させることで、1...

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

これは修正の CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins を用いた編集が続いてプロトコル記述フィーダー無料条件で人間の膵臓の細胞からフット プリント無料誘導多能性幹細胞 (Ips)...

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

このプロトコルは、血球性幹および前駆細胞を生成する転写因子GATA2、GFI1BおよびFOSの強制発現によるヒト皮膚線維芽細胞における血球形成プログラムの誘導を示す。...

転写因子の強制発現によるヒト線維芽細胞のヘモジェニックリプログラミング

細胞リプログラミングでは、多能性細胞状態を調節し維持する主要遺伝子の導入が必要です。記載されたプロトコルは、ウイルス/統合方法なしでヒト皮膚線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞(iPSC)コロニーの形成を可能にするが、非修飾RNA(NM-RNA)を免疫回避因子と組み合わせて細胞防御機構を低下させる。...

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

現在のプロトコルでは、製造元の指示に従って再プログラムが困難な患者の末梢血単核細胞(PBMC)から誘導多能性幹細胞(iPSC)を誘導するトラブルシューティング手順が詳細に記載されています。このプロトコルは凍結バフィー被毛サンプルに特有ですが、精製PBMCの再プログラミングにも適用されることがあります。...

凍結バフィーコートサンプルからの誘導多能性幹細胞株の再プログラミング

学ぶエピソームベースの非統合型iPS細胞生成法。末梢血単核球を培養し、HDAC阻害剤と共にエリスロブラストへ nucleofection して再プログラミング効率を高め、統合リスクのないiPS細胞を樹立する技術です。

エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

さらに動画を探す