Het testen van de Fysiologische Belemmeringen voor virale transmissie in Bladluizen Met behulp van micro-injectie

Wanneer ze effectieve overdragers zijn van plantenvirussen, en bij micro-injectie van het virus, is de procedure die we u vandaag zullen tonen een techniek waarmee onderzoekers het virus direct in de hemocyten van de AFib kunnen injecteren, waardoor het darmstelsel — een van de twee belangrijkste barrières voor virusoverdracht via een circulatieve route — wordt omzeild. Hallo, ik ben Cecilia Tamrin Dehi, postdoc bij de afdeling plantenziektekunde aan Cornell University. Vandaag ga ik u laten zien hoe u het virus in de AFib-hemocyt kunt injecteren, waarna het virus kan worden overgebracht naar verschillende plantensoorten.

Bijvoorbeeld, deze FE-plant is geïnfecteerd met het aardappelbladrolvirus PLRV. Het verschil tussen een gezonde en een geïnfecteerde plant is duidelijk zichtbaar. Het meest opvallende symptoom is de taven-sclerose.

PLRV is een virus dat wordt overgebracht door APHIS via hun hemolymfe, het insectequivalent van het bloed bij zoogdieren. Wanneer een niet-geïnfecteerde AFI zich voedt met een geïnfecteerde plant, raakt deze besmet met het virus via het plantensap, wat hier te zien is. Eenmaal ingenomen moet het virus van de darm van het insect naar de hemolymfe migreren en vervolgens door de speekselklier passeren om weer te kunnen worden overgedragen op de ESE-plant.

Hoewel een bladluis mogelijk veel virussen opneemt tijdens het voeden op een ESE-plant, zal slechts een fractie daarvan de darm en de speekselklier passeren. Dit zijn de twee belangrijkste barrières voor transmissie om meer planten te infecteren voor testen. Om te bepalen of een bladluis in staat is om een virus over te dragen, voeden we de bladluizen gedurende twee dagen op geïnfecteerd weefsel en laten we ze vervolgens vijf dagen voeden op een gezonde plant.

De plant wordt vervolgens gefumigeerd en na drie weken beginnen we te zoeken naar symptomen. Wanneer we een AFib vinden die geen virus kan overdragen, kunnen we met behulp van de micro-injectieprocedure, die ik u vandaag ga laten zien, vaststellen welke van de twee barrières het virus tegenhoudt. Bij deze procedure wordt het virus direct in de hemocel geïnjecteerd, waardoor de transmissiebarrière van het darmkanaal wordt omzeild.

Laten we beginnen; ik ga u laten zien hoe u apexen micro-injecteert. Dit is het glas, de glazen naalden die we gebruiken. We trekken glazen naalden uit deze glazen capillairen met behulp van een APU.

Dit is de micro-injector voor het uitvoeren van de micro-injectie van een virus. Ik begin nu met het plaatsen van de naald in de naaldhouder.

Ik plaats nu de naald op de juiste positie. Vervolgens vul ik de naald met het virus tot aan de bovenkant van deze helm. Nu moeten we de AFI positioneren voor de micro-injectie.

Ik neem nu een bladluis met de pijpendrukker en plaats deze in de bladluishouder. Idealiter probeer ik de achterkant van de bladluis tegen de houder te plaatsen, zodat ik toegang heb tot het abdominale deel van de bladluis. Oké, prima.

Nu kunnen we overgaan tot de micro-injectie. Oké, nu ga ik de naald positioneren en deze dichter bij de AFib brengen. Ik breng de naald nu in contact met de AFib; om het exoskelet te doorboren is het het beste om te proberen te prikken tussen het segment aan de basis van de poten.

Ik ga nu injecteren. Ik neem de AFI met het penseeltje en breng deze over op het opvangpapier, waar ik het een momentje laat herstellen. We moeten ook controle-AFI micro-injecteren.

Deze controle-micro-injectie wordt uitsluitend uitgevoerd met de buffer zonder het virus. De buffer die we gebruiken is 0,1 M fosfaatbuffer pH 7. Ik ga de Agrobacterium-infectie (Agro-infiltratie) uitvoeren in een gezonde plant, waarbij ik de plant vijf dagen laat herstellen. Vervolgens zal ik de plant monitoren en wachten op de ontwikkeling van symptomen. Na de micro-injectie van het enkelstrengs RNA wordt gedurende een week elke dag het expressieniveau van het doelgen in de geïnfiltreerde zone gemeten.

We hebben zojuist een afid gemicro-injecteerd die niet in staat was om het virus over te dragen. Als de afid na de micro-injectie wel in staat is om het virus over te dragen, betekent dit dat deze afid een darmbarrière had die het virus blokkeerde. Als er aan de andere kant geen symptomen zich ontwikkelen, betekent dit dat deze afid een sterke barrière in de speekselklieren heeft.

We hebben zojuist aangetoond hoe virussen in bladluizen kunnen worden gemicro-injecteerd. Dezelfde procedure wordt gebruikt om strengen RNA in de bladluizen te injecteren voor het uitvoeren van RNAi-interferentie, een interessante techniek om de genfunctie bij bladluizen te bestuderen. Dat is alles voor de micro-injectie.

Ik hoop dat u ervan geniet en dat het nuttig zal zijn voor uw experimenten. Dank u wel.