Login processing...

JoVE Journal
Chemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Chemistry

Mass pektrometri-guidad genombrytning som ett verktyg för att avslöja nya naturliga produkter

Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

Journal (Chemistry)

Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

Identification and Quantification of Decomposition Mechanisms in Lithium-Ion Batteries; Input to Heat Flow Simulation for Modeling Thermal Runaway

Journal (Chemistry)

Identification and Quantification of Decomposition Mechanisms in Lithium-Ion Batteries; Input to Heat Flow Simulation for Modeling Thermal Runaway

Click here for the English version

Mass pektrometri-guidad genombrytning som ett verktyg för att avslöja nya naturliga produkter

Article DOI: 10.3791/60825-v

March 12th, 2020 •

Renata Sigrist¹, Bruno S. Paulo¹, Célio F. F. Angolini², Luciana G. De Oliveira¹

¹Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, University of Campinas (UNICAMP), ²Center for Natural and Human Sciences, Federal University of ABC (UFABC)

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

March 12th, 2020

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Här upprättas och beskrivs här ett masspektrometristyrt styrt genombrytningsprotokoll. Den bygger på genomsekvensinformation och LC-MS/MS-analys och syftar till att underlätta identifiering av molekyler från komplexa mikrobiella och växtextrakt.

Transcript

Hel genomsekvensering, genombrytning och molekylärt nätverk utgör basen för masspektrometriguiden som genombrytningsprotokollet som vi beskriver här. Och är den mest samtida strategi i naturliga produkt upptäckt. Genombrytning och molekylär nätverk ning matchar i kluster, i kodade anteckningar i hela genomsekvensering med kemiska omstrukturera signaturer från rå extrakt som ger enorma utsikter för att avslöja naveln av aktiva molekyler.

I princip riktar genombrytningen mot en enda eller en liten grupp molekyler per experiment. Resulterar därigenom i en långsam upptäcktstakt. I denna mening, med hjälp av genombrytning tillsammans med molekylär nätverk utgör ett viktigt framsteg för naturliga produkter forskning.

Masspektrometri guide-genombrytning är en mångsidig metod som kan strukturera information av flera chemotypes som finns i den stora mängden data från ett råextrakt samtidigt. Idag är det hög räckvidd metodik kan utforska bakteriell, svamp eller växter sekvens ger. Chemotype till genotyp och genotyp till chemotype bioinformatik länkar mellan biosyntetiska kluster och är små molekyler produkter.

Höra protokollet är visat att karakterisera naveln cykel djup Peptidprodukter observerats i metaboliska extrakt av streptomyces arter. Men det är tillämpligt på svamp och växter sekvens och extrakt också. Det är mycket viktigt att ha fint kurerade genom datauppsättning och numera fragmenterade utkast sekvenser har alltmer ersatts av nära färdiga sekvensdata.

Också, olika strategier har utvecklats för att få tillgång till nya bioaktiva naturliga produkter och säkert kombinera dem med MS-Guide strategi. Vi kommer att leda till förbättring av naturliga produkter isolering och struktur klarläggande. Som här vi ansluter genotyp till chemotype strategi, bioinformatik länkar mellan biosyntetiska kluster och det finns små molekylprodukter är avgörande.

att uppskatta sort och klass av föreningar och koda genomet. Vilket betyder replikeringen. Senare kan klustring baserat på jonlikheter förformas med hjälp av GNPS.

Demonstrera förfarandet kommer att dr Renata Sigrist och professor Angolini mina medarbetare i denna studie. Att erhålla i silico information om sekundära metabolism gen kluster anteckningar från en komplett sekvens genomet. Skicka in sekvensfilen, genbanken E-M-B-L eller snabbare format, till en anti-smash-plattform.

Så som genkluster av intresse från utdata baserat på de mest liknande kända klustret. Baserat på DNA-sekvensinformationen i BGC, design primaries mellan 20 till 25 nukleotider som flankerar genklustret för ecoli streptomyces. Artificiell kromosom bibliotek screening.

Efter att ha erhållit den rekombinanta heterologa organismen enligt manuskriptet, inokulera en 100: e av stammarna prekultur i lämplig jäsning media. Såsom flytande ISP2-media. Placera kulturen på en inkubator på 30 grader Celsius och 220 RPM, i sju dagar.

Efter inympning centrifugerna odlar kulturerna vid 2200 gånger G i 10 minuter. Kasta cellerna och överför supernatanten till en separatortratt. Lägg till en till en volym av etylacetat och skaka.

Vänta en till tre minuter för den organiska och samtyst lager för att separera. Och samla det organiska skiktet i en Erlenmeyerkolv. Att förvärva MS/MS-data.

Program lämpliga HPLC och masspektrometri metoder med hjälp av styrprogramvaran. Det kommer att noteras att MS/MS-nätverk är det påvisbara molekylära nätverket under de givna masspektrometriska förhållandena. Konvertera massspektra till mzXML-format med hjälp av MS Convert from protea-guiden.

Justera indataparametrarna för konverteringen. Ladda upp de konverterade LC-MS/MS-filerna till GNPS-databasen. Två alternativ finns tillgängliga.

Med hjälp av ett filöverföringsprotokoll eller direkt i en webbläsare via onlineplattformen. Efter att du har skapat ett konto i GNPS loggar du in på det skapade kontot och väljer skapa ett molekylärt nätverk. Lägg till en jobbtitel.

För att utföra grundläggande alternativ. Välj mzXML-filerna för att utföra det molekylära nätverket. Organisera dem i upp till sex grupper.

Så som biblioteken för derepliceringsrutinen. Välj föregångaren jonmassa tolerans och fragment Da på massa tolerans av 0,02 Dalton och 0,05 Dalton respektive. Om du vill utföra avancerade nätverksalternativ väljer du de parametrar som direkt påverkade nätverksklusterstorleken och -formuläret.

Avancerade parametrar finns i GNPS dokumentation. Välj en e-postadress för att få en avisering när arbetet är klart och skicka jobbet. För att analysera GNPS resultat.

Logga in på GNPS. Välj jobb, publicerat jobb, gjort för att öppna ett jobb. En webbsida öppnas med alla resultat som erhållits från molekylära nätverk visas.

Välj visa spektralfamiljer i webbläsarnätverk visualizer att se alla nätverk kluster. En lista visas med alla genererade cluster för molekylärt nätverk. Preliminär molekylidentifiering visas i alla ID:ar.

Välj visa för att visualisera dem. Om du vill analysera det molekylära nätverksklustret väljer du visualisera nätverk. Välj överordnad massa i rutan nodetiketter.

I rutan kantetiketter väljer du co-sign eller Delta Emz. Att observera nodlikhet eller massskillnad mellan noder respektive. Vid analys med flera grupper klickar du på Rita pajer i nodfärgningsrutan.

Att observera den frekvens som varje nod visas i varje grupp. Om du vill se alla bibliotek väljer du vy, alla bibliotek, träffar. Öppna fragmenteringsspektra direkt i GNPS-plattformen.

Eller i original raw-filer för att manuellt bekräfta dereplicering föreningar och struktur klarering av relaterade föreningar. Protokollet var framgångsrikt exemplifieras med hjälp av en kombination av genomet gruvdrift, heterologt uttryck och MS-guidad kod metoder. För att få tillgång till nya specialiserade Valinomycin och analoga molekyler.

Genomet till molekylen arbetsflöde för målet valinomycin presenteras här. Kromatogrammet visade att valinomycin, montanastatin och fem analoger producerades av valinomycin, biosyntetiska gen kluster uttryck i en heterologt värd. Molekylära nätverk joner som motsvarar valinomycin, en redan känd förening med motsvarande biosyntetiska genkluster kommenterade i streptomyces arter, CBM AI två noll fyra två genom.

Är klustrade med joner relaterade till analoger, först beskrivs för valinomycin biosyntetiska gen kluster. MS-spektra och kemiska strukturer för valinomycin och relaterade analoger, visas här. Utför hela genomsekvensering och korrekt datauppsättning curating är det första steget för att välja en biosyntetiska kluster för MS-guide genomet gruvdrift.

Hela förfarandet kan utföras med de vilda typerna sträng rå extrakt, men du kan välja att välja genkluster av ditt intresse och främja heterologt uttryck. Olika metoder beskrivs för att fånga upp hela det biosyntetiska genklustret från ett DNA-prov. Den starkaste fördelen med detta protokoll är dess förmåga att snabbt replikerar metaboliska profiler och föder upp genomisk information med MS-data.

För att klarlägga dessa såsom av nya molekyler. Och massguide-genombrytning beskrevs först inom området peptidgenomik och glykogenomik av Doris Chime och kollegor. Och efter införandet av NPS integrerade metabolomik och genombrytning strategi har blivit den mest mångsidiga avenyn att ansluta molekylära nätverk med biosyntetiska kapacitet.

X

Simple Hit Counter