تصوير بكتريا السل في الفئران مع "مراسل إنزيم الأسفار"

الهدف العام من إجراء التصوير الفلوري بإنزيم المراسل هذا هو تسهيل الكشف الحساس والمحدد عن المتفطرة السلية في النماذج الحيوانية قبل السريرية للتسبب في المرض والعلاجات وأبحاث اللقاحات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال السل بما في ذلك آليات ضراوة الأنواع البكتيرية بالإضافة إلى إنشاء العلاجات وفهم اللقاحات. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتصوير نفس المجموعة من في نقاط زمنية متعددة.

هذا يقلل بشكل كبير من التكلفة ، ويسمح لنا بدراسة تفاعلات مسببات الأمراض المضيفة ، ويزيد أيضا من القوة الإحصائية لأنه يمكن الحفاظ على عدد أكبر من بسهولة في نفس الوقت. للبدء ، قم بتنمية أي بكتيريا M.tuberculosis في وسط MOADCTW عند 37 درجة مئوية إلى كثافة بصرية تبلغ 0.5 تقاس ب 600 نانومتر. يجب إجراء جميع الإجراءات التي تنطوي على التلاعب بالمواد المعدية داخل خزانات السلامة البيولوجية أو غيرها من أجهزة الاحتواء المادية المعتمدة.

بمجرد أن تصبح جاهزا ، قم بعمل سلسلة من واحد إلى 10 تخفيفات للثقافة في نفس الوسط. بعد ذلك ، قم بوضع التخفيفات ثلاث نسخ على ألواح 7H11 انتقائية لإجراء تحديد دقيق ل CFU. احتضان الصفائح لمدة أربعة أسابيع عند 37 درجة مئوية أو حتى يمكن حساب المستعمرات بدقة لتحديد CFU.

قبل إعداد التلقيح ، تأكد دائما من أن غطاء السلامة الحيوية يتدفق الهواء بسرعة 50 لترا في الدقيقة. لتحضير لقاح يمكن أن يصيب ما يصل إلى 90 الفئران ، قم بقياس CFU المطلوب في أنبوب صقر سعة 15 ملليلترا. بين 10, 000 و 1 وعادة ما تستخدم مليون وحدة تشكيل مستعمر.

ثم بيليه البكتيريا. بعد ذلك ، اغسل البكتيريا مرة واحدة ب 10 مل من المحلول الملحي. ثم علقها في 15 مللي من المحلول الملحي.

ثم في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتحميل اللقاح في وعاء زجاجي يمكن توصيله ببخاخات. بعد ذلك ، قم بتوصيل وحدة البخاخات واضبط أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ العمودي بحيث يكون الطرف السفلي حوالي ربع بوصة أسفل الغضروف المفصلي للتعليق. الآن انقل المجموعة إلى غرفة التلقيح في حاوية نقل مانعة للتسرب.

للمضي قدما ، قم بتحميل ذات الوزن المعروف في غرفة التلقيح التي تعمل بالطاقة. يمكن أن تتسع الغرفة لما يصل إلى 90 فأرا. ثم أغلق جميع المزالج الموجودة على الباب.

بعد ذلك ، قم بتوصيل البخاخات باستخدام مشبك فولاذي. ثم اضغط على زر البدء في الغرفة. واضبط معدل تدفق الهواء على ما بين ثلاثة وخمسة لترات في الدقيقة.

سوف يتدفق الهواء المضغوط بحوالي 22 إلى 26 رطلا لكل بوصة مربعة ، والأهم من ذلك أنه يجب أن يكون من الممكن رؤية ضباب اللقاح في الغرفة. بعد 15 دقيقة ، سيظهر ضوء أحمر في مقدمة لوحة التحكم وستشير إشارة مسموعة إلى نهاية التشغيل. ثم اضغط على زر إعادة الضبط لإعادة ضبط المؤقتات.

لتحرير الفراغ ، اضغط على الزر الأحمر الصغير الموجود على باب الغرفة. ثم افتح باب الغرفة وأعد الفئران إلى أقفاص منزلها. من الآن فصاعدا ، احتفظ بالحيوانات في غرفة الاحتواء.

بعد ذلك ، أعد البرطمان وحاوية النقل إلى خزانة السلامة الحيوية. هناك ، تخلص من المعلق البكتيري المتبقي في حاوية نفايات مخصصة. ثم ضع جرة البخاخات المستخدمة داخل كيس بيولوجي وأغلق الكيس لنقله إلى الأوتوكلاف.

لتنظيف الغرفة ، رش الأسطح الداخلية بالفينول المخزن و 70٪ الإيثانول. اسمح لهذه المحاليل بالتفاعل على تلك الأسطح لمدة 10 دقائق. ثم امسحها جيدا.

تخلص من جميع المناديل المبللة في سلة المهملات البيولوجية. ثم قم بتعقيم سلة المهملات وحاوية النفايات والجرار البخاخات المستخدمة. انقل إلى غرفة التصوير.

هناك ، قم بتخدير وفقا لبروتوكول النص وحقنه بركيزة التباين عن طريق الحقن داخل الصفاق. في برنامج أنظمة التصوير ، قم بتهيئة النظام وتابع عندما يتحول شريط درجة الحرارة إلى اللون الأخضر. بعد تهيئة النظام ، ضع الماوس في غرفة التصوير.

تأكد من وجود فتحات الأنف داخل مخروط الأنف حتى يتلقى مخدرا أثناء التصوير. عد الآن إلى الكمبيوتر. في لوحة التحكم في الاستحواذ ، حدد إما التألق ، أو الإضاءة الانتقالية ، لتصور بالكامل ، أو إضاءة epi لعرض أنسجة الرئة.

بالنسبة لماوس واحد، اضبط مجال الرؤية على B ومستوى المصباح على مرتفع. للتعريض الضوئي ، استخدم الوقت التلقائي ، والتجميع المتوسط ، واثنين أو ثلاثة ل F / Stop. ثم اضبط مرشح الإثارة على 745 نانومتر ومرشحات الانبعاث من 780 إلى 840 نانومتر.

بعد ذلك ، انتقل إلى إعداد التسلسل وحدد من تسع إلى 12 نقطة إضاءة في منطقة الاهتمام. الآن اضغط على زر الحصول لجمع الصور. يتم تغطية تحليل الصور في بروتوكول النص.

لتحليل مدى العدوى ، قتل الفأر باستخدام بنتوباربيتال الصوديوم. تأكد من التحقق من وجود رد فعل دواسة للتأكد من القتل الرحيم للحيوان. ثم زرع الرئتين باستخدام تشريح قياسي.

بعد ذلك ، قم بتجانس أنسجة الرئة في مليلتر واحد من PBS. ثم قم بعمل تخفيف تسلسلي بمقدار عشرة أضعاف للتجانس باستخدام PBS. قم بوضع التجانس المخفف في ثلاث نسخ واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية حتى يمكن عد المستعمرات.

ثم استخدم درجة CFU لقياس شدة العدوى. تم التعامل مع الفئران كما هو موصوف. تم استخدام ركيزة REF لعرض تطور مرض السل.

تم قياس التألق باستخدام الإضاءة. وزادت من الأسبوع الثاني إلى الأسبوع السادس في الفئران المصابة. يمكن أن يعزى الانخفاض الطفيف في الإشارة في الفئران الضابطة إلى الزيادة في كتلة الجسم وحجمه خلال فترة الستة أسابيع.

تم إعادة بناء 3D FLIT لمصادر التألق من نقاط إضاءة متعددة باستخدام نفس الإثارة وسلسلة مرشحات الانبعاثات. تم عمل خرائط كفاءة NTF للتحقق من جودة إعادة الإعمار. تم تطبيع الصورة المأخوذة من مرشاح الإثارة المحدد إلى صورة الإرسال المصنوعة بنفس مرشاح البث ومرشاح الإثارة المفتوح.

يوفر هذا إشارة تنتجها الركيزة وحدها. لم يكن هناك أي خطأ تقريبا في إعادة الإعمار. أظهر فحص كفاءة NTF للبيانات في كل من العرض الأفقي والرأسي ارتباطا وثيقا.

وبالتالي ، كان لإعادة البناء ثلاثية الأبعاد يحتوي على عدد قليل من القطع الأثرية ، وتحسين توطين الإشارة ، وتحسين الحساسية على الطرق الأخرى. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال السل لاستكشاف الكفاءة العلاجية للأدوية ضد المتفطرة السلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إصابة الفئران عبر طريق الهباء الجوي بالمتفطرة السلية مع متابعة التصوير البصري باستخدام ركيزة REF.