新生児腸管の発達に及ぼす急性絨毛膜炎の影響を研究する母体炎症への胎児暴露のマウスモデル

このFEMIプロトコルは、胎児が母体の炎症にさらされた後の新生児への長期的な影響を調査することを可能にします。これは、壊死性腸炎(NEC)の発症に特に関連しています。この技術は、絨毛膜羊膜炎でよく見られる無菌性炎症を模倣しており、生きた細菌が不足していると、発達中の腸管とマイクロバイオームに交絡作用を及ぼす可能性があります。

このプロトコルの最も重要なステップは、FEMIを誘導するためのLPS注入です。適切なLPS用量が使用され、注射が妊娠マウスに腹腔内外傷を引き起こさないことが非常に重要です。まず、LPSストックを滅菌生理食塩水で1〜100に希釈し、1ミリリットルあたり20マイクログラムの作業濃度にします。

妊娠E15日目に妊娠中の母犬を注射します。注射の直前にマウスの体重を量り、対照動物と同等の量の生理食塩水を使用して、適切なLPS投与量を決定します。LPS溶液を強火で15秒間3回ボルテックスします。

次に、それを1ミリリットルの注射器に引き出します。首筋の技術を使用して妊娠中のマウスを拘束し、背側の横臥位に保持します。30ゲージ、8ミリメートルの針の斜角の約4分の1から半分を挿入し、腹部の右下象限を30〜40度の角度で覆います。

シリンジプランジャーを引き戻して、負圧を確保します。次に、負圧が存在する場合は注入を続行します。マウスを約30分間監視し、その後、妊娠の残りの期間、マウスをケージに戻します。

E20で経腟分娩で子犬を分娩し、母親と一緒にいて、自由に餌を飲むことができるようにします。出生後14日目に腸を収穫します。はさみと鉗子を使用して、腹部の全長にわたって、皮膚と腹膜を通って、腹部の正中線に垂直に切開します。

胃から盲腸まで小腸を切除し、腸間膜を切除します。小腸の遠位3分の1を分離し、近位の小腸、盲腸、および結腸を廃棄します。回腸の部分をハサミで半分に分けます。

次に、近位半分をRNA安定化溶液に入れてRNA定量を行い、遠位半分を10%中性緩衝ホルマリンに入れてスライド調製します。パラフィン包埋組織を5μmの厚さに切片化し、スライドガラス上にマウントします。スライドを脱パラフィンし、標準的な手順に従ってヘマトキシリンとエオシンで切片を染色します。

光学顕微鏡を使用して、2 人の別々の盲検化された研究者による全身性腸損傷を 3 段階スケールで評価し、絨毛の完全性と基底膜からの分離を評価します。正常な粘膜を説明するためにスコア 0 を割り当てます。上皮下のグルーエンハーゲン空間の発達、空胞化、または固有層または絨毛の先端に限定された上皮下隆起を含む軽度の損傷を説明するために 1 のスコアを割り当てます。

上皮の浮き上がりと絨毛の半分を超える空胞化、絨毛の歪み、または粘膜潰瘍と固有層の崩壊によって示される重傷を説明するために 2 のスコアを割り当てます。スライドをキシレンに2回10分間沈めます。次に、100%エタノールですすいでください。

スライドを100%エタノール、90%エタノール、70%エタノール、および50%エタノールに3分間浸します。次に、組織サンプルの損失を防ぐために、スライドを流水で5分間洗い、セクションを水から離して洗います。アルシアンブルーステイン溶液を標準のコーヒーフィルターでろ過し、それを使用してスライドを15分間染色します。

その後、水道水で2分間洗います。1ミリグラムの過ヨウ素酸を200ミリリットルの再蒸留水で希釈し、スライドをこの溶液に5分間浸します。流水で1分間洗った後、スライドをシフ試薬で10分間染色し、再度5分間洗浄します。

次に、ヘマトキシリンで1分間染色し、2分間水で洗います。酸性アルコールに1分間浸し、次にスコットの水道水に1分間浸し、続いて水道水で1分間洗います。スライドを脱水するには、各スライドを70%エタノール、90%エタノール、次に100%エタノールに10回浸します。

スライドを100%エタノールに10分間浸し、続いて新鮮なキシレンに毎回3分間2回浸します。試料に封入剤を滴下し、その上にカバースリップを置きます。顕微鏡で杯細胞を数えます。

腸組織の各部分について、杯細胞の数と500の上皮細胞を数えます。次に、杯細胞を上皮細胞100個あたりの比率で表します。パネスのセルを数えます。

腸組織の各部分について、腸陰窩あたりのパネート細胞の比率を記録し、腸組織の各部分に対して100の腸陰窩を数えます。胎児の15日目の母体炎症(FEMI)への胎児の曝露は、用量依存的な妊娠喪失と用量依存的な早産率につながります。FEMIは、出生時および生後8週間で重大な腸の損傷を誘発します。

この損傷は、動物に追加の刺激がない場合に発生し、FEMIのみが新生児マウスの腸管の正常な恒常性を破壊することを示唆しています。小腸管の遠位3分の1におけるムチン産生杯細胞および抗菌ペプチド産生パネート細胞の数を定量化した。FEMIは、FEMIを持たない動物と比較して、両方の細胞タイプの喪失を誘発することにより、腸上皮の正常な組成を破壊することがわかりました。

新生児の炎症反応に対するFEMIの影響を調査するために、FEMIの有無にかかわらず、子犬の血清から、インターロイキン-1ベータ、インターロイキン-10、KCGRO、インターロイキン-6など、さまざまな血清炎症マーカーを定量化しました。FEMIは、P0のすべてのサイトカインの炎症カスケードを有意に増加させました。後の年齢での炎症カスケードは、時点とサイトカインに基づいて異なっていました。興味深いことに、FEMI群と偽群では、P7からP28でIL6のレベルが同程度でした。

しかし、FEMI群ではP56の有意に高いレベルが見られましたが、二次的な介入はありませんでした。LPSのストックが異なれば効力も異なるため、初期のLPS用量曲線を実行することが重要です。私たちの新生児の転帰は、FEMIを誘発するために使用されるLPSの用量に依存することがわかりました。