Single Molecule Methoden zur Überwachung von Veränderungen in Bilayer Elastic Properties

Hallo, ich bin Dr. Ola Anderson in der Abteilung für Physiologie und Biophysik am Weill Cornell Medical College in New York City. Mein Name ist Olson. Ich studiere Bioinformatik im Labor von Olive Anderson.

Und ich bin Shail Collingwood, ein Forschungstechniker, der ebenfalls aus dem Anderson-Labor arbeitet. Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie eine Ebene, eine Bioschicht bilden, wie Sie eine kleine Membran mit der Biolayer-Punch-Elektrode isolieren, wie Sie die Aktivität eines einzelnen Kanals aufzeichnen und wie Sie die Ergebnisse analysieren und dabei Gramin-Kanäle als Sonden für die Eigenschaften der Lipid-B-Schicht verwenden können. In einem früheren Video haben wir Ihnen gezeigt, wie Sie sich auf diese Experimente vorbereiten können.

Wir haben Ihnen gezeigt, wie Sie die Kammer vorbereiten, die wir verwendet haben, und wir haben Ihnen gezeigt, wie Sie die zweischichtige Stanzelektrode vorbereiten, die wir verwenden, um die kleine Membranschicht zu isolieren, in der wir die Kanalaktivität aufzeichnen. Lassen Sie uns also einige Doppelschichten lochen: Um mit der Einrichtung für Doppelschichtexperimente bei 2,5 mil der temperaturausgeglichenen Elektrolytlösung in jedem Fach der vorlackierten Kammer zu beginnen. Die Lösung, die wir normalerweise verwenden, besteht aus einem molaren Natriumchlorid plus 10 Millimolar.

Das Stück auf pH sieben gepuffert, stellen Sie das Mikroskop und die Lichtquelle so ein, dass das Loch im Teflon in Ihrem Sichtfeld zentriert und hell beleuchtet ist. Setzen Sie die Mikropipette aus Glas in einen Mikroelektrodenhalter ein. Verbinden Sie eine Spritze mit einem Stück Tigon-Schlauch mit dem Halter.

Füllen Sie die Pipette durch Absaugen in den Elektrodenhalter. Achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden, da diese die elektrische Verbindung zwischen dem Silberpellet im Elektrodenhalter und der Pipettenspitze unterbrechen können. Tragen Sie eine kleine Menge Vaseline auf die Schraube auf und legen Sie sie dann in den Mikroelektrodenhalter.

Die Vaseline hilft dabei, einen luftdichten Verschluss zu machen. Stecken Sie den Elektrodenhalter in die Kopfstufe der Patch-Klemme im Faradayschen Käfig. Positionieren Sie die Mikropipettelspitze mittig und direkt hinter dem Loch in der Teflon-Trennwand.

Setzen Sie die aufgerollte Silberelektrode in die vordere Kammer ein. Fixieren Sie es mit Modelliermasse und schließen Sie es an den Spannungsbefehlskreis an. Zum Schluss balancieren Sie die Elektroden aus.

Dies ist kritisch, da die beiden Elektroden, die vordere und die im Mikroelektrodenhalter, leicht unterschiedliche Halbzellenpotentiale haben können. Das Halbzellenpotential ist die Differenz zwischen dem Silbermetall und der Elektrode und der Elektrolytlösung, die an die Silberchloridbeschichtung angrenzt. Gleichen Sie die Elektroden aus, indem Sie den manuellen Offset so einstellen, dass der Strom, der zwischen den beiden Kammern fließt, zwischen minus 200 und plus 200 Pikoampere an der Patch-Klemme schwankt.

Das Offset-Potential ändert sich mit der Zeit, so dass Sie die Elektroden während des gesamten Experiments in regelmäßigen Abständen ausbalancieren, um die Lipid-Doppelschichtmembran zu bilden. Reinigen Sie eine feuerpolierte frühere Pipette mit fch-Lösung, wie im beigefügten Video beschrieben. Tauchen Sie die gereinigte Pipette in die Lipiddecking-Lösung und lassen Sie sie etwa einen Millimeter nach oben in die Pipette aufsteigen.

Platzieren Sie die Pipettenspitze direkt vor dem Loch in der Teflon-Trennwand und malen Sie vorsichtig eine Blase der Lipidlösung auf das Loch. Wenn dies gelingt, bildet sich eine hell gefärbte Lipidblase über dem Loch, die von einem Stier oder Donut-förmigen Lipid an der Teflon-Trennwand befestigt wird. Lassen Sie die Membran dünnen, was durch Anlegen eines Potentials von 100 bis 200 Millivolt über die Membran erleichtert werden kann.

Setzen Sie die Mikropipettenspitze aus Glas in den Taurus ein und lassen Sie sie einige Minuten einwirken, um eine bessere Abdichtung zwischen der Pipette und der Doppelschicht zu gewährleisten. An diesem Punkt sind Sie bereit, ein Membranpflaster mit einer Mikropipette aus Glas zu isolieren. Jetzt dope, die Membran mit Gramin.

Diese Graminlösung wurde aus einem mikromolaren Stamm hergestellt, der auf ein bis 10 Nanomolar verdünnt wurde. Bei Dimethylsulfoxid werden in der Regel ein bis 10 Mikroliter der Verdünnung auf jede Seite der Membran gegeben, so dass die Endkonzentration im picamolaren Bereich liegt. Verwenden Sie die magnetischen Rührstäbchen, um die Lösung etwa zwei Minuten lang zu rühren, und warten Sie weitere 10 Minuten, bevor Sie eine neue kleine Membran bilden, um die Einkanalaktivität aufzuzeichnen.

Dieses Zeitgewicht ermöglicht es, Gramin in die Membran einzubauen. Überprüfen Sie die Kanalaktivität, indem Sie Spannung anlegen. Im Allgemeinen benötigen wir etwa ein Kanalereignis pro Sekunde.

Die Kanäle sind als diskrete Auf- und Abwärtsänderungen des Membranstroms sichtbar. Sie sind nun bereit, mit dem eigentlichen Experiment zu beginnen. Zeichnen Sie zunächst die aktuellen Ablaufverfolgungen der Steuerung auf.

Gleichen Sie die Elektrode wie zuvor gezeigt aus und bilden Sie eine kleine Membran oder ein Pflaster, wie im begleitenden Video beschrieben. Legen Sie positive 200 Millivolt an und zeichnen Sie die Einzelkanalaktivität auf. Sie sollten 100 bis 200 einkanalige Stromübergänge sammeln.

Wiederholen Sie diesen Schritt mit minus 200 Millivolt. Brechen Sie das Pflaster, indem Sie Elektrolyt durch die Pipettenspitze ausstoßen. Mit der Nylonschraube die Elektroden wieder ausbalancieren, die Pipette in die hintere Kammer zurückziehen, überschüssiges Lipid ausblasen und ein neues Pflaster bilden.

Sie können diese Schritte auch wiederholen, um Aufzeichnungen bei anderen Potenzialen anzufordern. Jetzt können Sie die experimentellen Stromspuren mit dem Modifikator "Doppelschicht" aufzeichnen. In diesem Fall wird das Antidepressivum Fluoxetin auf beide Seiten der Membran aufgetragen.

Die Fluoxetin-Stammlösung sollte in DMSO auf 25 Millimolar verdünnt werden. Fügen Sie fünf Mikroliter dieser Lösung hinzu, um eine Konzentration von 50 Mikromolaren in der Kammer zu erreichen: DMSO kann die Eigenschaften der Doppelschicht beeinflussen. Daher ist es wichtig, die Menge an DMSO in der Lösung auf 25 Mikroliter 1% oder 150 Millimolar zu begrenzen.

Rühren Sie fünf Minuten lang und warten Sie 10 Minuten, damit sich der Modifikator zwischen der wässrigen Lösung und der Membran ausgleichen kann. Zeichnen Sie nun die Kanalaktivität wie zuvor beschrieben in Gegenwart des Modifizierers auf. Wiederholen Sie diese Schritte, um die Kanalaktivität bei steigenden Konzentrationen des Modifikators aufzuzeichnen.

Wir lernen viel über Veränderungen in der Doppelschicht, indem wir die Lebensdauer der Kanäle und die Erscheinungsraten quantifizieren. Um eine solche Analyse durchzuführen, müssen wir die Bildung und das Verschwinden von Kanälen feststellen. Hier verwenden wir einen übergangsbasierten Algorithmus, bei dem der Computer die erste Ableitung berechnet, um schnelle Änderungen des Stroms zu bestimmen und sie als Kanalereignisse zu markieren.

Die Ereignisse werden als Zeitreihe gespeichert, um die Lebensdauer des Kanals vor und nach dem Übergang zu bestimmen. Die Strompegel werden ebenfalls gespeichert und helfen uns, die Kanalamplituden während des Experiments zu bestimmen. Der Computer erstellt ein Histogramm der Stromübergangsamplitude, mit dem Sie die Erfassung der Stromübergänge verfolgen können.

Es ermöglicht Ihnen auch, die Qualität des Experiments zu bewerten. Wenn die Amplituden des Stromübergangs stark gestreut sind, haben Sie Probleme. Wenn das Histogramm eng ist, geht es Ihnen gut.

Wenn Sie mehr als 200 Übergangsereignisse angesammelt haben, berechnen Sie den durchschnittlichen Strom und die Standardabweichung für die Übergänge im Hauptpeak. Sie können die Darstellungsrate des Kanals einfach schätzen, indem Sie die Anzahl der Übergänge im aktuellen Histogramm der Übergangsamplitude durch die Beobachtungszeit dividieren. Denken Sie daran, auch durch zwei zu dividieren, da ein Kanal im Histogramm doppelt gezählt wird, einmal wenn er erscheint, und einmal, wenn er verschwindet.

Analysieren Sie die Zeitreihen von Übergangsereignissen, um die Verteilungen der Kanallebensdauer abzurufen. Die Bestimmung der Lebensdauer ist bei Stromleiterbahnen, bei denen zu keinem Zeitpunkt mehr als ein leitender Kanal vorhanden ist, einfach. In diesem Fall erkennt der Computer, ob es sich bei jedem Übergang um ein Kanalerscheinen oder ein Verschwinden handelt, und ein Verschwinden kann nur zum vorhergehenden Darstellungsereignis gehören.

Die Zeit zwischen den beiden Übergängen ist die Lebensdauer des Kanals. In Fällen, in denen die Kanalübergänge zu nahe beieinander liegen, um unterschieden zu werden, müssen Sie Erscheinungsbilder und Verschwinden manuell zuweisen. Komplexer gestaltet sich die Zuweisung, wenn Sie zwei oder mehr gleichzeitig leitende Kanäle haben, da Sie nun nicht wissen, welcher Kanal zu welchem Kanalauftritt gehört.

Aus diesem Grund ist es vorzuziehen, eine geringe Kanalaktivität zu haben. Sie können das Zuordnungsproblem lösen, indem Sie einen Zufallszahlengenerator verwenden, um dem Verschwinden Erscheinungen zuzuweisen. So erhalten Sie eine Reihe von Kanallebensdauer.

Dies wird in ein Lebensdauerhistogramm umgewandelt, das wiederum in ein Überlebendendiagramm umgewandelt wird, bestimmen Sie die durchschnittliche Lebensdauer, indem Sie eine einzelne Exponentialverteilung an das Überlebendendiagramm anpassen, indem Sie eine nichtlineare Kurvenanpassung für gemietete Quadrate verwenden und Experimente durchführen, bei denen die große Membran nicht bricht. Wenn Sie den Modifikator "Doppelschicht" hinzufügen, können Sie die Auswirkungen auf die Darstellungsraten des Kanals vergleichen. Ein solcher Vergleich ist nicht gerechtfertigt, wenn die große Membran bricht und die Funktion des Membranproteins durch die Lipidzusammensetzung der Zellmembran reguliert wird.

Diese Regulation beruht auf einer Kombination aus spezifischen Lipidprotein-Wechselwirkungen und allgemeineren Wechselwirkungen zwischen der Lipiddoppelschicht und den Membranproteinen. Diese Wechselwirkungen sind in der pharmakologischen Forschung besonders wichtig. Da es sich bei vielen aktuellen Arzneimitteln auf dem Markt um Amphi handelt, die die Eigenschaften der Lipiddoppelschicht verändern können, was wiederum zu einer veränderten Funktion des Membranproteins führen kann.

Graminkanäle können als molekulare Kraftwandler verwendet werden, um zu berichten, ob Amphiphile die Eigenschaften von Lipiddoppelschichten verändern können. Darstellung der Änderungen der Lebensdauer und der Erscheinungsrate als Funktion des Modifikators. Die Konzentration gibt Aufschluss über Änderungen der Doppelschichteigenschaften.

Eine erhöhte Frequenz bedeutet, dass die Doppelschicht leichter verformt wird, um die Gram-Stelle und die Dimerisierung aufzunehmen. Eine erhöhte Lebensdauer bedeutet, dass die mit der Kanalbildung verbundene Doppelschichtverformung nicht so energiesparend ist. Ein Modifikator kann die Frequenz und Lebensdauer erhöhen, indem er die Membranelastizität erhöht oder die Krümmung beeinflusst.

Wir haben nun gezeigt, wie man mit Hilfe von Chromokanälen überprüfen kann, ob kleine Moleküle die Eigenschaften elastischer Doppelschichten verändern. Und das ist es. Danke fürs Zuschauen.

Viel Glück bei Ihren Experimenten.