Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo Eğitim

Bu prosedürün genel amacı, aort kalp kapakçığı dokusunun veya hücrelerinin döngüsel basınca verdiği biyolojik yanıtı belirlemektir. Bu işlem, öncelikle porcine kalplerden kapakçık dokusunun izole edilmesi ve dokuların gece boyunca doku kültürü ortamında inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, basınç sisteminin kalibre edildiğinden emin olmaktır. Sonraki.

Kapak dokusu veya hücreleri basınç sistemine yerleştirilir. Hazne, 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirilir ve döngüsel basınç rejimi, istenen süre boyunca, istenen büyüklükte ve frekansta başlatılır. Son olarak doku, biyolojik analiz için sistemden çıkarılır.

Nihayetinde, gerçek zamanlı PCR, Western blotting veya mikroskopi aracılığıyla, artmış basıncın gen ve protein ekspresyonunu nasıl etkilediğini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin temel avantajı, mekanik basıncın etkilerini diğer mekanik kuvvetlerden ve biyokimyasal stimülanlardan ayırabilmemizdir. Bu durum, hayvan modelleri gibi diğer tekniklere göre bir avantaj sağlamaktadır; ancak bu yöntem, mekanik kuvvetlerin biyolojiyi ve kalp kapakçıklarının patogenezini etkileme biçimini anlamamıza yardımcı olmak için de kullanılabilir.

Ayrıca doku mühendisliği yapıları geliştirmek için de kullanılabilir. Bu prosedürün gösterimini şu an laboratuvarımdaki bir lisansüstü öğrencisi, dokuyu basınca hazırlamak için gerçekleştirmektedir.

Çalışmalarda, ağırlığı 120 pound'ı geçmeyen yetişkin dişi domuzlardan ölümden hemen sonra aort kapakları toplanır. Kapaklar steril PBS ile iki kez yıkanır, ardından buz üzerine yerleştirilerek laboratuvara taşınır. Sonraki tüm adımlar steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.

Yaprakçıkların herhangi bir dejenerasyon, yırtılma veya kalsifikasyon belirtisi göstermediğinden emin olun. Yaprakçıkları, annulustan itibaren mesafenin üçte biri derinlikten keserek aort kökünden ayırın. Yaprakçıkları altı kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin ve %1 antibiyotik antimikotik solüsyonu ile %10 fetal bovine serum eklenmiş üç mililitre DMEM ile 37 degrees Celsius ve %5 carbon dioxide altında gece boyunca inkübe edin.

Bu basınç sistemi özel olarak üretilmiştir ve aort kapak dokusu üzerinde döngüsel basıncın mekanobiyolojik etkilerini incelemek üzere tasarlanmıştır. Sistemi kullanmak için bilgisayara giriş yapın ve lab view programını açın. Basınçlı havanın sisteme bağlı olduğunu kontrol edin ve hava beslemesini tam hıza getirin.

Sinyal amplifikatörünü açın. Voltaj okumasının 0.00 olduğundan emin olun. Gerektiğinde ayarlama yapın.

Labview arayüzünde, test kaydı (test record) şeklinde işaretlenmiş ve test konumuna getirilmiş bir anahtar bulunmaktadır. Giriş solenoid valfini açmak için hava beslemesi (air supply) olarak işaretlenmiş butona tıklayın. Gaz basınç regülatörünü kullanarak hazneyi 1 PSI basınçlı hava ile basınçlandırın. Haznenin arka uç plakasında bulunan dijital basınç ölçer yardımıyla hazne içindeki basıncı okuyun.

Basınç dengelendiğinde, sinyal amplifikatöründen gelen voltaj değerini kaydedin. İşlemi 2, 3, 4 ve 5 PSI için tekrarlayın. Ardından, basınca karşı voltajı gösteren bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.

Basıncı PSI biriminden milimetre cıva birimine dönüştürün. Grafikteki denklemi LabVIEW programının koduna yerleştirin. Basınç odasının önündeki alüminyum plakayı çıkarın ve odayı %70 etanol ile spreyleyin.

Yaprakçık örneklerini içeren altı kuyucuklu plakayı hazneye yerleştirin ve ön uç plakasını geri takın. Dört dişli çubuk üzerinde bulunan somunları elinizle sıkarak sızdırmazlığın tam olduğundan emin olun. Basınç haznesini 37 °C'lik inkübatöre yerleştirin.

Sistemin basınçlı hava girişi ve çıkışı arasında döngü yaptığı süreyi girin. Bir hertz frekansta sırasıyla diyastolik ve sistolik koşulları taklit etmek için bu değerler 0.6 saniye ve 0.4 saniye olarak ayarlanmalıdır. Ardından LabVIEW'da bir veri dosyası yolu girin.

Çalıştır'a tıklayın ve test kayıt anahtarını kayıt konumuna getirin. LabVIEW arayüzündeki grafiği kullanarak basıncın istenen seviyede olduğunu kontrol edin. Gerekirse, gaz basınç regülatörünü kullanarak basıncı ayarlayın.

Deney tamamlandığında, lab view ekranında durdur düğmesine tıklayın, hava beslemesini kapatın ve basınç odasındaki tahliye valfini açın. Son olarak, basınç sistemini inkübatörden çıkarın. Ardından, odanın ön uç plakasını çıkararak altı kuyucuklu plakayı alın.

Numuneler artık gen ekspresyonu, protein ekspresyonu, histoloji ve mekanik özellikler açısından analiz edilebilir; basınç dalga formları normal ve yüksek basıncı temsil eder. Sistemden elde edilen koşullar, burada in vivo koşullar altında gösterilmiştir. Diyastol sırasında sol ventrikül ile asendan aorta arasında, normal fizyolojik koşullar altında aort kapakçığının kapalı kalmasını sağlayan bir basınç farkı bulunur.

Bu transvalvüler basınç 80 mmHg'dir. Ancak, evre bir ve evre iki hipertansiyon altında, transvalvüler basınç sırasıyla 90 ve 100 mmHg'ye yükselebilir. Basınç sistemi; norm 10, evre bir ve evre iki hipertansif koşullar altında gözlemlenen maksimum transvalvüler basınçları simüle edebilme kapasitesine sahiptir.

Sistemden elde edilen normal ve yüksek basınç koşullarının temsili basınç dalga formları burada gösterilmiştir. Bu prosedürü takip ederek, yaprakçıklar üzerinde PCR, Western blotting ve mikroskopi gibi diğer yöntemleri uygulayabiliyoruz. Bu da gen ekspresyonundaki ve protein sentezindeki değişiklikler gibi durumları anlamamıza ve kalp kapakçıklarındaki mekanotransdüksiyonu kavramamıza yardımcı olur.

Bu teknik, mekanik biyolojiyi ve hastalık mekanizmalarını anlamamıza gerçekten yardımcı olmuş ve gelecekte, in vivo ortamda basınç değişikliklerine maruz kalabilecek diğer dokularda meydana gelen değişimleri anlamamıza yardımcı olabilecektir.