Vitro modeli doku grefti bakteriyel bağlılık çalışmaya paralel-plaka perfüzyon sistemi

Bu yöntem, enfektif endokardit patogenezinde anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, ve bakteri arasındaki etkileşim gibi alanlarda patobiyogramlar, kan hücreleri, ve kas astar endotel hücreleri. Bu tekniğin en büyük avantajı doku greftlerinin standart akış koşullarında bakteri, trombosit ve protein gibi çeşitli hedeflerle karşılıklı etkileşimlere doğrudan maruz kalınmasıdır. Bu tekniğin etkisi, bazı dokuların yüksek enfektifliğini yönlendiren önemli moleküler etkileşimleri ve faktörleri çözebildiği için, enfektif endokardit tedavimize kadar uzanır.

Bu yöntem bitki oluşumunun patogenezine ışık verir. Ayrıca vasküler geçirgenlik, hücre hareketliliği ve gen hücresi ekspresyonunu araştıran çalışmalarda da uygulanabilir. Protokolü başlatmak için, önceden hazırlanmış doku biyopsisini 10 milimetre çapında yerleştirin ve mikroskop kaydırağı ile sekiz milimetrelik dairesel perforasyon arasında aynı kalınlıkta ve iç yüzeye bakan kauçuk bir conta yıpranarak bakteriyel süspansiyona temas edin.

Tutucuya yerleştirilirken doku grefti oryantasyonuna odaklanın. Dokunun iç yüzeyinin deneysel ortamınızla iletişim kurmak için kan dolaşımına maruz kaldığından emin olun. Daha sonra, haznenin alt metal çerçevesine gömülü conta kağıdına mendil ile birlikte takın.

Üst metal çerçeveyi ilgili conta levhasıyla daha önce takılmış doku tutucusu ile birlikte odanın altına takın. Sonra sekiz vida ve vida somunları ile tüm oda monte. Bir kaliper veya cetvel kullanarak oda yüksekliği greftler arasında her zaman aynı olduğundan emin olun.

Sonraki peristaltik pompa ile akış odası bağlayın. Sonra tüpler ile 400 mililitrelik sıvı rezervuar bağlayın. Peristaltik pompa ve bakteri rezervuarı kullanarak bir saat boyunca dakikada üç yemek santimetre başına üç yemek ve buna karşılık gelen akış hızı ile fosfat tamponlu tuzlu salin içinde yedi floresan etiketli koloni oluşturan birimleri on 100 mililitre süspansiyonlar ile dokuları perfuse.

Aynı toplama rezervuarı kullanarak sürekli 100 mililitrelik bakteriyel süspansiyon recirculate. Perfüzyondan sonra, grefti serbest bırakmak için odayı sökün. Üç dakika boyunca bir orbital shaker kullanarak 12-iyi plaka pBS dört mililitre ile doku parçası iki kez yıkayın.

Daha sonra daha küçük çaplı bir deri biyopsisi yumruk kullanarak greft iç kısmını kesin. Her doku biyopsisini bir mililitre steril %0.9 sodyum klorür içeren ayrı bir 14 mililitrelik tüpe yerleştirin. 10 dakika boyunca bir sonication banyo kullanarak doku dan bakteri ayırmak.

Sonication sonra elde edilen bakteriyel süspansiyon seri seyreltme yapmak için steril% 0.9 sodyum klorür 10 mililitre ile tek bir 14 mililitretüp hazırlayın. İki numaralı tüpü etiketle. Profüzyon deneyine götürülen ilk bakteriyel süspansiyonun seri seyreltmeleri için 10 mililitre steril %0,9 sodyum klorür içeren üç tane 14 mililitrelik tüp hazırlayın.

Tüpleri üç, dört ve beş numaralı tüpleri etiketle. Sonra, güvenli üç agar plakaları, bakteriyel perfüzyon için bir, PBS kontrol perfüzyon u için bir, ve perfüzyon için kullanılan ilk bakteriyel süspansiyon için üçüncü. Doku deneyi için plaka başına üç sektörü aşağıdaki şekilde etiketle:10-1, 10-3 ve 10-4.

Bakteri perfüzyonundaki koloni oluşturan birimlerin sayısını saymak için plakayı aşağıdaki gibi etiketlayın:10-1, 10-3, 10-5 ve 10-7. Girdap 15 saniye boyunca doku biyopsisi içeren tüpler, seri seyreltme yapmak için. Seri seyreltmeleri hazırlamak için, 100 mikrolitre tüpü n için bir numaralı tüpü iki numaralı tüpe aktarın ve çözeltiyi iyice karıştırmak için tüpü girdaplayın.

1 numaralı ve iki numaralı tüpün içindekilerin 100 mikrolitresini ilgili sektörlere, 10-1 ve 10-3 numaralı agar plakasına yayın. Sonra sektör 10 dört üzerinde iki numaralı tüp 10 mikrolitre yayıldı. 10 mikrolitrelik her birimden dört ayrı büyüme elde etmek için bu adımı dört kez tekrarlayın.

İlk kültürün seri seyreltmelerini hazırlamak için, ilk olarak seyreltme 15 saniye girdap ve 100 mikrolitre bakteriyel süspansiyonu üç numaralı tüpe aktarın ve girdap yaparak şiddetle karıştırın. Dört numaralı tüpe 100 mikrolitre tüp ekleyin ve tekrar karıştırın. Dört numaralı tüpten beş numaralı tüpün prosedürünü tekrarlayın.

Üç numaralı, dört numara, beş numaralı tüplerin içindekilerin 100 mikrolitresini ve etiketli ilk kültürü sırasıyla 10-3, 10-5, 10-7 ve 10-1 kan agar plakası olan sektörlere yayın. Genellikle 10 dakika boyunca, bakteriyel yayılır hava için laminar başlık altında kan agar plakaları bırakın. Daha sonra, gece kuluçka için 37 santigrat derece plakaları yerleştirin.

Gece kuluçka sonra, Cpu sayısını elde etmek için bakteri kolonileri saymak. Katıksız stres koşulları altında, çeşitli greft dokuları arasında benzer bakteriyel eki hem staphylococcus aureus hem de staphylococcus epidermidis enfeksiyonu için gözlendi. Prosedürleri takiben, streptococcus sanguinis sığır perikard yama ile karşılaştırıldığında, sığır juguler ven duvarına bağlılık önemli azalma gösterdi.

Streptococcus sanguinis, üç bakteri türünü karşılaştırırken, staphylococcus aureus ve staphylococcus epidermidis ile ilişkili olarak sığır juguler ven duvarına önemli ölçüde daha düşük yapışma sağlar. Bu prosedürü çalışırken, aynı kafanın doğru dokuları hazırlanmış olması hatırlamak önemlidir. Tüm deney numuneleri arasında benzer koşullar sağlayacak ve farklı deney serileri arasındaki veri değişkenliğini en aza indirir.

Bu teknik, geliştirilmesinden sonra araştırmacıların tıbbi duruma yakın tam bir karmaşıklık oluşturmak için in vitro model yaklaşımlarını farklı unsurlarla zenginleştirerek karmaşık bozukluk sistemlerini adım adım keşfetmelerine olanak sağlar.