Test de la barrières physiologiques à la transmission virale chez les pucerons avec microinjection

Si elles sont des vectrices efficaces de virus végétaux, et si l'injection microscopique de virus est requise, la procédure que nous allons vous montrer aujourd'hui est une technique permettant aux chercheurs d'injecter directement le virus dans la cellule hématique de l'AFib, en contournant l'intestin, l'une des deux barrières majeures à la transmission circulative du virus. Bonjour, je suis Cecilia Tamrin Dehi, post-doctorante au département de pathologie végétale de l'université Cornell. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment injecter un virus dans la cellule hématique de l'AFI, virus qui pourra ensuite être transmis à différentes espèces végétales.

Par exemple, cette plante de féverole est infectée par le virus de la leaf roll de la pomme de terre (PLRV). Vous pouvez observer la différence entre une plante saine et une plante infectée. Le symptôme le plus marquant est la sclérose des taves.

Le virus de la rugosité en anneaux de la pomme de terre (PLRV) est un virus persistant circulant dans l'hémolymphe des pucerons, l'équivalent insecte du sang des mammifères. Lorsqu'un puceron non infecté se nourrit sur une plante infectée, il contracte le virus par le jus végétal, comme on peut le voir ici. Une fois ingéré, le virus doit passer de l'intestin de l'insecte à l'hémolymphe, puis traverser la glande salivaire afin d'être transmis à une nouvelle plante hôte.

Et s'il peut falloir de nombreux virus lors de l'alimentation sur une plante ESE, toutefois, seule une fraction plus importante traversera l'intestin et la glande salivaire. Les deux principaux obstacles à la transmission pour infecter davantage de plantes à tester. Si un AFI est désactivé en tant que vecteur d'un virus, nous nourrissons les AFI avec du tissu infecté pendant deux jours, puis nous les laissons s'alimenter sur une plante saine pendant cinq jours.

La plante est ensuite fumigée et, après trois semaines, nous commençons à rechercher des symptômes. Lorsque nous trouvons un AFib incapable de transmettre un virus, nous pouvons déterminer lequel des deux barrières bloque le virus à l’aide de la procédure de microinjection, que je vais vous montrer aujourd’hui. Dans cette procédure, le virus est injecté directement dans l’hémocèle, contournant ainsi la barrière de transmission intestinale.

Commençons donc et je vais vous montrer comment micro-injecter un apex. Voici le verre, les micro-aiguilles en verre que nous utilisons. Nous tirons ces micro-aiguilles en verre à partir de ces barrettes de verre en utilisant un APU apu.

Voici donc le micro-injecteur. Pour effectuer l'injection microscopique d'un virus, je vais commencer par insérer l'aiguille dans le porte-aiguille.

Je place simplement l'aiguille et je la mets en position. Maintenant, je vais charger le virus dans l'aiguille jusqu'au haut de ce manche. Nous devons maintenant positionner l'AFI pour la microinjection.

Je vais donc prendre un AFI avec la pression douloureuse et je vais le placer dans le support d'AFI. Idéalement, j'essaierai de placer le dos du puceron contre le support afin d'avoir accès à la partie abdominale de l'AFib. Très bien.

Maintenant, nous pouvons procéder à l' micro-injection. Très bien, je vais maintenant positionner l'aiguille et je vais l'approcher de l'AFib. Je vais donc amener l'aiguille au contact de l'AFib et percer l'exosquelette ; la meilleure méthode consiste à tenter de percer entre les segments, à la base des pattes.

Je vais donc injecter. Maintenant, je prélève l'AFI avec le pinceau et je le place sur le papier absorbant, où je vais le laisser sécher un instant. Nous devons également micro-injecter l'AFI témoin.

Cette micro-injection de contrôle est réalisée uniquement avec le tampon, sans le virus. Le tampon que nous utilisons est un tampon phosphate 0,1 M, pH 7. Je vais donc placer un afi dans une plante saine, où je vais le laisser pendant cinq jours ; ensuite, je vais inoculer la plante et attendre l'apparition des symptômes après la micro-injection de l'ARN monocaténaire, pendant une semaine. Chaque jour, le niveau d'expression du gène cible est mesuré dans l'afi.

Nous venons donc d'effectuer une microinjection chez un AFI qui était incapable de transmettre le virus. Si, après la microinjection, l'AFI parvient à transmettre le virus, cela signifiera que cet AFI possède une barrière intestinale qui bloquait le virus. Si, en revanche, aucun symptôme n'apparaît, cela indiquera que cet AFI dispose d'une barrière solide au niveau des glandes salivaires.

Nous venons donc de montrer comment injecter le virus dans les pucerons par micro-injection. Cette même procédure est utilisée pour micro-injecter les ARN bicaténaires dans les pucerons afin d'effectuer une interférence par ARN, une technique intéressante pour l'étude de la fonction des gènes chez le puceron. Voilà donc pour la micro-injection.

J'espère que cela vous plaira et que ce sera utile pour vos expériences. Merci.