げっ歯類における行動聴力検査のための低コストのセットアップ

Published 10/16/2012
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Neuroscience

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Summary

減損またはファントム認識(自覚的耳鳴り)を聞いて、聴覚しきい値などのパラメータを聞いての行動決定のための高速かつ安価な方法が記載されている。これは、音響驚愕反応のプレパルス抑制を使用し、簡単にプログラムのAD / DAコンバータとピエゾセンサーを使用して、パソコンに実装することができます。

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Tziridis, K., Ahlf, S., Schulze, H. A Low Cost Setup for Behavioral Audiometry in Rodents. J. Vis. Exp. (68), e4433, doi:10.3791/4433 (2012).

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Abstract

聴覚動物の研究では、実験に関与している動物対象の基本的な聴覚パラメータに関する正確な情報を持っていることが非常に重要です。このようなパラメータは、脳幹聴力検査(BERA) などを介して聴覚経路の生理的応答特性であってもよい。しかし、これらの方法は、これらの生理的パラメータに対応する聴覚知覚についての唯一の間接的な、不確実な外挿を可能にします。聴覚の知覚レベルを評価するために、行動の方法が使用されなければならない。動物モデルにおける知覚の説明のための行動方法の使用に関する潜在的な問題は、これらのメソッドのほとんどが学習パラダイムのいくつかの種類の対象者は行動的にテストすることができる前に、 例えば動物がレバーを押すことを学ばなければならないことがあり伴うという事実です音に反応。これらの学習パラダイムの変化の知覚自体1,2として、彼らは、その結果を用いて得られた知覚に関するいかなる結果に影響を与えるであろうこれらの方法は、そのためには、慎重に解釈する必要があります。例外はここでは学習パラダイムが知覚テストに先立って行われなければならないので、反射反応を利用するパラダイムである。そのような反射反応は、非常に再現性ナイーブな動物での予期しない大きな音に誘発することができる音響驚愕反応(ASR)です。今度はこのASRが先行刺激の知覚に応じて音に先行することによって影響を受ける可能性がある:よく閾値を聞いて上記の音が完全にASRの振幅を抑制します。しきい値に近い音少しだけASRを阻害することになります。この現象は、徐々にプレパルスの知覚に依存するASRにプレパルス抑制(PPI)が3,4、およびPPIの量と呼ばれています。 ASRのPPIは従ってよく聴覚障害を決定するために、あるいはこれらに可能自覚的耳鳴りの知覚を検出するために、ナイーブ、非訓練された動物では、行動聴力を決定するのに適している動物。本稿では、げっ歯類モデル(参照もREF。5)でこのメソッドの使用法を示し、あるスナネズミ(Merionesトガリネズミ)、よく通常の人間の聴覚範囲内驚愕反応研究のためのモデル種を知っている( 例えば、 6)。

Protocol

1。セットアップでは、組み立てとソフトウェアプログラミング

  1. パーソナルコンピュータ( :NI PCI 6229、ナショナルインスツルメンツ)でD / Aカードをインストールし、ブレイクアウトボックス( :BNC-2110は、ナショナルインスツルメンツ)に接続し、両方のは、少なくとも1つの入力と1つの出力チャネルをサポートする必要があります少なくとも44.1 kHzの各サンプリングレートを持つ。
  2. サウンドアンプへBNCケーブル(:AMP75広帯域パワーアンプ、トマス·ウルフなど )を介して、ブレイクアウトボックスの出力を接続します。
  3. 暗闇の中で動物のサーベイランスのための:赤外線カメラ(IPカメラグランドプロ、GrandTecエレクトロニクスなどインストールします
  4. 図1に示されたフローチャートによって定義されるようにプログラムを実装するために:統合開発環境(MATLAB などインストールします 。 Matlabの2007B上で実行されているバージョンは、対応する著者から無料で入手することができる。
  5. 防音チャンバー内にテーブルの上にスピーカーをインストールしてください。スピーカートンを接続音アンプをO。
  6. 、絶縁基板の上にピエゾセンサー( 例えば力センサFSG15N1A、ハネウェル社)を取り付け電源とそれをサポートし、ブレイクアウトボックスの入力にBNCケーブルを経由して接続し、接地センサー信号。
  7. (:長さ15センチ、内径4.3センチメートル、外径4.8センチメートルスナネズミ、 例えば用)を測定するために齧歯類のサイズに合わせて調整アクリルガラス管から測定室を構築します。背面にロック機構( 例えば 、フック)でチューブの前面とクッション扉に0.5mmのメッシュ幅で格子修正。固定はドアのみ蝶番とフックの保釈をチューブに固定されて、ホットグルーで行うことができます。
  8. 絶縁センサボード上に測定管寸法に合う発泡プラスチック製の脚を取り付けます。足は前後端の下にチューブをサポートしており、センサーレベルにチューブを持ち上げる必要があります。ピエゾセンサーと測定室との間の光接触があることを確認してください。 スピーカの前面の中央に測定室を備えたセンサボードを固定し、その横にサウンドコントロールにマイクを置く( 例えば、B&Kタイプ2669 / B&Kタイプ4190アンプB&Kタイプ2610、全ての測定に接続:ブリュエルとケアーを)レベルで動物の頭のように、それがチューブに干渉されていません。
  9. あなたの聴力データの品質があなたのサウンドシステムの品質に依存することに注意してください。いずれにせよ、最初の実験の前にお使いのシステムの周波数伝達関数を決定し、スピーカーのフラットのスペクトル出力を作るために、この周波数伝達関数を補正するためには、ソフトウェアに含まれているルーチンを含めるようにマイクと計測アンプを使用します。
  10. 一つは動物の行動を監視できるようにセットアップとウェブカメラの位置を合わせます。

2。聴覚しきい値の行動決定(オージオグラム)

  1. そのホームケージから動物を取り、チューブ内の最初の頭に置くと、cドアを失う。
  2. 発泡足、センサ上にチューブを入れてください。任意の光を切り、室への扉を閉める。チャンバー自体にはエアコンはありませんが、温度、湿度、周囲の研究室の他の環境変数を持っています。人工呼吸器による空気の変化が原因で誘発されるノイズにはお勧めできませんが、室の容積が多くの時間のための動物のための酸素を支援しています。動物がセットアップに慣れるようにする15分待ってください。それは自分のペースで落ち着くことができ、チューブに慣れるように順応時間は動物のために有益です。一方、1は、いくつかのセッションを介して順応時に動作の違いを見ていない、これは、実験前にチューブとチャンバーを動物に慣れるための余分なセッションが必要とされていないことを示しています。
  3. プログラムを起動し、(参照もREF 5)刺激のためのパラメータを定義します刺激は異なる周波数の純粋なトーンで構成されquencies。驚愕刺激は再現性驚愕反応を誘発するのに十分な高い音圧レベルで提示されなければならない。私たちの研究室では、モンゴルスナネズミに驚愕反応を誘発するために音圧レベル105 dB(刺激持続時間6秒2ミリコサイン二乗立ち上がりと立ち下がりの傾斜路を含む)の強度を使用しています。驚愕刺激に先行テスト刺激は、通常、下記のよくしきい値を上回ると種の全可聴範囲をカバーする周波数を持つレベルにしきい値を聞いてから、テストする範囲の周波数と強度を変化させることで発表されています。驚愕と試験刺激の頻度と持続時間は各試験で照合され、驚愕とテスト刺激間の刺激間間隔は100ミリ秒に設定されています。テスト刺激の各周波数と強度の組み合わせは10の無作為刺激間間隔で少なくとも15回の繰り返し±2.5秒を使用します(参照図2A、左)。その後のテスト刺激はどちら無作為に提示または非走ったことができますdomizedオーダー。あなたは非ランダム化アプローチ( 例えば 、すべてのテストされた周波数は固定1テスト信号のレベル)を使用している場合は別の刺激セット間の回復の5分を許可します。しきい値の決定された絶対的な閾値は、刺激のランダム化に依存することに注意しますが、可能な相対シフト(音響外傷後など、cf。REF。5)ではないでしょう。
  4. データを分析する前に、データセット(; CF 図2B 例えば 、動物が驚愕刺激の前に移動試験)から無効裁判を削除します。
  5. 驚愕刺激後の最初の50ミリ秒のタイムウィンドウ内に、それぞれの単一試行の応答振幅(応答の最初の最小の最初の最大値の間でピーク値)と応答潜時(刺激開始から応答発症までの時間)を計算する。
  6. すべての有効なSINGLためprestimulus強度でソート1つの周波数の設定を完全応答振幅データにボルツマン関数で近似eの試験。ボルツマン関数7の50%ポイントは、この刺激周波数の聴力しきい値を示します。

3。聴覚障害の音響外傷と定量

  1. 4 mg / kgを(Rompun 2%、バイエル)、硫酸アトロピン:1 mg / kgの(Atropinsulfat;キシラジン塩酸塩96 mg / kgの(ケタミン-ratiopharm、Ratiopharm):塩酸ケタミンの混合物でケタミン - キシラジン麻酔準備9:1​​:2:8の比率でB. BraunはメルズンゲンAG)および生理NaCl溶液(ベルリンChemie AG社、ベルリン)。
  2. 麻酔皮下の3ミリリットル/キログラムで動物を注入します。動物が深く麻酔になるまで待ちます(約5分、反射神経をチェックして、 例えば 、ペダル撤退反射を使用します)。測定中に麻酔を維持するために、継続的に、シリンジポンプを用いて3ミリリットル/ kg / hrの速度で麻酔液を注入。適切な機器とバイタルサイン( 例えば 、カメラを介して呼吸)を制御しplaciによって動物暖かくNGそれ温暖化パッド上。
  3. 75分間115デシベルSPLで例えば 2 kHzの:大声で純音を用いた音響外傷などを誘発する
  4. 外傷の終了後、シリンジポンプを停止し、静かな場所での温暖化パッドオンウェイクアップ·ケージに覚醒動物を聞かせて。バイタルサインが安定している場合は覚醒段階の間に定期的にチェックしてください。それが完全に覚醒しているときにのみ、そのホームケージに動物を入れてください。動物が麻酔(少なくとも2日間)とそのホームケージ内の残りの部分から回復しましょう​​。
  5. 再び2.6から2.1を実行してください。周波数ごとの聴力損失の割合を計算することにより、音響外傷前後聴力しきい値を比較してください。すべての実験が終了した後に痛みを伴わずに動物を安楽死させる。

4。アコースティックファントム知覚のテスト(自覚的耳鳴り)

  1. 音響外傷の前後にこれらの測定を実行します。
  2. 動物がセットアップになっていない場合は2.2から2.1に従ってください。
  3. N刺激パラダイムのアンバーは、自覚的耳鳴りのためのげっ歯類をテストするために使用することができます。すべてのこれらのアプローチの比率は、バックグラウンドノイズの中サイレントギャップの顕現性をテストすることである。ギャップが動物によって知覚されている場合は、同様に2に記載した手順に驚愕反応を低減するためにテスト刺激として使用することができます。動物が耳鳴り(音響外傷後に発症する可能性がある)に苦しんでいる場合は、この耳鳴りはサイレントギャップ内で認識され、それゆえのギャップが少なく顕著になることでしょう。驚愕反応のギャップの効果は、結果的に健康なコントロール(PPI、CF 8に減少)に比べて耳鳴り動物に弱くなります。この知覚は、2つのわずかに異なるプロトコルを使用してテストされています。
  4. ここに提示された最初の自覚的耳鳴りのパラダイム( 図2A、センター、CF 9)の刺激のための次のパラメータを使用します。驚愕音の強音圧レベル105 dB 1オクターブ単位で1〜16 kHzまでの周波数で、stimul私達2ミリコサイン二乗立ち上がりと立ち下がりの傾斜路を含む長さ6ミリ。 100ミリ秒で驚愕刺激に先行する15ミリの隙間の有無にかかわらずどちらか、実験中50デシベルSPLのホワイトノイズの背景を提示し、各周波数、ギャップ条件のために存在し、少なくとも15の試験を。非無作為化されたアプローチを使用している場合は、異なる刺激セット間5分の回復を可能にする。異なる驚愕刺激周波数の使用は、知覚耳鳴り周波数の概算を与える。
  5. 第二自覚的耳鳴りのパラダイム( 図2A、右側)としては、次の刺激パラメータを使用することがあります:驚愕音の強さ音圧レベル105 dB、ダブルクリックあたり0.1ミリ秒の持続時間とクリックの間に0.1ミリ秒、反転方向を有する第二のクリックで刺激をクリック最初に比較した。 1オクターブ単位で16 kHzに至るまで0.5オクターブと中心周波数のガウスフィルタ幅で50 dBのSPLのバンドパスフィルタされるノイズバックグラウンドを提示する。このノイズEIを提示100ミリ秒で驚愕刺激に先行する15ミリの隙間の有無にかかわらず熱、各周波数、ギャップ条件のために存在し、少なくとも15試験。非無作為化されたアプローチを使用している場合は、異なる刺激セット間5分の回復を可能にする。バンドのバックグラウンドノイズの異なる中心周波数の使用は、知覚された耳鳴りの周波数の概算を与える。
  6. 2.5から2.4に従ってください。各テスト周波数に設定された参照データとそれぞれの外傷の状態、 すなわち 、音響外傷前後ですべて取得したデータを正規化します。このリファレンスでは、任意のprestimulus(参照2.3)なしの純音性驚愕刺激に対する応答の振幅である。周波数は、バンドパスフィルタされるノイズの純音または中心周波数のいずれかによって決定されます。各基準の平均応答を計算し、その参照を介してそれを割って算出した各応答振幅を正規化します。
  7. ギャップconditioの正規化された応答の振幅を割ってPPIを計算するn各テスト周波数の正規化された無ギャップ条件の平均スルー。
  8. 各試験周波数にパーセントで、外傷後のPPI変化を計算する。

動物の驚愕反応は、生成するために、分析するのは簡単です。 図2Bは、15回の任意prestimulusなし105デシベルSPLの純音で刺激された一匹の典型的な結果の概要を示しています。臨床試験の大半は、有効および無効な試験です(赤い四角でマーク試験)を認識するのは簡単です。応答振幅と潜時のみ有効な試験から算出しております。

典型的な行動閾値の変化は、図3Aに示されている。 2で説明した方法で取得した例示的な動物のオージオグラムは2kHz(黄色エリア)音響外傷前(青)と(赤)の後に与えられます。明確な難聴は2kHzで具体的に示されている。自覚的耳鳴り知覚に関わる対応はでき4.5で説明されるように、図3Bに示すように、上記と同じ動物の正規化された応答の振幅は刺激1オクターブ下と外傷上記のために例示的に示されています。前のギャップがある場合とない場合の刺激に対する応答の比較(青)とは、外傷後(赤)の可能性の耳鳴りの知覚の解釈を可能にする。ギャップの効果は、この周波数でmisperceptを示す、外傷後に消えた外傷上記ながら外傷周波数以下の応答パターンの変化は見られない。

図1
図1。行動しきい値と自覚的耳鳴りデータを取得するために使用するプログラム流れ図。これが唯一のプログラムコードを簡略化したものであることに注意してください。略語:GUI - グラフィカルユーザインターフェース; ISI - インター刺激間隔。


図2。聴覚驚愕反応(ASR)の刺激。使われている3つの異なる刺激プロトコルのスキーム。左のパネル:前に、純音のテスト刺激せずに測定されたASRのプレパルス抑制(PPI)(緑)驚愕トーン(赤)は、応答期間は、青色で描かれている。センターパネル:ホワイトノイズの背景の異なる周波数の純音性驚愕刺激提示とのギャップ/ノイズパラダイム。右のパネル:異なる中心周波数のバンドパスフィルタ処理背景をクリック驚愕刺激提示とのギャップ/ノイズパラダイム1kHzの刺激周波数で任意prestimulusなししきいパラダイムで記録15試験のBの代表的な聴覚性驚愕反応。。 3件の試験は無効カウントされ(赤い四角)動物は、刺激開始前に既に動いた。

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図3。 1動物のASRの典型的な結果。行動しきい前(青)と後(赤)の2 kHzの(黄色エリア)音響外傷。しきい値は、応答からのしきい値としてボルツマン関数ターニングポイントを使用して変調されたPPIは、ASRのプロトコルに計算されます。注意して66%以上〜2 kHzの量で難聴、離れてトラウマ周波数1からfarerはしばしばしきい値を聞くのさえ改善を見ることができますが、Bの正規化の応答振幅(白丸:単一試験、黒丸:手段、ひげ: 1と4 kHzの中心周波数のASRプロトコル(4.5)クリックギャップ/ノイズによる刺激時の標準偏差)。回答は2 kHzで外傷前後ノイズで隙間なくとと試験のためにソートされます。わずか4 kHzでのギャップの効果は、この問題を回避自覚的耳鳴りの知覚を示し外傷後消える周波数。

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Discussion

我々は、行動の聴力閾値(=聴力図10)、自覚的耳鳴り11のような聴覚ファントム知覚を決定するために用いることができる音響驚愕反応のプレパルス抑制に基づく、げっ歯類における聴力測定のための、安価で簡単に構築でき、セットアップを提示します。特に後者の測定は、いくつかの最近の報告8,12,13,14の焦点であり、この病気の根底にある神経メカニズムの電気生理学的調査のための1前提として見ることができます。それが可能な動物は音響外傷としなかったものの後に自覚的耳鳴りの知覚を開発したその差別化し、さらに、一次聴覚野における電気生理学的記録で、 例えば 、これらの個人を調査する。たときに、このメソッドを使用して

音響外傷後の驚愕のデータ分析における重要なステップができ驚愕振幅へのデータの正規化され最大限にテスト刺激に先行することなく、誘発される:これは耳鳴り動物で減少PPIから難聴に基づいて減少驚愕反応を区別することが特に重要である:音響外傷の影響は動物が部分的にそこから回復すると、時間の経過とともに変化しますが、およそ50アール難聴の%は永続的です。聴覚しきい値はテストされたが、キャリブレーションに使用されていない上記のレポートとは対照的に、我々は参照してそれぞれの応答振幅を正規化することにより、各周波数の異なる聴覚しきい値および音響外傷自体の効果の影響を最小限にしようとしました。さらに、我々は最初の(4.4)内で試験動物のためのより良い職場で、外傷後1週間から長い時間スケールで試験動物と第二の "古典的な"(4.5)のためのより良い作業で、どんな耳鳴り知覚を評価するためのプロトコルには次の2つの異なる種類を使用外傷後の一週間。

この方法の限界は、クレアですRLY 1は音響外傷の急性影響を評価することはできません。動物はそれから回復するために持っているので麻酔後の最初の測定の間に少なくとも二日間は、選択されるべきである。直接外傷後の急性難聴の推定値を得るために、脳幹聴力検査(BERA)を使用することができる。

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Disclosures

特別な利害関係は宣言されません。

Acknowledgements

この作品は、エアランゲン·ニュルンベルク大学の大学病院で臨床研究に関する学際センター(IZKF、プロジェクトE7)によってサポートされていました。

References

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