Journal
/
/
/
骨格筋興奮性を研究するための天然細胞における機能部位特異的蛍光測定
JoVE Journal
Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Journal Biology
Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

骨格筋興奮性を研究するための天然細胞における機能部位特異的蛍光測定

639 Views

03:01 min

June 02, 2023

DOI:

03:01 min
June 02, 2023

1 Views
, , ,

Transcript

Automatically generated

電位依存性イオンチャネルのメンバーであるCaV1.1には、4つの異なる電圧センサがあります。証拠は、いくつかの電圧センサーがリアノジン受容体の活性化またはカルシウム電流により多く寄与することを示唆しています。私たちは、励起-収縮結合とカルシウムチャネル活性化における各電圧センサーの正確な役割を特定できるようにすることを目指しています。

励起-収縮カップリングは50年代初頭から研究されてきましたが、このプロセスがどのように発生するかについての分子の詳細はまだ不明です。チャネルのサイロ電子顕微鏡構造の最近の進歩、新規CaV1.1アクセサリータンパク質の特性評価、チャネル選択的スプライシングバリアントの発見、および疾患の原因となる突然変異の同定により、この分野への関心が再燃しました。私たちの分野では、古典的な電気生理学や分子生物学から、クライオ電子顕微鏡、分子動力学シミュレーション、標的タンパク質分解、機能部位特異的蛍光法などのより新しい技術、改変細胞や動物モデルまで、多くの技術が使用されています。

現在、燃料はいくつかの実験的課題に直面しています。骨格筋では、CaV1.1とRyR1の間の適切な輸送とコミュニケーション、および多くの調節タンパク質が興奮収縮カップリングをサポートするために重要です。CaV1.1とRyR1の間のこれらのタンパク質間相互作用を直接研究する方法は、欠落しているか不完全です。

Martin Schneider博士の研究室は、何十年にもわたって励起-収縮結合に取り組んでおり、CaV1.1、カルシウム放出、およびカルシウムスパークとして知られる局所的なカルシウム放出イベントの電圧検出メカニズムを特徴付けています。最近、私たちの研究室では、機能している成人の筋細胞における興奮収縮結合と電圧センサー運動のさまざまなステップを調べるために、新しい光学技術を実装しています。これは以前は異種発現システムで行われていましたが、私たちのプロトコルでは、CaV1.1電圧センサーのネイティブ環境での伝播された活動電位中の立体構造の変化を追跡できるようになりました。

私たちの新しい技術により、励起-収縮結合に必要な電圧センサーの正確な動きを調べることができます。私たちは、各S4のどの電荷残基がその機能に重要であるか、または正確に各S4が転座し、転座がすべてCaV1.1の開環またはリアノジン受容体の活性化に関連していることを知りたいのです。

Read Article