Culture ex vivo des tissus du patient et l'examen de la livraison de gènes

Published 12/20/2010
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Medicine

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Cet article décrit la culture de tranches de tissu du patient pour les études de livraison de gènes et l'analyse ultérieure de l'expression des gènes en utilisant l'imagerie par bioluminescence IVIS.

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Rajendran, S., Salwa, S., Gao, X., Tabirca, S., O'Hanlon, D., O'Sullivan, G. C., et al. Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery. J. Vis. Exp. (46), e2378, doi:10.3791/2378 (2010).

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Abstract

Cette vidéo décrit l'utilisation de tissus du patient comme un modèle ex vivo pour l'étude du transfert de gènes. Les tissus du patient fraîche obtenue au moment de la chirurgie est tranché et maintenues en culture. Le système ex vivo modèle permet pour la livraison physique des gènes dans les tissus du patient intact et l'expression des gènes est analysée par imagerie par bioluminescence en utilisant le système de détection IVIS. Le système de détection bioluminescente démontre la quantification rapide et précise de l'expression des gènes au sein des tranches individuelles sans avoir besoin de sacrifier des tissus. Ce système de culture coupe de tissu peut être utilisé dans une variété de types de tissus, y compris les tissus normaux et malins et nous permet d'étudier les effets de la nature hétérogène du tissu intact et le haut degré de variabilité entre les patients individuels. Ce système modèle pourrait être utilisé dans certaines situations comme une alternative aux modèles animaux et comme un mode complémentaire précliniques avant d'entrer dans l'essai clinique.

Protocol

Préparation des milieux et des réactifs

  1. Solution antibiotique
    Tampon phosphate salin (PBS) avec 200 U / ml de pénicilline, 200 pg / ml de streptomycine, 5 pg / ml fungizone
  2. Milieu de collecte et de traitement
    Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 200 U / ml de pénicilline, 200 pg / ml de streptomycine, 5 pg / ml fungizone
  3. Le milieu de culture
    Moyennes Collection contenant 10% inactivé à la chaleur sérum de veau fœtal

Collecte de tissus et de stockage I.

Approbation pour la collecte des tissus du patient a été obtenu à partir de la recherche clinique du Comité d'éthique des hôpitaux universitaires de Cork et le consentement éclairé a été obtenu à partir des patients le jour avant la chirurgie. Le tissu hépatique a été obtenu à partir de patients subissant une hépatectomie partielle pour une maladie maligne.

  1. Les tissus du patient frais est obtenue au moment de la résection chirurgicale.
  2. Tissulaire est stocké dans les médias de collecte à 4 ° C (tissus peuvent être conservés au réfrigérateur jusqu'à 12 h sans perte significative de viabilité, toutefois un traitement immédiat est recommandé).

II. Préparation de tranches de tissus et de la culture

Le découpage a été effectué en utilisant un vibratome (Leica, Allemagne). Le système de tissu tranchage a été utilisé conformément aux instructions du fabricant. Préparation de tranches de tissus ont été effectués sous une hotte stérile en utilisant des instruments nettoyés avec 70% de 2-propanol. Épaisseur de la tranche est fixé à 2000 microns et couper à l'aide d'une lame alternatif à 22-26 min.

  1. Tissu est lavé dans une solution antibiotique trois fois.
  2. Le tissu est attaché à l'étape de montage à l'aide d'adhésif non toxique (Dermabond).
  3. Épaisseur de coupe est réglée et le tranchage est réalisé à 22-26 min.
  4. Les tranches sont maintenues dans un milieu de culture en boîtes de culture de 6 puits (une tranche par puits) à 37 ° C avec 5% de CO 2 dans un environnement humidifié.

III. La livraison de gènes à des tranches de tissu

  1. Les tranches sont pré-incubées à 37 ° C pendant 2 h avant le traitement.
  2. Milieu de culture est remplacé par du milieu de traitement.
  3. Les tranches sont directement injectés avec des vecteurs viraux (25 ul de particules virales Ad5.CMVluc [1x10 9]). Alternativement, les particules peuvent être ajoutées au milieu, à diluer pour perfusion passive.
  4. Après deux heures d'incubation, le sérum est ajouté au milieu.

IV. L'analyse de l'expression des gènes par l'analyse de bioluminescence

  1. Les tranches sont injectés avec 100 ul de substrat luciférine (3 mg / ml).
  2. 6-même boîte de culture est placé sur scène et incubé pendant 10 min.
  3. Les tranches sont imagés pendant 5 min à haute sensibilité (figure 1).

Résultats Représentant V.

Figure 1
Figure 1. Imagerie Bioluminescent des tranches de foie des patients utilisant le système de détection IVIS.

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Discussion

Nous décrivons un patient ex vivo la culture de tissus méthode et système de détection de bioluminescence pour l'évaluation du transfert de gènes au sein non fixe les tissus humains. La méthode offre un moyen simple et reproductible des tranches de tissu en culture. Il a un potentiel important car il permet l'étude de la livraison de gènes dans les tissus humains intact, l'analyse de la livraison de gènes dans une variété de tissus humains, y compris les tissus malins et peut fournir des informations importantes concernant les effets de la forte variabilité entre les patients individuels par rapport à l'absorption du gène. Différents types de cancers peuvent avoir des effets variables sur l'efficacité des différentes étapes de l'expression du transgène dans les cellules de succès, impliquant l'absorption d'ADN et la transcription et la traduction ultérieure. Ces étapes sont décrites dans l'animation vidéo, en utilisant un vecteur viral comme un exemple. Le système de détection bioluminescente démontre la quantification rapide et précise de l'expression des gènes au sein des tranches individuelles sans avoir besoin de sacrifier des tissus. Pour des vecteurs à réplication incompétents, comme utilisé dans cette étude, la luminescence est directement liée à l'expression des gènes par les cellules.

Ce modèle de système fournira des informations précieuses concernant la livraison de gènes dans les tissus du patient avant d'entrer dans l'essai clinique.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par le Cork South Victoria Infirmary Hospital de l'Université de fonds du sein, cancer de la Société irlandaise (CRI07TAN) et le Centre de recherche contre le cancer Cork. Réplication incompétents adénovirus recombinant 5 particules sous le contrôle transcriptionnel du promoteur du CMV a été un cadeau aimable du professeur Andrew Baker, Université de Glasgow.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma-Aldrich D6429
PBS Sigma-Aldrich D8537
Firefly Luciferin Biosynth International, Inc
Dermabond Johnson & Johnson
Vibrotome Leica Microsystems VT 1000 A

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References

  1. van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Draaisma, A. L., Merema, M. T., Bezuijen, J. I., van Gils, M. J. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicol Sci. 85, 632-638 (2005).
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  3. Kirby, T. O., Rivera, A., Rein, D., Wang, M., Ulasov, I., Breidenbach, M. A novel ex vivo model system for evaluation of conditionally replicative adenoviruses therapeutic efficacy and toxicity. Clin Cancer Res. 10, 8697-8703 (2004).
  4. Josserand, V., Texier-Nogues, I., Huber, P., Favrot, M. C., Coll, J. L. Non-invasive in vivo optical imaging of the lacZ and luc gene expression in mice. Gene Ther. 14, 1587-1593 (2007).

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