쥐의 행동 Audiometry를위한 저비용 설정

Published 10/16/2012
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Neuroscience

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Summary

손상 또는 유령 인식 (주관적 이명)을 듣고, 청력 임계 값과 같은 매개 변수를 청각의 행동 결정에 대한 신속하고 저렴한 방법을 설명합니다. 그것은 음향 펄쩍 뛰게하다 응답의 사전 펄스 억제를 사용하여 쉽게 프로그래밍 AD / DA-컨버터 및 압전 센서를 사용하여 개인용 컴퓨터에 구현 될 수있다.

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Tziridis, K., Ahlf, S., Schulze, H. A Low Cost Setup for Behavioral Audiometry in Rodents. J. Vis. Exp. (68), e4433, doi:10.3791/4433 (2012).

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Abstract

청각 동물 연구에서는이 실험에 참여하는 동물 과목의 기본 심리 매개 변수에 대한 정확한 정보가 중요합니다. 이러한 매개 변수는 brainstem의 audiometry (BERA)를 통해 예를 들어 청각 경로의 생리적 반응 특성 수 있습니다. 그러나 이러한 방법이 생리적 매개 변수에 해당하는 청각 percept에 대한 유일한 간접적과 불확실 extrapolations 할 수 있습니다. 청각의 지각 수준을 평가하기 위해, 행동 방법을 사용할 수 있습니다. 동물 모델에서 인식의 설명에 대한 행동 방법의 사용과 잠재적 인 문제가 이러한 방법의 대부분은 과목이 behaviorally 테스트하기 전에 패러다임을 학습 일종의을 포함 있다는 사실입니다, 예를 들어 동물에 레버를 누르면 학습 할 수 있습니다 소리에 대응. 이러한 학습 패러다임 변화 인식 자체 1,2로써, 그들은 결과적으로 얻은 인식에 대한 결과에 영향을 미칠 것입니다이러한 방법을 따라서는 신중하게 해석해야합니다. 예외는 여기 더 학습 패러다임이 지각 테스트하기 전에 수행 할 필요가 없습니다 때문에, 반사 반응의 사용을 패러다임입니다. 하나의 반사 반응은 매우 reproducibly 순진한 동물의 예상치 못한 큰 소리로 elicited 할 수있는 음향 펄쩍 뛰게하다 응답 (ASR)입니다. 차례로이 ASR이 앞의 자극의 지각에 따라 소리를 이전에 의해 영향을받을 수 있습니다 : 잘 액이 완전히 ASR의 진폭을 억제합니다 청각 위 같은데, 약간 ASR을 억제합니다 임계 값에 가까운 소리. 이러한 현상은 점차 사전 펄스의 지각에 따라 달라집니다 ASR에 대한 사전 펄스가 억제 (PPI) 3,4를하고, PPI의 양이라고합니다. ASR의 PPI 따라서 잘 청각 장애를 결정하거나이 가능 주관적 이명에 percepts를 검색, 순진한, 비 훈련 동물의 행동 audiograms를 결정하기 위해 적합합니다동물. 이 논문에서 우리는 쥐 모델 (참조하라도 심판 5.)에이 방법의 사용을 설명입니다 몽골 쥐 (Meriones unguiculatus), 잘 정상적인 인간의 청각 범위 내에서 펄쩍 뛰게하다 반응 연구 모델 동물을 알고 (예 : 6).

Protocol

1. 설치 프로그램은 조립 및 소프트웨어 프로그래밍

  1. 개인 컴퓨터 (예 : NI PCI 6229, 내쇼날 인스트루먼트)에 D / A 카드를 설치하고 브레이크 아웃 박스 (예 : BNC-2110, 내쇼날 인스트루먼트)에 연결, 모두 적어도 하나의 입력과 하나의 출력 채널을 지원해야 최소 44.1 kHz에서 각각의 샘플링 속도로.
  2. 소리 증폭기에 BNC 케이블 (: AMP75 광대역 전력 증폭기, 토마스 울프 등)를 통해 브레이크 아웃 박스의 출력을 연결합니다.
  3. 어둠 속에서 동물 감시를위한. : 적외선 웹캠 (그랜드 IP 카메라 프로 GrandTec 전자 등)를 설치
  4. 그림 1에 주어진 순서도에서 정의 된 프로그램을 구현하기 : 통합 개발 환경을 (MATLAB 등) 설치합니다. MATLAB 2007b에서 실행되는 버전은 해당 저자에서 무료로 얻을 수있다.
  5. 방음 챔버 내에 테이블에 스피커를 설치합니다. 스피커 t를 연결사운드 앰프 O.
  6. 절연 보드의 상단에 압전 센서 (예 : 힘 센서 FSG15N1A, 하니웰)를 설치, 전력으로 지원하고 브레이크 아웃 박스의 입력에 BNC 케이블을 통해 연결, 접지 센서 신호.
  7. (: 길이 15cm, 내경 4.3 cm, 외경 4.8 cm 쥐의 예)을 측정 할 수있는 쥐의 크기 조정 아크릴 유리 튜브에서 측정 챔버를 구축합니다. 튜브의 전면에 0.5 mm의 메쉬 폭과 후면에 잠금 장치 (예를 들어, 후크)와 쿠션 문 창살 문제를 해결했습니다. 고정은 경첩과 후크의 보석금이 튜브에 고정되어있는 문, 뜨거운 접착제를 수행 할 수 있습니다.
  8. 절연 센서 보드에 측정 튜브 크기에 맞게 발포 플라스틱 발을 연결합니다. 발은 전면 및 후면 끝에서 튜브를 지원하고 센서 수준으로 관을 들어해야합니다. 압전 센서 및 측정 챔버 사이의 빛 연락처가 있는지 확인합니다. 스피커 앞에 중심으로 측정 챔버와 센서 보드를 수정하고 (예 : B & K 타입 2669 / B & K 타입 4190 앰프 B & K 타입 2610, 모든 측정에 연결 : 브루 엘과 Kjaer) 옆에 사운드 제어를위한 마이크를 넣어 수준에 동물의 머리 있도록 그 관을 방해하지 않습니다.
  9. 당신의 audiometric 데이터의 품질이 사운드 시스템의 품질에 따라 달라됩니다. 어떤 경우, 첫 번째 실험하기 전에 시스템의 주파수 전달 함수를 결정하고 스피커 평면의 스펙트럼 출력을하기 위해이 주파수 전달 함수에 대한 해결하기 위해 소프트웨어의 루틴을 포함하는 마이크 및 측정 증폭기를 사용합니다.
  10. 사람이 동물 행동을 모니터링 할 수 있도록 설정과 웹캠을 맞 춥니 다.

2. 청각 임계 값의 행동 결정 (Audiograms)

  1. 의 홈 케이지에서 가축을 압수하고 관에서 헤드 퍼스트 넣어, C문을 잃게됩니다.
  2. 폼 피트와 센서에 관을 놔. 모든 빛을 끄고 챔버에 문을 닫습니다. 챔버 자체는 에어컨 것이 아니라 온도, 습도 및 주변 연구실의 다른 환경 변수가 있습니다. 환풍기로 공기 변경으로 인해 유도 잡음에 좋습니다 것이 아니라 챔버의 볼륨은 많은 시간 동안 동물 산소를 지원하고 있습니다. 동물이 설정에 익숙해 할 수 있도록 15 분 정도 기다립니다. 그것의 자신의 진도에 진정 할 수 있으며 튜브에 익숙해 같은 새 환경 순응 시간은 동물에 유용합니다. 다른 한편으로는, 하나가 여러 세션을 통해 새 환경 순응 시간 동안 동작에서 차이를 볼 수 없습니다, 그 전에 실험 튜브와 챔버와 동물을 familiarizing에 대한 추가 세션이 필요하지 않음을 나타냅니다.
  3. 프로그램을 시작하고 (참조하라도 심판 5.) 자극에 대한 매개 변수를 정의 : 자극은 다른 fre과 순수한 음색으로 구성quencies. 펄쩍 뛰게하다 자극이 reproducibly 펄쩍 뛰게하다 응답을 이끌어내는만큼 높은 사운드 압력 레벨이 표시되어야합니다. 우리 연구실에서는 몽골 쥐에 펄쩍 뛰게하다 응답을 유도하기 위해 105dB SPL (자극 기간이 6 밀리 2 MS 코사인 제곱 상승 및 가을 경사로를 포함)의 농도를 사용합니다. 펄쩍 뛰게하다 자극을 이전 테스트 자극은 일반적으로 다음 잘 임계 값 이상, 종의 전체 음성 범위를 포괄 주파수와 레벨 임계 값을 듣고에서 테스트 할 수있는 범위에서 주파수와 강도를 변화를 제시하고 있습니다. 주파수 및 펄쩍 뛰게하다 및 테스트 자극의 기간은 각 재판에 일치, 펄쩍 뛰게하다 및 테스트 자극 사이의 interstimulus 간격 100 밀리로 설정되어 있습니다. 각 주파수 및 테스트 자극의 강도 조합 (참조하라 그림 2A, 왼쪽)에 10 무작위 interstimulus 간격으로 최소 15 반복 ± 2.5 초를 사용합니다. 후속 테스트 자극은로 표시 할 수 있습니다 무작위 또는 비 운영 중domized 순서. 이 아닌 무작위 접근 방식을 사용하는 경우 (예를 들어, 모든 테스트 주파수를 고정 하나의 테스트 자극 수준) 다른 자극 세트 사이에 회복 5 분 할 수 있습니다. 임계 값의 결정 절대 임계 값은 자극의 임의에 따라 달라집니다 점에 유의하지만, 가능한 한 상대 교대는 (음향 외상 후 예를 들어, CF. 심판. 5) 안돼.
  4. 데이터를 분석하기 전에 데이터 세트 (., CF 그림 2B 예를 들어, 동물이 펄쩍 뛰게하다 자극하기 전에 이동 재판)에서 유효하지 않은 재판을 제거합니다.
  5. 펄쩍 뛰게하다 자극 후 처음 50 밀리의 시간 창 내에서 응답 진폭 (응답의 첫 번째 최소한으로 최초의 최대 사이의 최대 피크)과 각 단일 시험의 응답 지연을 (응답 발병에 자극 시작부터 시간) 계산 .
  6. 모든 유효한 s​​ingl에 대한 prestimulus 강도에 정렬 한 주파수 세트 전체 응답 진폭 데이터에 볼츠만 기능에 맞게전자 재판. 볼츠만 기능 7 50 % 요점은이 자극 주파수의 청각 임계 값을 나타냅니다.

3. 청각 장애의 음향 외상 및 정량화

  1. 4 MG / kg (Rompun 2 %, 바이엘), 아트로핀 황산 : 1 밀리그램 / kg (Atropinsulfat; xylazine 하이드로 클로라이드 96 밀리그램 / kg (Ketamin-ratiopharm, Ratiopharm) : 케타민 염산염의 혼합물과 케타민-xylazine - 마취 준비 9:1​​:2:8의 비율로 B. 브라운 Melsungen AG)와 생리 NaCl - 솔루션 (베를린 Chemie AG, 베를린).
  2. 3 ML / 마취 피하의 kg과 동물을 주사. 동물이 깊이 anesthetized 될 때까지 기다려 (ca. 5 분, 반사 신경을 확인 예를 들어, 페달 탈퇴 반사를 사용하여). 측정하는 동안 마취를 유지하려면 지속적으로 3 ML / kg / 주사기 펌프를 사용하여 시간의 속도로 마취 솔루션을 주입. 적절한 장비와 생체 신호 (예를 들어, 카메라를 통해 호흡)을 제어하고 placi하여 동물의 따뜻한 유지NG 그것을 온난화 패드 있습니다.
  3. 음향 외상을 유도, 예를 들어 큰 순수한 음색 사용 : 75 분 동안 115dB SPL에서 예를 들면 2 kHz에서합니다.
  4. 외상의 끝 후에 주사기 펌프를 중지하고 조용한 곳에서 지구 온난화 패드에 웨이크 업 케이지 깨어있는 동물을 보자. 생체 신호가 안정적 경우 각성 단계에서 정기적으로 확인하십시오. 완전히 깨어 만의 홈 케이지에 동물을 놔. 동물이 마취 (적어도 2 일)과 홈 케이지에서 휴식 복구 보자.
  5. 다시 2.1-2.6을 수행합니다. 각 주파수에 대해 청각 상실의 비율을 계산하여 음향 외상 전후 청력 임계 값을 비교합니다. 모든 실험이 끝난 후에 painlessly 동물을 안락사시켜야.

4. 음향 환상의 인식에 대한 시험 (주관적 이명)

  1. 음향 외상 전후 이러한 측정을 수행합니다.
  2. 동물이 설정에없는 경우 2.2-2.1을 따르십시오.
  3. N자극의 패러다임의 암갈색은 주관적인 이명에 대한 설치류를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 모든 접근 방법의 비율은 배경 소음에서 자동 갭의 특징에 대해 테스트하는 것입니다. 갭이 동물에 의해 인식되는 경우, 그것은 유사하게 2에서 설명하는 절차에 펄쩍 뛰게하다 응답을 줄이기 위해 테스트 자극으로 사용할 수 있습니다. 동물이 이명 (음향 외상 후 개발 가능성입니다)를 앓고있는 경우,이 이명은 자동 간격에서 인식하기 때문에 격차가 덜 두드러하게 될 것입니다. 펄쩍 뛰게하다 응답에 차이의 효과는 결과적으로 건강한 컨트롤 (PPI, CF. 8 감소)에 비해 이명 동물에 약한 것입니다. 이 percept 두 약간 다른 프로토콜과 테스트됩니다.
  4. 한 옥타브 단계 stimul 1에서 16 kHz에서까지 주파수를 펄쩍 뛰게하다 사운드 강도 105dB SPL : 여기에 제시된 첫 번째 주관적 이명 패러다임에서 (. 그림 2A, 센터, CF 9) 자극에 대한 다음 매개 변수를 사용우리의 2 MS 코사인 제곱 상승과 가을 램프를 포함 길이 6 밀리. 하나와 함께 또는 100 밀리하여 펄쩍 뛰게하다 자극 앞에 15 밀리 초 간격없이 실험이 진행되는 동안 50dB SPL의 백색 잡음 배경을 제시, 각 주파수와 갭 상태에 적어도 15 재판 선물. 비 무작위 접근 방식을 사용하는 경우 다른 자극 세트 사이에 5 분 복구 할 수 있습니다. 다른 펄쩍 뛰게하다 자극 주파수의 사용은 감지 이명 주파수의 대략적인 견적을 제공합니다.
  5. 두 번째 주관적인 이명 패러다임 (그림 2A, 오른쪽)으로 다음과 같은 자극 매개 변수를 사용할 수 있습니다 펄쩍 뛰게하다 사운드 강도 105dB SPL, 더블 클릭 당 0.1 밀리 기간 및 클릭 사이에 0.1 밀리, 역 방향을 갖는 두 번째 클릭으로 자극을 클릭합니다 첫 번째에 비해. 1 옥타브 단계에서 16 kHz에서에 이르기까지 0.5 octaves 및 센터 주파수의 가우시안 필터 폭과 50dB SPL의 대역 통과 필터링 노이즈 배경을 제시한다. 이 소음 안녕을 제시현재 최소 15 시련 각 주파수와 갭 조건, 100 밀리로 펄쩍 뛰게하다 자극 앞에 15 밀리 차이에 상관없이 군터. 비 무작위 접근 방식을 사용하는 경우 다른 자극 세트 사이에 5 분 복구 할 수 있습니다. 대역 통과 배경 소음의 다른 중심 주파수의 사용은 감지 이명 주파수의 대략적인 견적을 제공합니다.
  6. 2.5-2.4에 따라,. 각 시험 주파수에 대해 설정된 기준 데이터와 각각의 외상 조건, 즉, 음향 외상 전후 모든 획득 데이터를 정상화. 이 참조는 prestimulus (참조하라 2.3)없이 순수 톤 펄쩍 뛰게하다의 자극에 응답 진폭입니다. 주파수는 대역 통과 필터링 노이즈의 순수한 톤 또는 중심 주파수 중 하나로 결정됩니다. 각 참조의 평균 응답을 계산하고 참조를 통해 나누어 각 계산 응답 진폭을 정상화.
  7. 간격 conditio의 정규화 된 응답 진폭을 나누어 PPI를 계산N 각 테스트 주파수의 정규화 된 노 간격 조건의 평균을 통해.
  8. 각 테스트 주파수에 대한 백분율로 외상 후 PPI의 변화를 계산할 수 있습니다.

동물의 펄쩍 뛰게하다 응답 생성 할 수 있고 분석 할 수 쉽습니다. 그림 2B는 15 회에 대한 prestimulus없이 105dB SPL의 순수한 톤을 자극 한 동물의 전형적인 결과의 개요를 보여줍니다. 재판의 대부분은 유효하거나 유효하지 않은 재판은 (재판은 붉은 광장 (Red Square)에 의해 표시) 인식 할 수 쉽습니다. 응답 진폭과 대기 시간은 유효한 시험에서 계산됩니다.

전형적인 행동 임계 값 변경은도 3a에 제공됩니다. 2에 설명 된 방법으로 획득 한 모범적 인 동물의 audiogram은 2 kHz로 (노란색 영역)에서 음향 외상 전에 (파란색)과 (적색) 후 제공됩니다. 맑은 청력 손실은 2 kHz에서에서 구체적으로 표시됩니다. 주관적인 이명 percept에 관한 답변이 될 수 있습니다4.5에 설명 된대로 그림 3B에서 볼 수 위와 같은 동물의 정규화 된 응답 진폭은 외상 아래의 이상 stimulations 한 옥타브에 exemplarily 표시됩니다. 과와 차이없이 자극에 응답 비교하기 전에 (파란색)과 후 외상 (빨간색)은 가능한 이명 percept의 해석을 할 수 있습니다. 외상 위의 격차의 효과가이 주파수에서 mispercept을 나타내는, 외상 후 사라졌다하면서 외상 주파수 아래 응답 패턴의 변화를 찾을 수 없습니다.

그림 1
1 그림. 행동 기준과 주관적 이명 데이터를 수집하는 데 사용되는 프로그램의 흐름 다이어그램. 이 방법은 프로그램 코드의 단순화 된 버전입니다 있습니다. 약어 : GUI - 그래픽 사용자 인터페이스, ISI - 간 자극 간격.


그림 2. 청각 펄쩍 뛰게하다 응답 (ASR) 자극. 세 가지 자극 프로토콜의 제도 사용됩니다. 왼쪽 패널 :하기 전에 순수한 톤 테스트 자극 (녹색) 펄쩍 뛰게하다 톤 (빨간색)없이 측정 ASR의 사전 펄스가 억제 (PPI), 응답 기간은 파란색으로 그려져 있습니다. 센터 패널 : 간격 / 백색 잡음 배경에 서로 다른 주파수의 순수한 톤 펄쩍 뛰게하다의 자극 프리젠 테이션 소음 패러다임. 오른쪽 패널 : 대역 통과에 클릭 펄쩍 뛰게하다의 자극 프리젠 테이션 갭 / 소음 패러다임이 다른 센터 주파수의 배경을 필터링 한 kHz에서의 자극 주파수에있는 모든 prestimulus없이 임계 패러다임을 기록 15 재판의 B 예시 청각 펄쩍 뛰게하다 응답은.. 동물이 자극을 발병 전에 이미 이동으로 세 재판은 무효 (빨간색 사각형)를 계산합니다.

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그림 3. 늑대가에서 ASR의 예시 결과입니다. 행동 임계 전 (파란색)과 후 (빨간색) 2 kHz로 (노란색 영역)에서 음향 외상. 임계 값은 응답의 임계 값으로 포인트를 돌려 볼츠만 기능을 사용하여 PPI 변조 된 ASR 프로토콜로 계산됩니다. 참고 이상이 66% 2 kHz에서 금액의 청력 손실, 거리에 외상 주파수 하나 인 farer 자주 임계 값을 청각도 개선을 볼 수 있으며, B 정규화 된 응답 진폭 (오픈 원 :. 하나의 시험, 가득 원 : 수단, 수염 : 1시에서 4 kHz에서 센터 주파수의 차이 / 소음 클릭 ASR 프로토콜 (4.5)로 자극시 표준 편차). 응답은 2 kHz에서의 외상 전후 소음의 차이없이 대상으로 시험에 정렬됩니다. 만 4 kHz에서의 차이의 효과는이 문제를 해결 주관적인 이명을 percept을 나타냅니다 외상 후 사라주파수.

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Discussion

우리는 행동 심리 임계 값 (= audiograms 10)와 주관적 이명 11과 같은 청각 환상의 percepts을 결정하는 데 사용할 수있는 음향 펄쩍 뛰게하다 응답 사전 펄스 억제에 따라 동물의 audiometric 측정을위한 저렴하고 만들기는 쉽지 설정을 제시한다. 특히 후자의 측정은 몇 가지 최근의 보고서 8,12,13,14의 초점에이 질환을 근간 neuronal 메커니즘 electrophysiological 조사에 대해 하나의 전제 조건으로 볼 수있다. 이 방법이 가능 동물 음향 외상과 안하시는 분들은 이후 percept 주관적인 이명을 개발 않은 것들 차별화하고 더 차 청각 피질에서 electrophysiological 레코딩과 함께 개인, 예를 조사하고 있습니다을 사용합니다.

음향 외상 후 펄쩍 뛰게하다 데이터의 분석 중요한 단계는 할 수있는 펄쩍 뛰게하다 진폭에 데이터의 정상화이다maximally 테스트 자극을 이전하지 않고 elicited 수 :이 이명 동물에 감소 PPI의 청력 손실에 따라 감소 펄쩍 뛰게하다 반응을 구별 할 특히 중요합니다 : 동물이 부분적으로 여기에서 복구로 음향 외상의 효과는 시간이 지남에 따라 변화하지만 대략 50 청력 손실의 %는 영구적이다. 청각 임계 값 테스트를하지만, 보정을 사용하지 않습니다 위에서 언급 한 보고서는 대조적으로, 우리는 참조 각 응답 진폭을 정규화하여 각 주파수의 다른 청각 임계 값과 음향 외상 자체의 효과의 영향을 최소화하려고했습니다. 또한 우리는 (4.4) 처음에 외상 후 일주에서 더 이상 timescales을 통해 테스트를 동물에게 더 노력하고 있으며 (4.5) 두 번째 "클래식"은에서 테스트 동물보다 나은 작업이있는 이명 percept을 평가하는 프로토콜의 두 가지 다른 종류의 사용 일주 외상 후.

이 방법의 한계는 했음이 분명해입니다rly 그거 하나는 음향 외상의 급성 효과를 평가 할 수 없습니다. 동물이 복구 할 수 있습니다로 마취 및 사후 측정 최초의 사이에 최소한 이틀은 선택해야합니다. 직접 외상 후 급성 청력 손실의 추정치를 구하려면 brainstem의 audiometry은 (BERA) 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgements

이 작품은 에를 랑겐 - 뉘른베르크 (Nuremberg)의 대학의 대학 병원에서 임상 연구에 대한 학제 센터 (IZKF, 프로젝트 E7)에 의해 지원되었다.

References

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