Een nieuwe methode om de longitudinale antibacteriële activiteit van geneesmiddel-eluterende materialen te bepalen

Dit protocol omvat het testen van de real-time antibacteriële werkzaamheid van antibiotica geëlueerd uit een polymeer apparaat, wat kan helpen bij het nauwkeurig bepalen van effectieve formuleringen die hun translationele waarde verhogen. Deze methode maakt real-time antibacteriële werkzaamheidstestcapaciteit mogelijk om de longitudinale activiteit van geneesmiddel-eluterende materialen te controleren en om het bereik van antibacteriële activiteit voor een bepaalde implantaatformulering te begrijpen. Dit polymere materiaal wordt gebruikt in meer dan 90% van de totale gewrichtsvervangingen als lageroppervlak.

En deze antibiotica-eluterende formuleringen ervan zijn ontwikkeld als mogelijke behandelingen voor periprosthetische gewrichtsinfecties. Deze methode kan worden gebruikt met elk apparaat voor het eluteren van geneesmiddelen, zoals poreuze metalen, afbreekbare en niet-afbreekbare polymeren, gels en mogelijk deeltjesmaterialen met materiaalspecifieke protocolwijzigingen. Om te beginnen, kweek de bacteriën 's nachts in een milliliter tryptische sojabouillon.

Verdun vervolgens de 's nachts gekweekte bacteriële suspensie in steriele Mueller Hinton Broth, of MHB, en verifieer het levensvatbare aantal bacteriën met behulp van de luminescentie-eenheden vóór het begin van het experiment zoals beschreven in het manuscript. Plaats de maagdelijke en met geneesmiddelen geladen UHMWPE-strips in een spuit van drie milliliter. Trek vervolgens MHB-bevattende bacteriële suspensie in de spuit door de aangehechte naald tot de 1,5 milliliter.

Plaats de opstelling van de spuit op een broedmachine tot de aangegeven tijdspunten van zes uur en vervolgens elke dag tot dag zeven. Na elk aangegeven tijdstip haalt u de opstelling van de spuit eruit en doseert u de media in een tube van twee milliliter. Voer een real-time microbiële levensvatbaarheidstest uit zoals beschreven in het manuscript met behulp van 100 microliter bacteriële suspensie.

Na het bepalen van het aantal levensvatbare bacteriën, berekent u de kolonievormende eenheden per milliliter uit de luminescentie-eenheden met behulp van de overeenkomstige standaardcurve. Om de afwezigheid van levensvatbare bacteriën in de monsters te verifiëren die luminescentiewaarden onder de detectiegrens vertoonden, verspreidt u de cultuur op tryptische soja-agarplaten. Incubeer de platen een nacht bij 35 graden Celsius.

Controleer dan de aanwezigheid van kolonies de volgende dag. Centrifugeer de resterende bacteriële suspensie. Zuig de gebruikte media voorzichtig op.

Laat 100 microliter supernatant in de buisjes met onzichtbare pellets. Resuspendeerde de gepelletiseerde bacteriën in verse MHB. Vortex gedurende 10 seconden om volledige resuspensie te garanderen.

Trek vervolgens de bacteriële suspensie in dezelfde spuitopstelling door de bijgevoegde naald. Begin met het ophalen van virgin en drug-loaded UHMWPE-oppervlakken uit de spuitopstelling na de voltooiing van het onderzoek op dag zeven. Breng vervolgens de oppervlakken over in buizen van 1,5 milliliter en spoel drie keer af met één milliliter steriele PBS.

Soniceer het oppervlak gedurende 40 minuten in één milliliter steriele PBS. Bepaal de levensvatbaarheid van adherente bacteriën door een luminesce-test uit te voeren op 100 microliter van het gesonificeerde monster. De medicijnafgifte van vancomycine en gentamicine-geladen UHMWPE toonde een burst-afgifte na zes uur gevolgd door een gestage afgiftesnelheid met een concentratie hoger dan de minimale remmende concentratie tot zeven dagen.

UHMWPE met vancomycine en gentamicine toonde meer dan drie-log reductie voor gevoelige ATCC 12600 vanaf zes uur en volledige uitroeiing werd waargenomen op dag drie. Voor de gentamicine-gevoelige en vancomycine-intermediaire stam, L1163, veroorzaakten beide geneesmiddel-eluterende materialen meer dan drie-log reductie na zes uur en werd er geen koloniegroei waargenomen op de eerste dag. Gentamicine-elutie uit UHMWPE had geen invloed op de bacteriële levensvatbaarheid van de gentamicineresistente en vancomycine-intermediaire stam, L1101.

Integendeel, vancomycine-elutie uit UHMWPE verminderde de bacteriële levensvatbaarheid aanzienlijk na zes uur. De oppervlakken van zowel gentamicine als vancomycine-eluting UHMWPE vertoonden geen levensvatbare adherente bacteriën bij blootstelling aan gevoelige en intermediaire resistentiestammen na dag zeven. Sommige levensvatbare bacteriën waren echter aanwezig op gentamicine-eluting UHMWPE blootgesteld aan gentamicine-resistente L1101.

Het oppervlak van controle virgin polyethyleen vertoonde levensvatbare hechtende bacteriën bij blootstelling aan elke stam. De scheiding van gebruikte media op elk tijdstip dat de overdracht van de microbiële populatie vergemakkelijkt, is cruciaal om de aanhoudende blootstelling aan de antibiotica te simuleren. Hoewel het een verbetering is ten opzichte van statische methoden, kan deze semi-statische simulatiemethode worden gevolgd door een continue opstelling om de activiteitskinetiek van nieuwe medicijnformuleringen tegen infecties verder te begrijpen.

Het protocol heeft ons in staat gesteld om het effect van medicijnelutie op stamafhankelijke bacteriële dynamiek vast te leggen. Het verbetert de hulpmiddelen voor de evaluatie van de werkzaamheid van duurzame antibioticatoedieningsapparaten.