Ein Low-Cost-Setup für Verhaltensaudiometrie in Nagetiere

Published 10/16/2012
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Neuroscience

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Summary

Eine schnelle und kostengünstige Methode zur Verhaltens Bestimmung hören Parameter wie Hörschwellen, Hörschäden oder Phantom Wahrnehmungen (subjektiven Tinnitus) beschrieben. Es verwendet Präpulsinhibierung des akustischen Schreckreaktion und kann leicht in einem Personal Computer unter Verwendung eines programmierbaren AD / DA-Wandler und einen Piezo-Sensor implementiert werden.

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Tziridis, K., Ahlf, S., Schulze, H. A Low Cost Setup for Behavioral Audiometry in Rodents. J. Vis. Exp. (68), e4433, doi:10.3791/4433 (2012).

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Abstract

In auditiven Tierversuchen ist es wichtig, genaue Informationen über grundlegende Anhörung Parameter der Tier-Themen, die in den Experimenten beteiligt sind, haben. Solche Parameter können physiologische Ansprechverhalten des Hörbahn über Hirnstammaudiometrie (BERA) zB sein. Aber diese Methoden erlauben nur indirekt und unsicher Hochrechnungen über die auditive Wahrnehmung, die zu diesen physiologischen Parametern entspricht. Um die wahrnehmbare Ebene des Hörens zu bewerten, müssen Verhaltensmethoden verwendet werden. Ein mögliches Problem mit der Verwendung von verhaltenstherapeutischen Methoden für die Beschreibung der Wahrnehmung in Tiermodellen ist die Tatsache, dass die meisten dieser Methoden eine Art von Lernparadigma bevor die Themen im Verhalten getestet werden können beinhalten, können zB Tiere müssen lernen, einen Hebel nach innen drücken Reaktion auf einen Klang. Da diese Lernparadigmen Änderung Wahrnehmung selbst 1,2 sie folglich beeinflussen jedes Ergebnis über die Wahrnehmung erhalten mitdiese Methoden und müssen daher mit Vorsicht interpretiert werden. Ausnahmen sind Paradigmen, die Verwendung von Reflexe zu machen, weil hier keine Lernparadigmen um sich vor der Wahrnehmungs-Tests durchgeführt haben. Ein solcher Reflex ist die akustische Schreckreaktion (ASR), die hoch reproduzierbar mit unerwarteten laute Geräusche in naiven Tieren ausgelöst werden kann. Diese ASR kann wiederum durch vorangehenden Klänge in Abhängigkeit von der Wahrnehmbarkeit dieser vorhergehenden Stimulus beeinflusst werden: Sounds deutlich über Hörschwelle vollständig hemmen die Amplitude des ASR; klingt nahe Schwellenwert nur geringfügig hemmen die ASR. Dieses Phänomen wird als Präpulsinhibierung (PPI) 3,4, und die Menge des auf dem PPI ASR allmählich abhängig von der Erkennbarkeit des Vorimpulses. PPI der ASR ist daher gut geeignet, um Verhaltensänderungen Audiogramme in naiv, nicht trainierten Tieren zu bestimmen, Hörschäden zu bestimmen oder gar zu möglichen subjektiven Tinnitus Wahrnehmungen in diesen erkennenTiere. In diesem Papier zeigen wir die Verwendung dieser Methode in einem Nagetier-Modell (vgl. auch Lit.. 5), der Mongolischen Wüstenrennmaus (Meriones unguiculatus), die ist eine bekannte Modell Arten Schreckreaktion Forschung innerhalb der normalen menschlichen Hörbereich (zB 6).

Protocol

Ein. Setup Montage und Software Programmierung

  1. Installieren Sie einen D / A-Karte in einem Personal Computer (zB: NI PCI 6229, National Instruments) und verbinden Sie es mit einer Breakout-Box (zB: BNC-2110 von National Instruments), sollten beide unterstützt mindestens einen Eingang und einen Ausgang Kanal mit einer Abtastrate von mindestens 44,1 kHz jeden.
  2. Verbinden Sie den Ausgang des Breakout-Box via BNC-Kabel mit einem Sound-Verstärker (zB: AMP75 Breitband-Leistungsverstärker, Thomas Wulf).
  3. Installieren Sie eine Infrarot-Webcam (zB: Grand IP Camera Pro, Grandtec Electronics) für Tier-Überwachung in der Dunkelheit.
  4. Installieren Sie ein Integrated Development Environment (zB: Matlab) um ein Programm als durch das Flussdiagramm in Abbildung 1 dargestellt definiert umzusetzen. Eine Version, die auf Matlab 2007b kann kostenlos bezogen aus dem entsprechenden Autor werden.
  5. Innerhalb einer schalldichten Kammer installiert einen Lautsprecher auf einem Tisch. Schließen Sie den Lautsprecher to die Sound-Verstärker.
  6. Installieren Sie einen Piezo-Sensor (zB Kraftsensor FSG15N1A, Honeywell) auf einer Dämmplatte, unterstützen sie mit Macht und verbinden Sie es über BNC-Kabel mit dem Eingang des Breakout-Box; Boden das Sensorsignal.
  7. Baue eine Meßkammer aus einem Acrylglas-Rohr angepasst an die Größe des Nagers zu messen (z. B. für Rennmäuse: Länge 15 cm, Innendurchmesser 4,3 cm, Aussendurchmesser 4,8 cm). Fix eine mit einer Maschenweite von 0,5 mm an der Vorderseite des Rohres und einem gepolsterten Tür mit einem Schloß-Mechanismus (zB einem Haken) an der hinteren Gitterrost. Die Fixierung kann mit Heißkleber gemacht werden, für die Tür nur das Scharnier und der Bügel für den Haken an dem Rohr befestigt ist.
  8. Bringen Schaumstoff Füße, die Messrohr Abmessungen passen auf die isolierende Sensor Board. Die Füße sollten das Rohr unter dem vorderen und hinteren Ende unterstützt und heben das Rohr auf die Sensor-Ebene. Stellen Sie sicher, dass es leichter Kontakt zwischen dem Piezo-Sensor und der Messkammer. Befestigen Sie den Sensor-Board mit der Messkammer vor dem Lautsprecher zentriert und legte ein Mikrofon für Sound Control daneben (zB B & K Typ 2669 / B & K Typ 4190 mit Messverstärker B & K Typ 2610, Alle: Bruel und Kjaer) auf der Ebene der Tiere Kopf, so dass es nicht zu stören Rohres.
  9. Beachten Sie, dass die Qualität der audiometrischen Daten hängt von der Qualität des Sound Systems abhängen. In jedem Fall, das Mikrofon und Messverstärker um die Frequenz Transfer Funktion Ihres Systems vor zu bestimmen, Ihre ersten Experimente und verfügen über eine Routine in Ihre Software für diese Frequenz Übertragungsfunktion zu korrigieren, um die spektrale Leistung des Lautsprechers flach zu machen.
  10. Richten Sie die Webcam mit dem Setup, so dass ein Verhalten der Tiere zu überwachen.

2. Behavioral Bestimmung der Hörschwelle (Audiogramme)

  1. Nehmen Sie das Tier von seinem eigenen Käfig und legte sie mit dem Kopf zuerst in das Rohr; cverlieren die Tür.
  2. Legen Sie den Schlauch auf den Schaum Füßen und dem Sensor. Schalten Sie kein Licht, und schließen Sie die Tür zu der Kammer. Die Kammer selbst ist nicht klimatisierten hat aber die Temperatur, Feuchtigkeit und anderer Umgebungsvariablen des umgebenden Labor. Luftwechsel durch Ventilatoren ist nicht ratsam aufgrund des induzierten Rauschens aber das Volumen der Kammer unterstützt Sauerstoff für das Tier für viele Stunden. Warten Sie 15 min, damit das Tier in das Setup zu gewöhnen. Die Eingewöhnungszeit ist vorteilhaft für das Tier, wie es beruhigen kann sich in seinem eigenen Tempo und auf das Rohr zu gewöhnen. Auf der anderen Seite, sieht man nicht alle Unterschiede im Verhalten während der Eingewöhnungszeit über mehrere Sitzung, die anzeigt, dass eine zusätzliche Sitzung für vertraut das Tier mit dem Rohr und der Kammer vor dem Experiment nicht benötigt wird.
  3. Starten Sie das Programm und die Parameter für die Stimulation (vgl. auch Lit. 5).: Stimuli bestehen aus reinen Tönen mit unterschiedlichen FrequenzenFrequenzen. Die Schreckreaktion Stimulus muss mit einem Schalldruckpegel hoch genug, um reproduzierbar entlocken eine Schreckreaktion vorgestellt. In unserem Labor verwenden wir Intensitäten von 105 dB SPL (Reizdauer 6 ms, darunter 2 ms Cosinus-squared Aufstieg und Fall Rampen) zu erschrecken Antworten in Mongolische Rennmäuse zu entlocken. Die Teststimuli vor den Schreckreaktion Stimuli werden in unterschiedlichen Frequenzen und Intensitäten im Bereich zu testenden, in der Regel von unten Hörschwelle auf Werte deutlich oberhalb der Schwelle und mit Frequenzen über den gesamten hörbaren Bereich der Spezies präsentiert werden. Häufigkeit und Dauer der Schreckreaktion und Testreiz in jedem Versuch abgestimmt sind, wird die Interstimulus Intervall zwischen Schreckreaktion und Teststimulus auf 100 ms eingestellt. Verwenden Sie mindestens 15 Wiederholungen mit randomisierten Interstimulus Abständen von 10 ± 2,5 sec für jede Frequenz und Intensität Kombination der Teststimuli (vgl. Abbildung 2A, links). Nachfolgende Teststimuli können vorgestellt werden entweder zufällig oder nicht-ranrandomisierten Reihenfolge. Wenn Sie eine nicht-randomisierte Ansatzes werden (zB ein Test-Ebene für alle getesteten Frequenzen fest) ermöglichen 5 min der Erholung zwischen den verschiedenen Stimulus-Sets. Man beachte, dass die ermittelte absolute Schwelle wird auf der Randomisierung der Stimuli abhängt, sondern möglichen relativen Verschiebungen der Schwelle nicht (z. B. nach Lärmtrauma, cf. Ref. 5).
  4. Vor der Analyse der Daten, entfernen ungültige Versuche von Datensatz (zB Studien, in denen das Tier vor der Schreckreaktion Stimulus bewegt;. Vgl. Abbildung 2B).
  5. Innerhalb eines Zeitfensters des ersten 50 ms nach dem Schreckreaktion Stimulus, berechnen die Reaktion Amplitude (Spitze zwischen dem ersten Maximum zum Minimum der ersten Reaktion Peak) und Latenz (Zeit vom Beginn bis zum Ansprechen Stimulus Onset) jedes einzelnen Versuch .
  6. Setzen Sie eine Boltzmann-Funktion auf die vollständige Antwort Amplitudendaten einer Frequenz eingestellt für prestimulus Intensität für alle gültigen singl sortierte Studien. Die 50%-Punkt der Boltzmann-Funktion 7 zeigt die Hörschwelle für diese Stimulationsfrequenz.

3. Acoustic Trauma und Quantifizierung von Hörbehinderungen

  1. Planen Ketamin-Xylazin-Narkose mit einem Gemisch aus Ketamin Hydrochlorid: 96 mg / kg (Ketamin-ratiopharm Ratiopharm); Xylazinhydrochlorid: 4 mg / kg (2% Rompun, Bayer); Atropinsulfat: 1 mg / kg (Atropinsulfat, B. Braun Melsungen AG) und physiologische NaCl-Lösung (Berlin-Chemie AG, Berlin) mit einem Verhältnis von 9:1:2:8.
  2. Spritzen Sie das Tier mit 3 ml / kg der Anästhesie subkutan. Warten Sie, bis das Tier tief narkotisiert (ca. 5 min, überprüfen Reflexe, z. B. mit dem Pedal withdrawal reflex). Um Anästhesie während Messungen beizubehalten, kontinuierlich injizieren die Anästhetikum-Lösung bei einer Rate von 3 ml / kg / h über eine Spritzenpumpe. Kontrolle der Vitalfunktionen mit entsprechender Ausrüstung (zB Atmen via Kamera) und halten Sie das Tier warm Placing auf einer Erwärmung pad.
  3. Induzieren eine akustische Trauma, z. B. mit einem lauten reinen Ton: zB 2 kHz bei 115dB SPL für 75 min.
  4. Nach dem Ende des Traumas zu stoppen die Spritzenpumpe und ließ das Tier wach in einem Wake-up-Käfig auf einer Erwärmung pad an einem ruhigen Ort. Prüfen Sie regelmäßig, während der Aufwachphase, wenn die Vitalfunktionen stabil sind. Legen Sie das Tier in seinem eigenen Käfig nur, wenn es vollständig wach ist. Lassen Sie das Tier aus der Narkose (mindestens 2 Tage) und Ruhe in seinem eigenen Käfig zu erholen.
  5. Führen 2,1 bis 2,6 wieder. Vergleichen Sie die Hörschwellen vor und nach dem akustischen Trauma durch Berechnung des Prozentsatzes von Hörverlust für jede Frequenz. Nach Beendigung aller Experimente schmerzlos euthanize das Tier.

4. Test für Acoustic Phantom Perception (subjektiven Tinnitus)

  1. Führen diese Messungen vor und nach dem akustischen Trauma.
  2. Folgen Sie 2,1 bis 2,2, wenn das Tier nicht bereits im Setup.
  3. A number der Stimulation Paradigmen können verwendet werden, um Nagetiere subjektiven Tinnitus getestet werden. Das Verhältnis in all diesen Ansätzen ist für die Salienz einer stillen Lücke in einem Hintergrundrauschen zu testen. Wenn der Spalt von den Tieren wahrgenommen wird, kann es als ein Teststimulus benutzt werden, einer Schreckreaktion man analog der in 2 beschrieben zu reduzieren. Wenn das Tier leidet an Tinnitus (dh wahrscheinlich nach akustischem Trauma entwickeln), wird diese Tinnitus im stillen Lücke wahrgenommen werden und macht somit die Lücke weniger hervorstechenden. Die Wirkung der Spalt an der Schreckreaktion folglich werden schwächer in Tinnitus Tieren im Vergleich zu gesunden Probanden (verringert PPI, cf. 8). Diese Wahrnehmung wird mit zwei leicht unterschiedliche Protokolle getestet.
  4. In der ersten subjektiven Tinnitus Paradigma präsentierte hier (. 2A, Mitte, vgl. 9) die folgenden Parameter für die Stimulation: Schreckreaktion Schallintensität 105 dB SPL mit Frequenzen von 1 bis 16 kHz in 1 Oktave Schritten stimuluns Länge 6 ms, darunter 2 ms Cosinus-squared Aufstieg und Fall Rampen. Präsentieren ein weißes Rauschen Hintergrund von 50 dB SPL während des Experiments, entweder mit oder ohne 15 ms, die die Lücke vorangeht Schreckreaktion Stimulus von 100 ms; vorliegenden mindestens 15 Versuche für jede Frequenz und Spalt-Zustand. Bei Verwendung einer nicht-randomisierten Ansatz erlauben 5 min Erholung zwischen den verschiedenen Stimulus-Sets. Verwenden verschiedener Schreckreaktion Stimulusfrequenzen geben eine grobe Schätzung der wahrgenommene Tinnitus-Frequenz.
  5. In einem zweiten subjektiven Tinnitus Paradigma (2A, rechts) können Sie die folgenden Stimulationsparameter: Schreckreaktion Schallintensität 105 dB SPL, doppelklicken Sie Stimulus mit 0,1 ms Dauer pro Klick und 0,1 ms zwischen den Klicks, der zweite Klick mit dem umgekehrter Richtung im Vergleich zum ersten. Präsentieren Sie einen Bandpass gefiltert Geräuschkulisse von 50 dB SPL mit einem Gauß-Filter Breite von 0,5 Oktaven und Mittenfrequenzen von 1 bis 16 kHz in Oktav-Schritten. Präsentieren dieses Geräusch either mit oder ohne 15 ms, die den Spalt Schreckreaktion Stimulus von 100 ms vorausgeht; vorliegenden mindestens 15 Versuche für jede Frequenz und Spalt-Zustand. Bei Verwendung einer nicht-randomisierten Ansatz erlauben 5 min Erholung zwischen den verschiedenen Stimulus-Sets. Verwendung von unterschiedlichen Mittenfrequenzen des Bandpass Hintergrundgeräusche geben eine grobe Schätzung der wahrgenommene Tinnitus-Frequenz.
  6. Befolgen von 2,4 bis 2,5; normalisieren alle erfassten Daten mit Referenzdaten für jeden getesteten Frequenz eingestellt und jedem Trauma Zustand, dh vor und nach einer akustischen Trauma.. Diese Referenz ist die Antwort Amplitude auf den reinen Ton Schreckreaktion Stimulus ohne prestimulus (vgl. 2,3). Die Frequenz wird entweder durch den Purton oder die Mittenfrequenz des Bandpass-gefilterten Rauschens bestimmt. Berechnen Sie die mittlere Antwortzeit für jede Referenzperiode und normalisieren jede berechnete Antwort Amplitude, indem sie durch ihre Referenz.
  7. Berechnen PPI durch Dividieren der normierten Schwingungsamplituden des Spalts condition durch den Mittelwert der normalisierten no-Spalt Zustand jedes getesteten Frequenz.
  8. Berechnen Sie die PPI Änderung nach dem Trauma in Prozent für jede getestete Frequenz.

Die Schreckreaktion Reaktionen der Tiere sind leicht zu erzeugen und zu analysieren. 2B gibt einen Überblick über ein typisches Ergebnis von einem Tier mit einem reinen Ton von 105 dB SPL ohne prestimulus für 15-fache stimuliert wird. Die Mehrheit der Studien sind gültige und ungültige Versuche sind leicht zu erkennen (Studien von roten Quadrat markiert). Die Antwort Amplituden und Latenzen sind nur von gültigen Studien berechnet.

Ein typisches Verhalten Grenzwertveränderung ist in 3A angegeben. Das Audiogramm eines beispielhaften Tieres mit dem in 2 beschriebenen erworben wird, bevor (blau) und nach (rot) ein akustisches Trauma bei 2 kHz (gelber Bereich) gegeben. Eine klare Hörverlust ist speziell auf 2 kHz dargestellt. Die Antworten im Zusammenhang mit einer subjektiven Tinnitus Wahrnehmung sein kanngesehen in 3B werden die normierten Amplituden Reaktion desselben Tieres wie vorstehend beispielhaft für Stimulationen eine Oktave unterhalb und oberhalb des Traumas gezeigt, wie in 4.5 beschrieben. Der Vergleich der Reaktionen auf Reize mit und ohne Lücke vor (blau) und nach dem Trauma (rot) ermöglicht eine Interpretation eines möglichen Tinnitus Wahrnehmung. Unterhalb des Traumas Frequenz keine Änderung der Antwort-Muster findet während oberhalb des Traumas der Effekt der Spalt verschwunden nach dem Trauma, was auf eine mispercept bei dieser Frequenz ist.

Abbildung 1
Abbildung 1. Flussdiagramm des Programms verwendet werden, um die Verhaltensmuster Schwellen und subjektiven Tinnitus Daten zu erfassen. Beachten Sie, dass dies nur eine vereinfachte Version des Programmcodes. Abkürzungen: GUI - Graphical User Interface; ISI - inter Stimulus-Intervall.


Abbildung 2. Auditory Schreckreaktion (ASR) Reize. A Schemata der drei verschiedenen Stimulationsprotokolle verwendet. Linkes Feld: Präpulsinhibierung (PPI) des ASR ohne Reintontest Stimulus vor (grün) die Schreckreaktion Ton (rot) gemessen; die Antwort Zeitraum ist in blau dargestellt. Center-Leiste: gap / Rausch-Paradigma mit reinen Tönen Schreckreaktion Stimuluspräsentation verschiedener Frequenzen auf einem weißen Rauschen Hintergrund. Rechts: Lücke / Rausch-Paradigma mit Klick Schreckreaktion Stimulus Präsentation auf bandpassgefiltert Hintergrund unterschiedlicher Mittenfrequenzen B Beispielhafte auditiven Schreckreaktion Antworten von 15 Studien mit der Schwelle Paradigma ohne prestimulus bei 1 kHz Anregungsfrequenz erfasst.. Drei Studien sind ungültig (rote Quadrate) gezählt, wie das Tier bewegt schon vor der Stimulation Beginn.

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Abbildung 3. Beispielhafte Ergebnisse der ASR in ein Tier. A Behavioral Schwelle vor (blau) und nach (rot) das akustische Trauma bei 2 kHz (gelber Bereich). Die Schwellen werden von den Antworten auf die PPI moduliert ASR-Protokoll mit der Boltzmann-Funktion Wendepunkt als Schwellenwert berechnet. Beachten Sie, dass der Hörverlust bei 2 kHz beträgt mehr als 66%, während weiter weg von dem Trauma Frequenz ein oft sogar Verbesserung der Hörschwelle sehen können B Normalized Schwingungsamplituden (offene Kreise:. Einzelnen Studien, gefüllte Kreise: ein Mittel, Whisker: Standardabweichung) während der Stimulation mit der Lücke / Rausch-Klick ASR-Protokoll (4,5) für 1 und 4 kHz Mittenfrequenzen. Reaktionen sind für Versuche ohne und mit Zwischenraum im Rauschen vor und nach dem Trauma bei 2 kHz sortiert. Nur bei 4 kHz die Wirkung der Spalt verschwindet nach dem Trauma, das eine subjektive Wahrnehmung Tinnitus um dieses anzeigtFrequenz.

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Discussion

Wir präsentieren eine billige und leicht zu bauen Setup für audiometrische Messungen bei Nagetieren auf Präpulsinhibierung der akustischen Schreckreaktion Reaktionen, die verwendet werden, um Hörschwellen (= Audiogramme 10) und auditive Phantom Wahrnehmungen wie subjektiven Tinnitus 11 bestimmt werden kann basieren. Besonders die letzteren Messungen stehen im Mittelpunkt von mehreren jüngsten Berichten 8,12,13,14 und kann als eine Voraussetzung für elektrophysiologische Untersuchungen der neuronalen Mechanismen dieser Krankheit gesehen werden. Mit dieser Methode ist es möglich zu unterscheiden, welche Tiere haben eine subjektive Tinnitus nach Knalltrauma und diejenigen, die nicht percept entwickeln, und dann weiter zu untersuchen diese Personen, zB mit elektrophysiologischen Ableitungen in primären auditorischen Kortex.

Ein entscheidender Schritt in der Analyse der Schreckreaktion Daten nach akustischem Trauma ist die Normalisierung der Daten an den Schockamplitude Das kannmaximal ohne vorherige Teststimulus ausgelöst werden: Dies ist besonders wichtig zu reduzieren Schreckreaktion Antworten auf Hörverlust von reduzierten PPI bei Tinnitus Tieren basieren unterscheiden: Die Auswirkungen der akustischen Trauma im Laufe der Zeit verändert, wie das Tier teilweise erholt sich von ihm, aber rund 50 % der Hörverlust ist permanent. Im Gegensatz zu Berichten erwähnt, wo die Hörschwellen getestet, aber nicht für die Kalibrierung verwendet, versuchten wir, die Wirkungen der verschiedenen Hörschwellen jeder Frequenz und die Wirkung der akustischen Trauma selbst durch Normalisieren jede Antwort Amplitude mit einem Bezugswert zu minimieren. Zusätzlich verwenden wir zwei verschiedene Arten von Protokollen, jede Tinnitus Wahrnehmung zu beurteilen, wobei die erste (4,4) arbeiten besser für Tiere über längere Zeiträume erprobt von einer Woche nach dem Trauma und der zweite "klassische" (4,5) arbeiten besser für Tierversuche im Eine Woche nach dem Trauma.

Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist clearly, dass man nicht beurteilen, die akuten Wirkungen eines akustischen Traumas. Mindestens zwei Tage zwischen der Anästhesie und der ersten Nachmessung sollte so gewählt werden, da das Tier muss davon erholen. Um eine Schätzung der Hörsturz direkt nach dem Trauma zu erhalten, Hirnstammaudiometrie (BERA) verwendet werden.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung (IZKF, Projekt E7) am Universitätsklinikum der Universität Erlangen-Nürnberg unterstützt.

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