Name: Vitro modeli doku grefti bakteriyel bağlılık çalışmaya paralel-plaka perfüzyon sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Öğrenin, doku greftlerinde bakteriyel bağlılığı in vitro akış odası modeliyle nasıl incelenir. Bu yöntem, enfektif endokardit patogenezini ve bakteri-hücre etkileşimlerini anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada RH için verilen bir hibe araştırma fonu KU Leuven (OT/14/097) sponsor oldu. TRV iki Araştırma Vakfı - Flanders (Belçika; doktora sonrası bursu aldı Sayı - 12K0916N vermek) ve RH klinik araştırma fonu UZ Leuven tarafından desteklenmektedir.

1. Vitro çalışmalar için greft doku hazırlanması
Not: Doku üç tür kullanılmıştır: sığır kalp zarını yama (BP), Cryopreserved Homogref (CH) ve sığır juguler ven greft (BJV). BJV boru ve CH (Avrupa Homogref banka (EHB) tarafından işlenen ve sıvı azot kullanmak için önceden saklanan doku) durumunda, duvar ve valvular broşür kullanılmıştır. BP yama ve BJV conduit üreticilerden satın alındı. Kullanılmadan önce12EHB yönergeleri takip CH çözülme.
<ol><li>Tüm dokular kullanmadan % 0,9 NaCl önce ile yıkayın.</li>
	<li>Tek kullanımlık deri biyopsi kullanarak doku biyopsisi punch kesim dairesel doku parçalar (10 mm çapında) hazırlayın.</li>
	<li>Tüm doku düzeltme eklerinin tek kullanımlık steril neşter kullanarak aynı boyda kesilmiş.</li>
	<li>Oxazolidin (Örneğin BJV boru) ile sabit dokular, gecede 4 ° C'de 200 g/L ile greft parçalarını sabitleştirici nötralize etmek için insan albumini kuluçkaya.</li>
	<li>Oxazolidin %0,9 artıkları dışarı yıkama NaCl microtiter plaka.  Bir dakika için 3 kez tekrarlayın.</li>
</ol>2. bakteri perfüzyon deneyler için hazırlanması
Not: Üç bakteriyel yalıtır kullanılmıştır: S. aureus Cowan (ATCC 12598), S. epidermidis ATCC 149900 ve S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus ve S. epidermidis tryptic soya suyu (TSB) 37 ° C'de yetiştirilmiştir ve S. sanguinis 37 ° c % 5 CO2 beyin kalp infüzyon suyu (BHI) ile büyüdü.
<ol><li>Bir katı kan agar plaka üzerinde bakterilerin gecede kültür hazırlamak.<ol>
<li>Bir kısır döngü kapalı donmuş bakteriler scrape ve 37 ° C'de gecede kültür için Mueller Hinton kan agar levha üzerine aşılamak için kullanın</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steril aşılama döngü bir koloni gecede kan agar kültüründen almak ve tekerlekli sandalye basketbolu veya BHI 10 mL 14 mL tüp ve 37 ° C'de gecede kültür içine aşılamak için kullanın</li>
	<li>Gecede Kültür (3000 x g, 4 ° C, 10 dk) santrifüj kapasitesi ve granül fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL resuspend. 14 mL tüpler buza koyun.</li>
	<li>3.7 mg/mL solüsyon 5 (6) - carboxy - floresein N-hidroksi-succinimidyl ester (CF) etanol içinde bir aliquot hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın Daha fazla CF stok 150 µg/ml 'ultrasaf' su kullanarak oranında seyreltin. Not: alüminyum folyo kullanarak ışıktan tüpler korumak ve -20 ° C'de depolayın</li>
	<li>Bakteri (3000 x g, 4 ° C, 10 dk) santrifüj kapasitesi ve granül PBS 800 µL içinde resuspend ve 150 µg/mL CF çözüm (30 µg/mL perfüzyon deneyler için kullanılan son konsantrasyonu) 200 µL ekleyin. Alüminyum folyo ile ışık tüpleri korumak ve 30 dk bir orbital çalkalayıcı kullanarak kuluçkaya.</li>
	<li>Etiketleme sonra PBS çözümde Sığır serum albumin (BSA) % 2'si ile engellemek ve (3000 x g, 4 ° C, 10 dk) spin. Santrifüjü (3000 x g, 4 ° C, 10 dk) tarafından PBS ve Pelet bakterilerin 10 mL kullanarak bir yıkama adım ile izleyin.</li>
	<li>Bir OD600 itibaren 0.65 için (optik yoğunluk) karşılık gelen 107 adet koloni oluşturan (CFU) /mL, (CFU Mueller Hinton kan agar tabaklarda sayma tarafından doğrulanmadı) elde etmek için PBS ile bakteri sulandırmak. Tüpler perfüzyon deneyler önce buzda anlatmamanı. Roman OD600 ölçümleri bakteri sayısı yaklaşık yansıtacak unutmayın. Etkili aşı dozu saymak için seri seyreltme OD doğrulamak için ek bir gerekli adım sayıların 3.8 bölümünde açıklandığı gibi temel yöntemidir.</li>
</ol>3. vitro perfüzyon bir paralel-plaka odası akışı kullanarak deneyler
<ol><li>Doku biyopsisi çapı ve (1,1-1,5 adımda hazırlanan) aynı kalınlığı 10 mm bakteriyel süspansiyon ile temas almak için yukarı bakacak şekilde iç yüzeyi ile bir akış odası sistemi monte. Not: Aynı doku yükseklik laminar akış tüm koşullarda izin kanaldaki ulaşıldığında aynı doku kalınlığı boyunca çeşitli Greftler sağlar. Akış odasının tüm öğeler sunulan ve Şekil 1' de açıklanan.<ol>
<li>Protokol başlamak için bir 8 mm dairesel delikli ile mikroskop slayt ve lastik conta arasında yuvarlak doku parça yerleştirin. Not: Mikroskop slayt 8 mm delik nesil izin vermek için ultra-ince alt film sahip olur. Kauçuk örtü ile birlikte numune ve akan orta arasında doğrudan temas etkinleştirmek için doku giderir ve aynı zamanda biyopsi çıkığı deney sırasında önler. (Daha küçük çaplı) akışına maruz incelenen doku yüzeyine forseps tarafından manipüle edemez.</li>
		<li>Doku ile sahibi odası alt metal çerçeve içinde gömülü conta sayfasına ekleyin.</li>
		<li>Üst metal çerçeve ile ilgili conta levha üzerine odası alt kısmı ile önceden eklenmiş doku tutucu ekleyin. Daha sonra tüm odası sekiz vida ile monte ve somun vida. Oda yüksekliği her zaman aynı greft arasında olduğundan emin olun. Not: Oda yüksekliği her zaman vida sıkma üzerine tespit edilmelidir. Bir kumpas veya cetvel kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akış odası peristaltik pompa ve sıvı havzanın tüpler ile bağlantı kurun.</li>
	<li>3 din/cm2 (santimetre kare basınç birimi başına din) kesme stres ile 107 CFU/mL (sayma ve OD600 ölçümleri için ilgili CFU tarafından doğrulanmadı) fluorescently etiketli bakteri PBS süspansiyonlar kurcalayarak tarafından sıvı peristaltik pompa araçlarının (akış oranı 4 mL/dk) 1s bir plaka termostat (Tablo reçetesi) kullanarak 37 ° C'de şartına bir 400 mL bakteriyel rezervuar (Şirket içi tasarım, Şekil 1) kullanarak için.</li>
	<li>Sürekli aynı toplama haznesi kullanarak 100 mL bakteriyel süspansiyon recirculate.</li>
	<li>Perfüzyon sonra greft serbest bırakmak ve doku parçası 4 mL ile iki kez PBS 3 dk her laboratuvar orbital çalkalayıcı kullanarak bir 12-şey plaka yıkama odası sökünüz. Daha sonra deri biyopsi kullanarak greft iç kısmı daha küçük çaplı yumruk kesti.</li>
	<li>Her doku biyopsisi 1 mL steril %0,9 içeren bir ayrı 14 mL tüp içine yerleştirin NaCl. Tüp #1 etiketleyin.</li>
	<li>10 dakikadır sonication banyo kullanarak doku bakterilerden ayırmak (genlik = % 100 ve frekans = 45 kHz). Not: Tam dekolmanı Greftler kuluçka gecede 37 ° C'de OD600 ölçümleri tarafından takip TSB sıvı ortamda düzeltme ekleri üzerine değerlendirilmelidir dokusundan bakterilerin bir bakteri ücretsiz çözüm ile tedavi yamaları kontrol kıyasla.</li>
	<li>Bir seri seyreltme yöntemi Mueller Hinton kan agar tabaklarda CFUs kullanın.<ol>
<li>Bir tek 14 mL tüp 10 mL sonication sonra elde edilen bakteriyel süspansiyon seri dilutions yapmak için steril serum fizyolojik ile hazırlayın. Bu tüp #2 olarak etiketleyin. Not: Her doku deney bir tüp 10 mL % 0,9 NaCl gerekli içindir.</li>
		<li>Üç 14 mL tüpler ile steril % 0,9 10 mL hazırlamak NaCl adım 2.7 ilk bakteriyel süspansiyon, seri dilutions için. #3, #4, #5 aşağıdaki gibi tüpler etiketleyin. Not: Bu adım bakteriyel süspansiyon perfüzyon deneme için kullanılan gerçek CFU numarasını bilmeniz gereklidir.</li>
		<li>Girdap karışımı her tüp için 15 s. girdap tüpler doku biyopsisi yanı sıra seri dilutions yapmak için ilk bakteriyel süspansiyon.</li>
		<li>Üç ağar kaplamalar, iki doku deney (perfüzyon bakteri ve PBS denetim perfüzyon) ve üçüncü bir perfusions için kullanılan ilk bakteriyel süspansiyon için hazırlayın.</li>
		<li>Doku denemede aşağıdaki şekilde 10-1, 10-3 ve 10-4plaka başına üç kesim etiket. CFUs bakteriyel perfusates içinde saymak için aşağıdaki gibi plaka etiket: 10-1, 10-3, 10-5 ve 10-7. Not: CFU/mL ise ertesi gün hesaplanan son sayısı Tabaklar 10-1, 10-3 ve benzeri gibi anlamlara tüm göstergeler agar üzerinde. Kontrol plaka her sektörlerde gerektirmez. Kullanmadan önce kan ağar kaplamalar laminer başlık altında yer olmalı ve aşırı nem kaldırmak için açtı.</li>
		<li>Seri dilutions hazırlanması devam etmek için tüpün #1 100 µL tüp #2 aktarmak ve kuvvetle girdap ile karıştırın.</li>
		<li>Tüp #1 ve #2 ilgili sektörler 10-1 üzerine içeriğinin 100 µL ve 10-3 agar plaka yayıldı. Aynı şekilde, sektör 10-4#2 metroyla 10 µL yaymak, 4 kat 4 ayrı büyümeleri 10 µL her birimden elde etmek için bu adımı yineleyin. Not: sektör 10-4üzerine kaplama için kullanılan küçük hacimli nedeniyle, bu damlacıkları yetişkin CFUs ortalama sayısı yapmak için birden fazla sayıda tavsiye edilir.</li>
		<li>İlk kültür seri dilutions hazırlamak için 100 µL bakteriyel süspansiyon, 2.7 adımından tube #3 aktarmak ve kuvvetle girdap ile karıştırın. 100 µL tüpün #3 #4 tüp ekleyin ve iyice karıştırın, sonraki tüp #5 için yordamı yineleyin.</li>
		<li>Tüpler #3 #4, #5 ve düzeltilmiş bakteriyel süspansiyon (2.7. adım), içeriğinin 100 µL sırasıyla, sektörler 10-3, 10-5, 10-7 ve 10-1 kan agar levha yayıldı.</li>
		<li>Laminer hood hava için kan agar levha bakteriyel yayılır, genellikle 10 dakika için kuru bırakın. Daha sonra tabakları gecede kuluçka için 37 ° C'de yerleştirin.</li>
		<li>Gecede kuluçka sonra yapışma doku biyopsisi hem de CFUs/mL perfüzyon için kullanılan başlangıç bakteriyel süspansiyon sonuçlanan CFUs dizi elde etmek için bakteri kolonileri saymak. Sonuçları CFU/cm2olarak hızlı.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. floresans mikroskobu doku perfüzyon üzerine gerek yapıştırılır bakteri
<ol><li>Perfüzyon sonra PBS ile doku parçaları yıkayın (bkz. Adım 3.5) ve daha küçük çaplı bir yumruk kullanarak bir greft iç kısmı kesilmiş.</li>
	<li>6-şey plaka hazırlamak ve montaj Orta (Tablo reçetesi) damlacıkları yerleştirin.</li>
	<li>Her parça bir doku ile perfused yüzeyi aşağı doğru montaj orta tek bir damla yerleştirin.</li>
	<li>Bir floresan inceden inceye gözden geçirmek (Tablo reçetesi) kullanarak bir tabak okuyun. Bakteriyel etiketleme için kullanılan bir fluorophore göre uyarma ve emisyon dalga boylarında parametrelerini ayarlamak.</li>
</ol>

<ol><li>Que, Y. A., Moreillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).</li>
<li>Werdan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+infective+endocarditis%3A+pathogen-host+interaction+and+risk+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states.</a> Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).</li>
<li>Moreillon, P., Que, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).</li>
<li>Jalal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+propensity+of+bovine+jugular+vein+material+to+bacterial+adhesions%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study.</a> International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).</li>
<li>Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systematic+Review+of+Infective+Endocarditis+in+Patients+With+Bovine+Jugular+Vein+Valves+Compared+With+Other+Valve+Types%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovascular+Interventions%22%5BJournal%5D)">A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types.</a> JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).</li>
<li>Malekzadeh-Milani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+predictors+of+Melody%28R%29+valve+endocarditis%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Cardiovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study.</a> Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).</li>
<li>Hill, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+prosthetic+valve+infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Management of prosthetic valve infective endocarditis.</a> American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).</li>
<li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clumping+factor+A%2C+von+Willebrand+factor-binding+protein+and+von+Willebrand+factor+anchor+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).</li>
<li>Fowler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+invasion+by+Staphylococcus+aureus+involves+a+fibronectin+bridge+between+the+bacterial+fibronectin-binding+MSCRAMMs+and+host+cell+beta1+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins.</a> European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).</li>
<li>Patti, J. M., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+adhesins+recognizing+extracellular+matrix+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).</li>
<li>Massey, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-binding+protein+A+of+Staphylococcus+aureus+has+multiple%2C+substituting%2C+binding+regions+that+mediate+adherence+to+fibronectin+and+invasion+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).</li>
<li>Jashari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Belgian+and+European+experience+with+the+European+Homograft+Bank+%28EHB%29+cryopreserved+allograft+valves--assessment+of+a+20+year+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Chirurgica+Belgica%22%5BJournal%5D)">Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity.</a> Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).</li>
<li>Cheatham, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+hemodynamic+outcomes+up+to+7+years+after+transcatheter+pulmonary+valve+replacement+in+the+US+melody+valve+investigational+device+exemption+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial.</a> Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).</li>
<li>Que, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibronectin+binding+cooperate+for+valve+infection+and+invasion+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).</li>
<li>Veloso, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adherence+to+graft+tissues+in+static+and+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).</li>
<li>Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus%2C+master+manipulator+of+the+human+hemostatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).</li>
<li>Chiu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+increases+ICAM-1+and+decreases+VCAM-1+and+E-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-%5Balpha%5D+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artheriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).</li>
<li>Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+tissue+engineering%3A+a+new+laminar+flow+chamber+for+in+vitro+improvement+of+mechanical+tissue+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties.</a> ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).</li>
<li>Veltrop, M. H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Species-+and+Strain-Dependent+Induction+of+Tissue+Factor+in+Human+Vascular+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).</li>
</ol>

Son klinik gözlemler kapak replasmanı RVOT6,13geçirmiş hastalarda bir komplikasyon olarak IE özel bilinci vermek. Disfonksiyon IE implante Vana geniş inflamatuar procoagulant reaksiyonları1,ve14için önde gelen endovasküler greft ile bakteri etkileşim sonucudur. Sunulan roman vitro modeli doku yapıları ve bakteriyel etkenler farklılıklar in vivo kullanılan greft15e...

Staphylococcus aureus (S. aureus) virülans stratejileri sepsis gibi ağır damar içi enfeksiyonlar neden insan dolaşımda implante biyolojik veya biyolojik olmayan yüzeyleri kolonileşmesi ana bilgisayar bağışıklık savunma sistemini aşmak için çeşitli istihdam ve IE1,2,3,4,5. Önemli bir tedavi protez kalp kapakları IEare başlangıcı için katkıda bulunmak değil bireysel faktörler henüz tam olarak anlaşılır6,7süre implantasyonu sonrası hastaların komplikasyon ilişkili IE kalır. Akış koşullar altında gemi Duvar8' e uymak için üstesinden gelmek için ihtiyaç duydukları kesme kuvvetleri bakteri karşılaşma. Vivo durum daha fazla yansıttıkları gibi modeller, bakteri ve protez kapak doku veya akış altında endotel arasındaki etkileşimi eğitim sağlayan ilgi vardır.
Çeşitli özel mekanizmalar bakteriyel bağlılık endotel hücreleri (ECs) ve doku kolonizasyon ve vejetasyon ve IE9temel erken adımlar olmak, olgunlaşma maruz subendothelial matris (ECM) kolaylaştırmak. Çeşitli Stafilokokal yüzey proteinleri veya MSCRAMMs (yapışkanlı matris molekülleri tanıma mikrobiyal yüzey bileşenleri) aracı yapıştırılması konak hücreleri ve ECM proteinler moleküllerin fibronektin ile etkileşerek tarif edilmiştir, fibrinojen, kollajen ve von Willebrand faktör (VWF)8,10,11. Ancak, çoğunlukla statik koşullarda okudu bazı virülans faktörleri intra moleküler katlama ışığında çok bu etkileşimlerin endovasküler enfeksiyonlar kan dolaşan içinde farklı alaka olabilir.
Bu nedenle, ECM ve ECs farklı bileşenleri RVOT bulunduğu implante doku greft bağlamda bakteriyel bağlılık değerlendirmesini sağlar bir in-house tasarlanmış vitro paralel-plaka akışı odası modeli mevcut. Bu çalışmada açıklanan yöntemi genel amacını bakteri ve temel endovasküler dokularda kan dolaşımına patojenler vivo içinde çevre gibi birbiriyle yakından ilişkili akışı koşulları arasındaki etkileşim mekanizmaları incelemektir S. aureus. Bu yeni yaklaşımın duyarlılık geliştirme IE için potansiyel risk faktörleri tanımlamak için bakteriyel bağlılık için greft doku yüzeylerin üzerinde duruluyor.

<table><tbody><tr><td>Sığır Perikard (BP) yaması, Esnek Peri-Guard Pericardium</td><td>Synovis Cerrahi Yenilikleri, ABD</td><td>PC-0404SN</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Juguler Ven kanalları (BJV)</td> <td>Contegra kanalı; Medtronic Inc, ABD</td><td>M333105D001</td><td></td></tr><tr><td>CH dondurularak saklanmış homogreft</td><td>Avrupa Homogreft Bankası (EHB)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Acu-Punch</td><td>Acuderm Inc, ABD</td><td>P850 (8 mm); P1050 (10 mm)</td><td></td></tr> <tr><td>insan Albümini</td><td>Flexbumin; Baxter, Belçika</td><td>BE171464 LOT:16G12C</td><td></td></tr><tr><td>Triptik soya suyu (TSB)</td><td>Fluka, Steinheim, Almanya</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kalp infüzyon suyu (BHI)</td><td>Fluka</td><td>53286-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS).</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>5 (6) -Karboksifloresein N-hidroksisüksinimi ester (CF)</td> <td>Sigma-Aldrich, Almanya</td><td>21878-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa (MODEL ISM444B)</td> <td>Ismatec BVP-Z Standardı; Cole Parmer, Wertheim, Almanya</td><td>631942-2</td><td></td></tr><tr><td>Sonication banyosu</td><td>VWR Ultrasonik Temizleyici; VWR, Radnor, PA</td><td>142-6044</td><td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td></tr><tr><td>ProLong Altın Antifade Mountant</td><td>Invitrogen by ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2000 (floresan tarayıcı)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Arium Pro VF - ultra saf su - H2O</td><td>MilliQ Millipore</td><td>87206462</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobik slaytlar - Doku Kültürü Odaları (1 kuyulu)</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td></td></tr><tr><td>Lumox üzerinde 1 kuyulu çıkarılabilir</td><td>Sarstedt</td><td>94.6150.101</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik - cerrahi Bıçaklar</td><td>Swann-Morton</td><td>311</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Silikon Boru, 1/8 "ID x 1/4" OD</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-06</td><td>Sıcaklık aralığı: &ndash; 80 ila 200 derece; C Sterilize: Etilen oksit, gama ışınlaması veya otoklav ile 30 dakika, 15 psi basınç</td></tr><tr><td>PharMed BPT Boru</td><td>Saint-Gobain</td><td>AY242012</td><td>121 ° C'de 30 dakika otoklavlanabilir; C</td></tr><tr><td>Tygon LMT-55 Boru</td><td>Saint Gobain Performans Plastik ve Ticaret;</td><td></td><td></td>15312022</tr><tr><td>Termostat</td><td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td><td>300-0042</td><td>230V, 90VA, 50Hz</td></tr></tbody></table>

vitro modeli doku grefti bakteriyel bağlılık çalışmaya paralel-plaka perfüzyon sistemi

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Çeşitli vanalı borular ve valfler stent takılan sağ ventrikül çıkım yolu (RVOT) kapak replasmanı konjenital kalp hastalığı olan hastalarda kullanılır. Protez malzeme ancak kullanırken, bu Greftler bakteriyel enfeksiyonlar ve çeşitli ana bilgisayar yanıt yatkındır.
Mikroorganizmaların endovasküler bağlılık içinde hayati bir rol oynamaktadır bakteriyel ve ana faktörler tanımlaması enfektif endokardit (IE) gibi enfeksiyonlar başlangıcı Patofizyoloji daha iyi anlamak ve önleyici geliştirmek için önemlidir stratejileri. Bu nedenle, fizyolojik kesme koşullar altında bakteriyel yapışma araştırmak için yetkili modelleri geliştirilmesi gereklidir. Burada, farklı bileşenleri greft dokuların bakteriyel bağlılık incelenmesi gibi hücre dışı matriks, endotel hücreleri ve etkisiz alanlarda maruz sağlar paralel tabaklarda dayalı yeni tasarlanmış vitro perfüzyon odaya nasıl kullanılacağını açıklar . Bu yöntem kombine koloni oluşturan ile sayım birimi (CFU) greft malzemeleri eğilimi bakteriyel yapışma akış altında doğru değerlendirmek için yeterli olduğunu. Daha fazla, akış odası sistemi rol kesme koşullar altında bakteriyel yapışma kan bileşenlerinin araştırmak için kullanılabilir olur. Biz bizim in-house tasarlanmış vitro perfüzyon modelini kullanarak doku gerek bakteriyel uyum içinde önemli belirleyici faktörler doku, onların yüzey morfolojisi ve bakteriyel türler özgüllük kaynağı değildir gösterdi.

Arkasında mekanizmaları daha iyi anlamak için IE geliştirme, bu model sağlar bakteriyel değerlendirilmesi ve doku ilişkili faktörler enfeksiyon başlangıçlı vivo içinde durumda mevcut.
Ayrıntılı olarak, 3-10 dyne fizyolojik aralığında kesme stresleri uygulamakla doku üzerinde fluorescently etiketli bakteri ventriküler tarafından akış koşullarında farklı greft dokulara bakteriyel yapışma ölçmek için roman vit...

Bakteriyel bağlılık doku grefti incelenmesi sağlar bir in-house tasarlanmış vitro akışı odası modeli açıklar.

Vitro modeli doku grefti bakteriyel bağlılık çalışmaya paralel-plaka perfüzyon sistemi

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Bu yöntem, enfektif endokardit patogenezinde anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, ve bakteri arasındaki etkileşim gibi alanlarda patobiyogramlar, kan hücreleri, ve kas astar endotel hücreleri. Bu tekniğin en büyük avantajı doku greftlerinin standart akış koşullarında bakteri, trombosit ve protein gibi çeşitli hedeflerle karşılıklı etkileşimlere doğrudan maruz kalınmasıdır. Bu tekniğin etkisi, bazı dokuların yüksek enfektifliğini yönlendiren önemli moleküler etkileşimleri ve faktörleri çözebildiği için, enfektif endokardit tedavimize kadar uzanır.Bu yöntem bitki oluşumunun patogenezine ışık verir. Ayrıca vasküler geçirgenlik, hücre hareketliliği ve gen hücresi ekspresyonunu araştıran çalışmalarda da uygulanabilir. Protokolü başlatmak için, önceden hazırlanmış doku biyopsisini 10 milimetre çapında yerleştirin ve mikroskop kaydırağı ile sekiz milimetrelik dairesel perforasyon arasında aynı kalınlıkta ve iç yüzeye bakan kauçuk bir conta yıpranarak bakteriyel süspansiyona temas edin.Tutucuya yerleştirilirken doku grefti oryantasyonuna odaklanın. Dokunun iç yüzeyinin deneysel ortamınızla iletişim kurmak için kan dolaşımına maruz kaldığından emin olun. Daha sonra, haznenin alt metal çerçevesine gömülü conta kağıdına mendil ile birlikte takın.Üst metal çerçeveyi ilgili conta levhasıyla daha önce takılmış doku tutucusu ile birlikte odanın altına takın. Sonra sekiz vida ve vida somunları ile tüm oda monte. Bir kaliper veya cetvel kullanarak oda yüksekliği greftler arasında her zaman aynı olduğundan emin olun.Sonraki peristaltik pompa ile akış odası bağlayın. Sonra tüpler ile 400 mililitrelik sıvı rezervuar bağlayın. Peristaltik pompa ve bakteri rezervuarı kullanarak bir saat boyunca dakikada üç yemek santimetre başına üç yemek ve buna karşılık gelen akış hızı ile fosfat tamponlu tuzlu salin içinde yedi floresan etiketli koloni oluşturan birimleri on 100 mililitre süspansiyonlar ile dokuları perfuse.Aynı toplama rezervuarı kullanarak sürekli 100 mililitrelik bakteriyel süspansiyon recirculate. Perfüzyondan sonra, grefti serbest bırakmak için odayı sökün. Üç dakika boyunca bir orbital shaker kullanarak 12-iyi plaka pBS dört mililitre ile doku parçası iki kez yıkayın.Daha sonra daha küçük çaplı bir deri biyopsisi yumruk kullanarak greft iç kısmını kesin. Her doku biyopsisini bir mililitre steril %0.9 sodyum klorür içeren ayrı bir 14 mililitrelik tüpe yerleştirin. 10 dakika boyunca bir sonication banyo kullanarak doku dan bakteri ayırmak.Sonication sonra elde edilen bakteriyel süspansiyon seri seyreltme yapmak için steril% 0.9 sodyum klorür 10 mililitre ile tek bir 14 mililitretüp hazırlayın. İki numaralı tüpü etiketle. Profüzyon deneyine götürülen ilk bakteriyel süspansiyonun seri seyreltmeleri için 10 mililitre steril %0,9 sodyum klorür içeren üç tane 14 mililitrelik tüp hazırlayın.Tüpleri üç, dört ve beş numaralı tüpleri etiketle. Sonra, güvenli üç agar plakaları, bakteriyel perfüzyon için bir, PBS kontrol perfüzyon u için bir, ve perfüzyon için kullanılan ilk bakteriyel süspansiyon için üçüncü. Doku deneyi için plaka başına üç sektörü aşağıdaki şekilde etiketle:10-1, 10-3 ve 10-4.Bakteri perfüzyonundaki koloni oluşturan birimlerin sayısını saymak için plakayı aşağıdaki gibi etiketlayın:10-1, 10-3, 10-5 ve 10-7. Girdap 15 saniye boyunca doku biyopsisi içeren tüpler, seri seyreltme yapmak için. Seri seyreltmeleri hazırlamak için, 100 mikrolitre tüpü n için bir numaralı tüpü iki numaralı tüpe aktarın ve çözeltiyi iyice karıştırmak için tüpü girdaplayın.1 numaralı ve iki numaralı tüpün içindekilerin 100 mikrolitresini ilgili sektörlere, 10-1 ve 10-3 numaralı agar plakasına yayın. Sonra sektör 10 dört üzerinde iki numaralı tüp 10 mikrolitre yayıldı. 10 mikrolitrelik her birimden dört ayrı büyüme elde etmek için bu adımı dört kez tekrarlayın.İlk kültürün seri seyreltmelerini hazırlamak için, ilk olarak seyreltme 15 saniye girdap ve 100 mikrolitre bakteriyel süspansiyonu üç numaralı tüpe aktarın ve girdap yaparak şiddetle karıştırın. Dört numaralı tüpe 100 mikrolitre tüp ekleyin ve tekrar karıştırın. Dört numaralı tüpten beş numaralı tüpün prosedürünü tekrarlayın.Üç numaralı, dört numara, beş numaralı tüplerin içindekilerin 100 mikrolitresini ve etiketli ilk kültürü sırasıyla 10-3, 10-5, 10-7 ve 10-1 kan agar plakası olan sektörlere yayın. Genellikle 10 dakika boyunca, bakteriyel yayılır hava için laminar başlık altında kan agar plakaları bırakın. Daha sonra, gece kuluçka için 37 santigrat derece plakaları yerleştirin.Gece kuluçka sonra, Cpu sayısını elde etmek için bakteri kolonileri saymak. Katıksız stres koşulları altında, çeşitli greft dokuları arasında benzer bakteriyel eki hem staphylococcus aureus hem de staphylococcus epidermidis enfeksiyonu için gözlendi. Prosedürleri takiben, streptococcus sanguinis sığır perikard yama ile karşılaştırıldığında, sığır juguler ven duvarına bağlılık önemli azalma gösterdi.Streptococcus sanguinis, üç bakteri türünü karşılaştırırken, staphylococcus aureus ve staphylococcus epidermidis ile ilişkili olarak sığır juguler ven duvarına önemli ölçüde daha düşük yapışma sağlar. Bu prosedürü çalışırken, aynı kafanın doğru dokuları hazırlanmış olması hatırlamak önemlidir. Tüm deney numuneleri arasında benzer koşullar sağlayacak ve farklı deney serileri arasındaki veri değişkenliğini en aza indirir.Bu teknik, geliştirilmesinden sonra araştırmacıların tıbbi duruma yakın tam bir karmaşıklık oluşturmak için in vitro model yaklaşımlarını farklı unsurlarla zenginleştirerek karmaşık bozukluk sistemlerini adım adım keşfetmelerine olanak sağlar.

an-vitro-model-parallel-plate-perfusion-system-to-study-bacterial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Mikrovasküler ölçekli kanallar (&lt;30 um) ile bir mikroakışkan cihazın bütün iç yüzeyi boyunca kültürün 3B, endotel hücre mono tabakasında için bir yöntem tarif edilmiştir.

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Kaynak: Ditkowski, B. ve diğerleri. Greft dokularına bakteriyel yapışkanlığı incelemek için paralel plaka perfüzyon sisteminin in vitro modeli. J. Vis. Exp. (2019).Bu video, paralel plakalı akış odası kullanılarak floresan etiketli bakterileri damar greft dokuları üzerinde perfüze etme yöntemini göstererek, kesme akış koşullarında bakteriyel yapışma ve erken patogenezin kontrollü analizini mümkün kılmaktadır.

In vitro paralel plaka akış modeli, doku biyopsisinde bakteriyel yapışmayı incelemek için

Kaynak: Calatayud Arroyo, M. ve diğerleri. In vitro bağırsak konak-mikrob arayüzünde sentetik bakteriyel konsorsiyumunun uygulanabilirliğinin değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018).Bu video, bakteriyellerin canlılığını incelemek için in vitro bağırsak konakçı-mikrop modelini gösteriyor. Caco-2 ve HT29-MTX hücrelerinin ortak kültürü, simüle edilmiş sindirim koşullarında önceden işlenmiş bakterilerle kuluçka geçirilir. Epitel bariyer bütünlüğü transepitelyal elektriksel direnç kullanılarak...

Bakteriyel Yapışma ve İçselleştirmeyi Değerlendirmek İçeriği Değerlendirmek İçerik Bağırsak Modeli

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Neisseria meningitidis kan damarları bulaşan bir insan özgü patojendir. Bu protokolde insan mikrodamarlar bağışıklığı fare üzerine insan cildi aşılama yaparak bir fare sokulur. Bakteriler genellikle insan durumda gözlenen purpurik döküntü vasküler hasar ve gelişimine yol açan, insan gemilere yoğun yapışır.

Insanlaşmış Fare Modeli mikrovaskülatürde Hedefleme Bakteriyel Enfeksiyonlar Eğitim için

Bakterilerin kesme gerilimi altındaki kan damarları ile etkileşimini incelemek için, vasküler yapışmaya katkıda bulunan bakteri ve konak faktörlerini incelemeye izin veren bir akış odası ve in vivo mezenterik intravital mikroskopi modeli tanımlanmıştır.

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Bu protokol, hasta kaynaklı ksenogreftlerin (PDX) genişletilmiş in vitro kültürünü mümkün kılacak yöntemleri göstermektedir. Bir adım, 3D hidrojellerde çok hücreli küme kültürlerinin genel canlılığını, canlı olmayan tek hücrelerin doğrudan çıkarılması yoluyla artırır. İkincibir adım, pdx kültürü için en iyi uygulamaları perfüzyonlu mikroakışkan bir platformda gösterir.

Perfüzyonlu Mikroakışkan Platformda Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Ex vivo 3D Hidrojel Kültürleri için Geliştirilmiş Canlılık

Bu protokol, perfüzyonda kan damarlarının ex vivo kültürü için yeni geliştirilen, 3D baskılı bir biyoreaktörün kurulumunu ve çalıştırılmasını sunar. Sistem, diğer kullanıcılar tarafından kolayca benimsenebilecek, pratik, uygun fiyatlı ve temel biyoloji ve farmakolojik çalışmalar gibi farklı deneysel uygulamalara uyarlanabilir şekilde tasarlanmıştır.

Ex Vivo (Canlı Canlı) 3D Baskılı Biyoreaktörde Büyük Kan Damarlarının Perfüzyon Kültürü

Öğrenin, doku greftlerinde bakteriyel bağlılığı in vitro akış odası modeliyle nasıl incelenir. Bu yöntem, enfektif endokardit patogenezini ve bakteri-hücre etkileşimlerini anlamak için değerlidir.

Vitro modeli doku grefti bakteriyel bağlılık çalışmaya paralel-plaka perfüzyon sistemi

Daha fazla video keşfet