Chemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Масс-спектрометрии-управляемый геном добычи в качестве инструмента для выявления новых природных продуктов
Chapters
Summary March 12th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Здесь создан и описан протокол добычи генома, направленного масс-спектрометрией. Он основан на информации о последовательности генома и анализе LC-MS/MS и направлен на облегчение идентификации молекул из сложных микробных и растительных экстрактов.
Transcript
Секвенирование всего генома, добыча генома и молекулярные сети составляют основу для руководства по масс-спектрометрии, которое мы описываем здесь. И самый современный подход в открытии натурального продукта. Добыча генома и молекулярные сети совпадают в кластере, в закодированных аннотациях в секвенировании всего генома с химическими подписями реструктуризации из сырых экстрактов, обеспечивающих огромные перспективы для обнаружения пупка активными молекулами.
В принципе, добыча генома нацелена на одну или небольшую группу молекул за эксперимент. Таким образом приводящ к в медленном тарифе открытия. В этом смысле использование генома наряду с молекулярными сетями представляет собой важный шаг вперед в исследовании натуральных продуктов.
Массовая спектрометрия руководство-геном добычи является универсальным методом, который может структурировать информацию о нескольких химиотипов, содержащихся в большом количестве данных из сырой экстракт одновременно. Сегодня это высокий диапазон методологии, способной исследовать бактериальные, грибковые или растений последовательности предоставления. Химиотип генотипа и генотипа к биоинформатике хемотипа связывает биосинтетические кластеры и являются продуктами малых молекул.
Слух протокол продемонстрировано, чтобы охарактеризовать пупка глубины цикла Пептид продукты, наблюдаемые в метаболических экстрактов стрептомице видов. Но это применимо к грибковой и растений последовательности и экстрактов, а также. Очень важно иметь хорошо куратором набора данных генома и в настоящее время фрагментированные последовательности проекта все чаще вытесняются почти готовыми данными последовательности.
Кроме того, были разработаны различные стратегии доступа к новым биологически активным натуральным продуктам и, безусловно, их объединения с подходом MS-Guide. Мы поведим к улучшению изоляции натуральных продуктов и структурного выяснения. Поскольку здесь мы соединяем генотип с подходом к хемотипу, биоинформатические связи между биосинтезными кластерами и небольшими молекулами имеют решающее значение.
для оценки разнообразия и класса соединений и кодирования генома. Что означает репликацию. Позже кластеризация на основе сходства ионов может быть предварительно формирована с помощью GNPS.
Демонстрация процедуры будет д-р Рената Сигрист и профессор Angolini моих сотрудников в этом исследовании. Для получения в силико информации о вторичном метаболизме генные кластеры аннотации из полной последовательности генома. Отправить файл последовательности, банк генов E-M-B-L или более быстрый формат, на платформу против разгрома.
Так же, как генные кластеры, представляющие интерес из выходных данных, основанных на наиболее похожих известных кластеров. Основываясь на информации о последовательности ДНК BGC, проектные праймериз от 20 до 25 нуклеотидов, обрамляющих генное скопление для эколи стрептомики. Искусственный скрининг библиотеки хромосом.
После получения рекомбинантного гетеролога организма согласно рукописи, привить одну сотую штамма прекультуры в соответствующих средствах брожения. Такие как жидкие средства isP2. Поместите культуру на инкубатор при 30 градусах Цельсия и 220 об/мин, в течение семи дней.
После прививки центрифуга культур в 2200 раз G в течение 10 минут. Отбросьте клетки и перенесите супернатант в сепаральную воронку. Добавить один к одному объему этилового ацетата и встряхнуть.
Подождите от одной до трех минут для органических и согласился слоев отделить. И собирать органический слой в колбе Эрленмайера. Для получения данных MS/MS.
Программа подходящих методов HPLC и масс-спектрометрии с использованием программного обеспечения управления. Следует отметить, что сеть MS/MS является обнаруживаемой молекулярной сетью в данных массовых спектрометрических условиях. Преобразование спектра массы в формат mzXML с помощью MS Convert из мастера protea.
Отрегулируйте параметры ввода для преобразования. Загрузите преобразованные файлы LC-MS/MS в базу данных GNPS. Доступны два варианта.
Использование протокола передачи файлов или непосредственно в браузере через онлайн-платформу. После создания учетной записи в GNPS войдите в созданную учетную запись и выберите создание молекулярной сети. Добавьте должность.
Для выполнения основных опций. Выберите файлы mzXML для выполнения молекулярной сети. Организуйте их в шести группах.
Так как библиотеки для деепликации рутины. Выберите толерантность к массе ионов прекурсора и фрагмент Da на массовой толерантности 0.02 Dalton и 0.05 Dalton соответственно. Для выполнения расширенных сетевых опций выберите параметры, которые непосредственно повлияли на размер и форму сетевого кластера.
Расширенные параметры находятся в документации GNPS. Выберите адрес электронной почты, чтобы получить оповещение о проделанной работе и отправить задание. Анализ результатов GNPS.
Войдите в GNPS. Выберите задания, опубликованные задания, выполненную, чтобы открыть работу. Веб-страница открывается со всеми результатами, полученными из молекулярной сети отображается.
Выберите спектральные семьи представлений в визуализации сети браузера, чтобы увидеть все сетевые кластеры. Список отображается со всеми генерируемыми молекулярными сетевыми кластерами. Предварительная молекулярная идентификация отображается во всех удостоверениях личности.
Выберите шоу, чтобы визуализировать их. Для анализа молекулярного сетевого кластера выберите визуализировать сеть. В поле меток узла выберите родительская масса.
В поле этикетки края, выберите со-знак или Delta Emz. Наблюдать сходство узлов или разницу в массе между узлами соответственно. В случае многогруппового анализа щелкните нарисуйте пироги в поле окраски узла.
Наблюдать частоту, с которой каждый узел появляется в каждой группе. Чтобы увидеть все библиотеки, выберите представление, всю библиотеку, хиты. Откройте спектры фрагментации непосредственно на платформе GNPS.
Или в оригинальных необработанных файлах вручную подтверждать соединения дереплиции и структуры выяснения связанных соединений. Протокол был успешно проиллюстрирован с использованием сочетания подходов к добыче генома, гетерологом и MS-руководствуясь кодом. Получить доступ к новым специализированным валиномицину и аналоговым молекулам.
Геном молекулы рабочего процесса для целевого валиомицина представлен здесь. Хроматограмма показала, что валиномицин, монтанастатин и пять аналогов были произведены валиномицином, экспрессией биосинтетических генных кластеров в гетерологозном хозяине. Молекулярные ионы сетей, соответствующие валиномицину, уже известному соединению с соответствующими биосинтезными генными кластерами, аннотированными в видах стрептомице, CBM AI два нулевых четырех двух генома.
Группируются с ионами, связанными с аналогами, во-первых, описаны для валиномицин биосинтетических генных кластеров. Спектры MS и химические структуры для валиомицина и связанных с ним аналогов, показаны здесь. Выполнить секвенирование всего генома и правильное кураторство набора данных является первым шагом к выбору биосинтеического кластера для MS-руководства по добыче генома.
Вся процедура может быть выполнена с дикими типами строки сырой экстракт, но вы можете выбрать, чтобы выбрать ген кластера вашего интереса и содействовать гетерологические выражения. Описаны различные методы захвата всего биосинтетического генного кластера из образца ДНК. Самым сильным преимуществом этого протокола является его способность быстро воспроизводить метаболические профили и разводить геномную информацию с данными MS.
Для того, чтобы прояснить эти, такие как новые молекулы. И массовое руководство-геном добычи был впервые описан в области пептидной геномики и гликогеномики Дорис Чим и его коллег. А после внедрения НПС интегрированная метаболомика и подход к добыче генома стали наиболее универсальным способом подключения молекулярных сетей с биосинтезными возможностями.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
