Detectie van Plasmodium Sporozoïeten bij Anopheles-muggen met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest

De ELISA-techniek is erg nuttig voor het detecteren van malariaparasiet in de muggenvector met hoge gevoeligheid en specificiteit, en in staat om tegelijkertijd veel monsters te verwerken. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om muggenmonsters te bewaren totdat ze klaar zijn voor monsterverwerking, en het kan worden uitgevoerd om Plasmodium-soorten te differentiëren met behulp van soortspecifieke monoklonale antilichamen. Bereid het monster voor door het hoofd en de borstkas van de muggen van de buik te scheiden en plaats ze in een vooraf geëtiketteerde centrifugemaalbuis van 1,5 milliliter.

Voeg 50 microliter maalbuffer toe aan elke buis en homogeniseer het monster met een stamper. Spoel de stamper af met 250 microliter maalbuffer en voeg de oplossing toe aan de buis om het uiteindelijke volume op 300 microliter te brengen. Bereid een ELISA-plaat voor op circumsporozoiet-eiwit en vul het sporozoiet-ELISA-werkblad in.

Bereid de antilichaamoplossing in PBS voor en voeg vijf milliliter van de oplossing per plaat toe. Pipetteer 50 microliter van de antilichaamoplossing in elk putje van de ELISA-plaat. Plaats een deksel op het bord en broed 30 minuten of een nacht op kamertemperatuur.

Zuig de oplossing in het putje op en tik vijf keer met het bord op keukenpapier om de vloeistof te verwijderen. Voeg 200 microliter blokkeerbuffer toe aan de putplaten en dek af met een deksel. Incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur en zuig de inhoud van de put op.

Tik opnieuw met het bord op keukenpapier om de vloeistof te verwijderen. Voeg 50 microliter positieve controle toe aan de putjes H één en H twee. Voeg vervolgens 50 microliter blokkeerbuffer toe aan de putjes in de kolommen één en twee van de rijen C tot en met G. Voeg 50 microliter van de positieve controle toe aan de putjes G één en G twee.

Verdun de positieve controle serieel, beginnend bij G één en G twee, gevolgd door F één en F twee tot C één en C twee. Voeg 50 microliter van de negatieve controle toe aan putten A één, A twee, B één en B twee. Extraheer 50 microliter van de homogenaatoplossing en voeg deze toe aan een onbekend putje.

Dek de plaat af en broed deze twee uur op kamertemperatuur uit. Bereid de substraatoplossing voor door substraat A en B te mengen in een verhouding van één op één. Bepaal het vereiste volume op basis van het toevoegen van vijf milliliter werkende geconjugeerde antilichaamoplossing aan elke plaat.

Evalueer de peroxidase-activiteit door vijf microliter van de met peroxidase gelabelde antilichaamoplossing toe te voegen aan 100 microliter van de substraatoplossing in een buis van 1.5 milliliter. Zuig de inhoud van het putje op en verwijder de vloeistof door de plaat ondersteboven op keukenpapier te leggen. Was de putjes twee keer met 200 microliter PBS Tween.

Zuig de inhoud van het putje op en tik vijf keer op de plaat. Voeg 50 microliter peroxidase-gelabelde antilichaamoplossing toe aan elk putje. Broed vervolgens een uur in het donker op kamertemperatuur.

Zuig de inhoud van het putje op en tik vijf keer met het bord op keukenpapier. Was de putjes drie keer met 200 microliter PBS Tween, zuig de inhoud op en tik vijf keer op de plaat. Voeg 100 microliter van de substraatoplossing toe aan elk putje.

Dek de plaat af en broed 30 minuten in het donker op kamertemperatuur. Lees na de incubatie de absorptie af op 405 tot 414 nanometer met behulp van een ELISA-plaatlezer. Label de monsters met absorptie met een waarde boven de grenswaarde als positief en bepaal de CSP-concentratie in het monster met behulp van de standaard.

Zet de absorptiewaarden af tegen de concentratie van de oplossing om een standaardcurve te genereren. Bepaal de beste pasvorm met behulp van de lineaire regressiemethode. Los de vergelijking van elke absorptiewaarde voor een positief monster op om de CSP-concentratie te bepalen.

Na 30 minuten ELISA met ABTS te hebben uitgevoerd, kon sporozoietinfectie worden gedetecteerd door het verschijnen van een vage groene kleur in de put. De positieve controle vertoonde geen kleurverandering in het putje. De extinctiewaarden voor de negatieve en positieve putten werden bepaald.

De positieve put vertoonde een absorptiewaarde die boven de afkapdrempel lag, terwijl de negatieve controles significant lagere waarden vertoonden. Verder werden ook de extinctiewaarden van de andere 80 onbekende putten verkregen. De ononderbroken lijn geeft de gemiddelde absorptie van de negatieve controleputten weer en de stippellijn geeft de positiviteitsdrempel weer.

Met behulp van de standaardcurve werd de CSP-concentratie in put A zeven bepaald op 0,35 picogram per microliter Deze stap van ELISA-verwerking moet snel worden uitgevoerd om niet-specifieke vectoren te voorkomen. Bovendien moeten alle monsters en oplossing in de koelkast worden bewaard om microbiële groei te voorkomen. Onderzoekers wordt aanbevolen om de positieve detecties te bevestigen met andere methoden, zoals PCR.

Dit zal het vertrouwen aanzienlijk verbeteren, vooral wanneer de enige meting boven de drempel wordt gewaardeerd. Deze techniek heeft onderzoekers in staat gesteld om op grotere schaal onderzoek te doen naar mogelijke infectie bij de muggen, wat belangrijk is voor het identificeren van de belangrijkste vector.