ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

המטרה הכוללת של פרוטוקול דיסקציה מוחית זה של דרוזופילה היא להשיג מוחות שלמים מזבובים בוגרים שניתן להשתמש בהם במגוון רחב של יישומים, כגון אימונופלואורסצנטיות, לוקליזציה של חלבונים מתויגים GFP וניסויי תרבות ex-vivo. שיטה זו יכולה לסייע לנו לענות על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית ומדעי המוח, כמו למשל התפקידים של חלבונים ומסלולי איתות ספציפיים וביסוס דפוסים של קישוריות עצבית במהלך התפתחות המוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שברגע ששולטים בה, היא מספקת שיטה מהירה ויעילה לזיהוי אימונולוגי של פגמים מורפולוגיים באזורים ספציפיים במוח הבוגר.

הליך זה יכול להיות קשה ללמידה, מכיוון שהסרת השלד החיצוני מראש הזבוב יכולה לדרוש טיפול ותרגול רב. התנועות שלך חייבות להיות איטיות ומכוונות, וזרועות הדיסקטור חייבות להיות נתמכות היטב כדי להישאר יציבות. זה רעיון טוב להתאמן על זבובים אדומי עיניים ולאחר מכן על זבובים לבני עיניים לפני שמנתחים למעשה גנוטיפים מעניינים לניסויים אמיתיים.

כדי להתכונן לדיסקציה, הניחו את הזבובים המורדמים המעניינים על כרית מתכת קרה או בצלחת פטרי שיושבת על קרח. לחלופין, השתמש בכרית זבוב הפולטת פחמן דו חמצני. לאחר מכן, הניחו כמות קטנה של PTN במרכז צלחת החיתוך כדי ליצור בועה של PTN.

לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאו, מלא את שדה הראייה בבועת PTN בתאורה אחידה. כעת, תפעל זבובים כך שהם יהיו בבטן למעלה, והעביר אחד מהבטן לתוך ה-PTN. טבלו לחלוטין את החיה ב-PTN, ובצעו את כל הנתיחה שקועה ב-PTN.

בעזרת זוג מלקחיים שני, אחוז בחוטם ומשוך את הראש מהגוף. מדי פעם, הפרובוסקיס יוסר, אך הראש יישאר מחובר לגוף. אם זה קורה, תפוס את הקצה המדיאלי של רשתית אחת והפעל כוח רוחבי כדי להסיר את הראש.

השליכו את הבטן ובית החזה. זה קריטי לשמור על הראש ב-PTN במהלך שלב זה. ברור שלא ניתן לנתח קשרים מהמוח המרכזי ל-VNC בשיטה זו.

לאחר מכן, אחוז בקצה המדיאלי של הרשתית השמאלית בקצה החור המרכזי בציפורן ומשוך לאט את המלקחיים ישירות זה מזה כדי למנוע קריעה של האונה האופטית, שהיא המבנה האטום המכוסה בקנה הנשימה הלבן והמיתרי. ככל שהרשתית מתנתקת, תהיה ירידה קלה במתח. על מנת למנוע מהמוח להיקרע, חשוב מאוד לתפוס את הקצה המדיאלי של כל עין ולמשוך לאט מאוד את המלקחיים.

תנועה מהירה מדי עלולה לגרום לשינוי במורפולוגיה של המוח או לנזק לרקמת המוח. כפי שמוצג כאן, אחוז בציפורן עם כל זוג מלקחיים ומשוך אותם לאט מאוד לכיוונים מנוגדים. אם עושים זאת נכון, הקוטיקולה צריכה להיפרד מרקמת המוח, ולהשאיר את המוח שלם.

יש צורך במלקחיים חדים מאוד לשלב זה. לאחר מכן, הסר בזהירות את הציפורן שמסביב חתיכה אחר חתיכה. בזמן הסרת קוטיקולה המחוברת בעקשנות, זה יכול לעזור לאבטח את המוח על ידי אחיזה ב-VNC שנותר כדי להימנע מריסוק המוח.

לבסוף, השתמשו בפיפטה P200 כדי להעביר את המוחות המנותחים לבאר של צלחת מלאה ב-PTN לקיבוע וצביעה חיסונית. תחת המיקרוסקופ, השתמש בפיפטה P200 כדי להעביר 10 עד 15 מוחות מנותחים מאותו גנוטיפ לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר מלא ב-4% פרפורמלדהיד מדולל ב-PTN. לאחר מכן, דגרו על המוחות למשך 20 דקות עם נדנוד איטי בטמפרטורת החדר.

לאחר הקיבוע, אפשרו למוח להתיישב בתחתית הצינור, ואז הסירו את הקיבוע. לאחר מכן, בצע שתי כביסות מהירות עם 500 מיקרוליטר PTN לכל כביסה. החלף את ה-PTN ברגע שהמוח מתיישב בצינור.

לאחר מכן, בצע שלוש כביסות ארוכות עם PTN באמצעות תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפות אלה, המוחות עשויים להיות מאוחסנים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס ב-PTN. לאחר הסרת שטיפת ה- PTN האחרונה, דגרו את המוח ב 0.5 מיליליטר של תמיסת חסימה למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר, ובתסיסה עדינה.

לאחר הסרת התמיסה החוסמת, הוסיפו את הנוגדנים העיקריים המדוללים בתמיסת החסימה, ודגרו על המוח בארבע מעלות צלזיוס למשך יומיים בערבול עדין. הסר את הנוגדן העיקרי באמצעות גדוד הכביסה PTN בן חמש הכביסה. ולאחר מכן, החל את הנוגדנים המשניים.

אפשר לנוגדנים אלה לדגור עם הרקמות במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר כשהם מוגנים מאור עם נדנדה. לאחר דגירה של מוחות בתמיסת הנוגדנים המשנית, יש למרוח את גדוד שטיפת ה-PTN. מכסים את הדגימות בנייר כסף לאחר כל שטיפה, ומסיימים על ידי הסרת כמה שיותר חיץ.

לאחר מכן, הוסף 75 מיקרוליטר של מדיום הרכבה פלואורסצנטי נגד דהייה, והזרים את המוח והמדיום פנימה והחוצה מקצה הפיפטה פעם אחת בלבד. לאחר מכן ניתן לעטוף את הצינור בנייר כסף ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס למשך מספר ימים, אך באופן אידיאלי, המשך ישירות בהרכבה. כדי להרכיב את המוח, בנה מגלשת גשר.

מקם שתי החלקות כיסוי בסיס במרחק של כסנטימטר אחד זה מזה על מגלשה טעונה חיובית. ודא שהצד הטעון חיובי פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הדביקו את החלקות הכיסוי לשקופית עם לק ציפורניים, ותנו ללק להתייבש לחלוטין לפני שתמשיכו.

לאחר מכן, הנח את השקופית מתחת למיקרוסקופ סטריאו, והכניס מוחות פיפטה ומדיום לתוך הרווח שבין החלקות הכיסוי. הקפד להתאים את התאורה כדי לשפר את ההדמיה של המוח. לאחר מכן, שאפו את אמצעי ההרכבה הנוספים מהשקופית, והקפידו להימנע מהמוח.

לאחר מכן, נדפו את אמצעי ההרכבה העודפים שנותרו. זה יאפשר למקם את המוחות בצורה מדויקת יותר. כעת, באמצעות מלקחיים, כוונו את המוחות לתבנית רשת, כאשר אונות האנטנות שלהם פונות כלפי מעלה.

לאחר מכן, הנח החלקת כיסוי על המוח, והשתמש בלק כדי לאטום את הקצוות של החלקת הכיסוי העליון המחוברים להחלקות כיסוי הבסיס. כעת, טען את החלל המרכזי באמצעי הרכבה טריים בצורת טיפה, מה שמאפשר למשוך את המדיה מתחת להחלקת הכיסוי על ידי פעולה נימית. כאשר החלל מתמלא, אטמו אותו לחלוטין באמצעות לק שקוף.

השיטה המתוארת יכולה לשמש כדי לדמיין כמעט כל מבנה במוח הבוגר, כולל גופי הפטריות. אזור זה במוח נדרש ללמידה ולזיכרון. ניתן לדמיין בקלות את גופי הפטריות באמצעות נוגדנים המזהים את חלבון הפאסיקולין 2.

חלבון זה מתבטא מאוד באונות האלפא והבטא, כמו גם בגוף האליפסואיד הממוקם במרכז. טכניקה זו אפשרה זיהוי של תהליכים תאיים מרובים הנדרשים להנחיה נכונה של אקסונים של נוירונים בגוף הפטריות. שיבוש בתהליכים אלה גורם למגוון רחב של פנוטיפים מוטנטיים, כגון הקרנה לא מתאימה של אקסונים על פני אזור קו האמצע של המוח ואונות אלפא חסרות.

פנוטיפים מוטנטיים אלה הם לרוב חודרים באופן חלקי, ולכן דורשים בדיקה של מוחות מרובים. על מנת לבחון את התפקיד האוטונומי של חלבון במציאת נתיב אקסון, ניתן להשתמש בטכניקת מרקהם גם כדי להמחיש החלטות הנחיית אקסונים של נוירונים מוטנטיים חיוביים GFP או מסוג פרא על רקע לא פלואורסצנטי. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה אמינה וניתנת לשחזור של אזור וירטואלי במוח הדרוזופילה הבוגר.

כאן, התמקדנו בתאי העצב של גוף הפטרייה. בגרסת הטקסט של פרוטוקול זה, הדגמנו גם הדמיה של האונות האופטיות. מחקרים אחרים השתמשו בטכניקות דומות כדי להמחיש את נוירוני ההקרנה של ה-pars intercerebralis, נוירוני השעון ונוירוני הקרנת אונת האנטנה, בין רבים אחרים.

לאחר שליטה, ניתן לנתח כל מוח תוך 3 עד 5 דקות, אם הוא מבוצע כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לייצב את הידיים ליד המיקרוסקופ. חשוב גם לנוע לאט, ולהסיר חתיכות קטנות של הקוטיקולה אחת בכל פעם.

תנועה מהירה מדי עלולה לגרום לנזק לא רצוי לרקמת המוח הבסיסית. בנוסף לשימוש במוחות מנותחים לניסויי מיקרוסקופיה מבוססי אימונופלואורסצנטיות, רקמת מוח יכולה לשמש גם לניסויים נוספים.