Captação de Metal essencial em bactérias Gram-negativas: fluorescência, radioisótopos, um raio-x e fracionamento da pilha

O objetivo geral desta técnica é extrair o conteúdo periplasmático bacteriano por fracionamento celular para caracterização biofísica, incluindo fluorescência de raios-x, cristalografia de raios-x e captação de radiometais. Este método pode nos ajudar a entender as principais relações biológicas, incluindo relações estrutura-função dos sistemas de transporte ABC e como eles reconhecem seus substratos, especificamente, e os transportam para dentro da célula através da bicamada lipídica. A principal vantagem dessa técnica é avaliar separadamente o conteúdo celular e extrair proteína de seu ambiente nativo com o mínimo de contaminação cruzada.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez enquanto tentávamos remover o substrato YfeA, percebendo que, em vez de usar uma abordagem artificial, poderíamos usar a célula para produzir proteína apo. Além de fornecer informações sobre a ligação e o transporte do substrato através dos compartimentos das células bacterianas, métodos como este ensaio de radiotraçador se aplicam a sistemas eucarióticos, que também possuem técnicas robustas de fracionamento. Primeiro, descongele uma ressuspensão de subcultura bacteriana previamente preparada a quatro graus Celsius.

Em seguida, pulverize as células descongeladas a 4.000 vezes a gravidade por 20 minutos a 4 graus Celsius. Em seguida, ressuspenda as células em 50 mililitros de tampão com alto teor de sal gelado, aspirando com uma pipeta automatizada e uma ponta de 25 mililitros. Incube a suspensão sobre gelo por 20 minutos com inversão ocasional para misturar.

Após a incubação, pulverize as células a 4.500 vezes a gravidade por 20 minutos a 4 graus Celsius. Ressuspenda as células em 15 mililitros de tampão com baixo teor de sal gelado aspirando com uma pipeta automatizada e uma ponta de 25 mililitros. Em seguida, incube a suspensão sobre gelo por 20 minutos com inversão ocasional para misturar.

O choque osmótico rompe a membrana externa gram-negativa, após uma queda repentina na concentração de sal ambiental. O manuseio cuidadoso das células é crucial para evitar a instigação de rupturas indesejadas da membrana interna, a contaminação cruzada do citoplasma do periplasma e a desestabilização ou agregação das proteínas do periplasma liberadas. Em seguida, faça a pelota dos esferoplastos a 4.500 vezes a gravidade por 20 minutos a 4 graus Celsius.

Em seguida, recupere o sobrenadante que contém o periplasma. Ressuspenda os esferoplastos peletizados em solução salina tamponada com fosfato, aspirando com uma pipeta automatizada e uma ponta de 25 mililitros. Em seguida, lise as células por três ciclos de uma prensa de célula de pressão francesa a 1.500 psi.

Agora, atire os detritos celulares a 50.000 vezes a gravidade por 20 minutos a 4 graus Celsius. Recupere o sobrenadante que contém o citoplasma. Após o fracionamento e purificação da fração periplasmática, misture 1,5 microlitros da proteína purificada com PEG 4000, cloreto de sódio, tampão Bis-Tris e azida de sódio em uma configuração de gota sentada ou suspensa por aspiração com uma pipeta e uma ponta de 10 microlitros.

Incube as gotas de cristalização a 293 Kelvin por duas a quatro semanas. Após a incubação, colha os cristais e congele-os rapidamente em uma piscina de nitrogênio líquido para envio no síncrotron. Para análise de fluorescência de raios X, mova a amostra para fora do feixe e navegue até a guia Hutch no software.

Use o subtítulo Energia para definir a energia para 10 quiloelétron-volts. Em seguida, mova a amostra de volta para o feixe e navegue até a guia Digitalizar. Navegue até a guia Interativa.

Selecione Otimizar sinal de fluorescência. Insira quatro segundos no subtítulo Tempo e selecione Obter espectro de fluorescência. O espectro é plotado automaticamente para visualização na guia Plotar.

Elementos de interesse podem ser selecionados para orientar a análise das regiões de energia correspondentes aos seus picos de emissão. Para análise de absorção de energia de metal, mova a amostra para fora do feixe. Navegue até a guia Digitalizar e, em seguida, navegue até a guia Tabela periódica e selecione a borda K dos elementos de interesse.

Em seguida, navegue até a guia Hutch. Use o subtítulo Energia para definir a energia para o valor na etapa anterior nos quiloelétron-volts. Mova a amostra para o feixe.

Navegue até a guia Digitalizar. Navegue até a guia Automático e insira dois segundos no subtítulo Tempo. Agora, selecione Iniciar varredura e visualize a varredura MAD usando a guia Plotar e selecione varredura de borda para determinar a borda de absorção de energia.

Em seguida, selecione concluído com a fluorescência. Depois de preparar a subcultura com o marcador radioativo, alíquota de um mililitro em tubos de centrífuga individuais de 1,5 mililitro por aspiração com uma pipeta e uma ponta de um mililitro. Deixe de lado os três padrões de replicação.

Você não precisará deles novamente até o final do experimento. Coloque os tubos restantes em um ThermoMixer a 37 graus Celsius e vórtice de uma só vez a gravidade. Após a incubação, centrifugue os tubos a 15.000 vezes a gravidade por 30 segundos usando uma centrífuga de bancada, de preferência resfriada a 4 graus Celsius.

Depois de descartar os sobrenadantes, ressuspenda as células em um mililitro de tampão com alto teor de sal gelado aspirando com uma pipeta e uma ponta de um mililitro e coloque imediatamente no gelo por 20 minutos. Após a centrifugação, ressuspenda as células em tampão com baixo teor de sal gelado aspirando com uma pipeta e uma ponta de um mililitro e incube no gelo por 20 minutos. Depois de peletizar as células a 15.000 vezes a gravidade por 30 segundos, colete cada um dos sobrenadantes em novos tubos de centrífuga de 1,5 mililitro.

Medir a radioatividade em cada fração e padrão. Use a quantidade de radioatividade nos padrões para determinar a quantidade total de radioatividade originalmente adicionada a cada amostra. Foram coletados cromatogramas de filtração em gel e gel SDS-PAGE para avaliar a qualidade da purificação de proteínas a partir do fracionamento preparativo de periplasma.

Um gradiente de eluição de liner para cromatografia de troca aniônica melhora significativamente o enriquecimento de YfeA de 8% da fração periplasmática para 49% do produto de troca aniônica. Esta composição é melhorada para 61% por filtração em gel e os volumes de eluição da proteína apo e da proteína holo são idênticos. Apo purificado e holo YfeA cristalizam nas mesmas condições de cristalização, embora imagens de morfologias de cristal apo e holo YfeA mostrem diferenças no crescimento do cristal entre os estados apo e holo YfeA.

Dado que o zinco é o substrato primário ligado ao YfeA recombinante, os espectros de fluorescência de raios-x podem diferenciar entre uma amostra contendo um forte sinal de zinco compatível com holo YfeA que é indicativo de contaminação cruzada ou um sinal de zinco mais fraco sugestivo de apo YfeA e contaminação cruzada mínima. Um instantâneo de 60 minutos do fracionamento da captação de metais radioativos comparando as frações periplasmáticas e citoplasmáticas de células E.coli que expressam apenas YfeA, o transportador YfeABCDE completo e nenhum dos componentes YfeABCDE revela as consequências da expressão de uma única proteína recombinante ou complexo proteico na absorção do metal. Uma vez dominado, o compartimento periplasmático pode ser extraído de células inteiras por fracionamento.

A proteína ainda purificada por cromatografia e a proteína de interesse na cristalização cai em aproximadamente quatro horas e 30 minutos quando os procedimentos são realizados adequadamente. Ao tentar o procedimento de fracionamento e purificação, é importante manter a amostra sobre gelo durante o fracionamento e a 4 graus Celsius durante a purificação. Essas condições melhorarão a qualidade do fracionamento e a estabilidade da proteína purificada.

Seguindo este procedimento, outros metais podem ser introduzidos, como cobre ou gálio, para medir a inibição competitiva ou as taxas de transporte de substratos não canônicos e para responder a perguntas adicionais sobre a especificidade do substrato e os principais aminoácidos funcionais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fracionar células de E.coli e realizar análises biofísicas do conteúdo de um compartimento celular, como o periplasma, sem contaminação do citoplasma. Não se esqueça de que trabalhar com radioatividade pode ser extremamente perigoso e precauções, como gerenciamento adequado de resíduos e uso mínimo de reagente radioativo, devem sempre ser consideradas ao realizar este procedimento.