比色金ナノ粒子アッセイに適用される構造スイッチングアプタマーを選択するための方法

本実験の全体的な目的は、ターゲットの結合に伴うアプタマーの構造変化をシグナルとして機能させる検出プラットフォームにおいて、認識素子として統合するための構造スイッチングアプタマーを生成することです。具体的には、ビオチン化キャプチャープローブと相補的DNAライブラリーをStrep-Tactinコート磁性ビーズに添加し、ビーズ表面にDNAライブラリーを固定化することでこれを実現します。次に、溶液に磁石を適用し、結合配列と、ビーズ上に残存する非結合配列を分離します。

その後、保持された配列を精製および増幅し、次回の選択ラウンドに用います。数回の選択ラウンド後、プロセスにネガティブセレクション（負の選択）ステップを追加します。さらに数回の選択ラウンドを経て、選択されたaptrが金ナノ粒子標的検出アッセイに基づき、標的結合時に構造変化を示すことが確認されました。

溶液ベースの細胞Xなどの既存技術と比較して本手法の主な利点は、ターゲットを固相支持体に固定する必要がないことです。したがって、本手法は個人の生理学的状態のリスク評価に活用でき、これはコルチゾールがストレスの指標であり、健康問題の評価につながるためです。このプロトコルでは、特にターゲットおよびコントロールについて、常に調製直後のDNA溶液を使用してください。

DNAの調製には特別な注意が必要です。DNAライブラリの100 µL分注量をサーモサイクラーチューブに移し、サーモミキサーを用いて95 °Cで5分間加熱します。その後、使用するまでチューブを氷上に保持してください。このDNAを使用する前に、分光光度計で正確な濃度を測定してください。

次に、磁気ビーズを準備します。ストレプトアビジン結合磁気ビーズをボルテックスし、そのうち400 µLを新しいマイクロ遠心チューブに移します。このチューブをマグネットの上に2分間置き、上清を除去した後、ビーズを洗浄します。400 µLの結合バッファーを加え、ボルテックスして洗浄を完了させます。

磁石を使用してビーズを分離し、上清を廃棄します。この洗浄工程を3回繰り返します。次に、キャプチャープローブを磁気ビーズ上に固定します。

まず、ビーズを再懸濁させ、50 µMのキャプチャプローブを含む400 µLの結合バッファーを加えます。次に、室温で緩やかに攪拌しながら、ビーズを10分間インキュベートします。未結合のキャプチャプローブを除去するため、同様に結合バッファー400 µLを用いて、さらに3回ビーズを洗浄します。

3回の洗浄後、さらに400 µLのバッファーを加え、残りのステップ用に100 µLのビーズ溶液を回収し、残りは4 °Cで保存します。この残りは、最大3週間まで後続の選択ラウンドに使用することが可能です。より多くのビーズが必要な場合は、この選択スキームにおいてストリンジェンシーを高めるために、より長いプローブを用いて調製できます。

例えば、他のストリンジェンシーを用いて十分な濃縮が達成されたラウンド13以降には、より長いプローブが使用されました。保存されていたビーズを使用する場合は、まず分注した量を、1回につき200 µLの結合バッファーを用いて2回洗浄してください。それ以外の場合、調製直後のビーズはすでに洗浄済みです。

次に、100 µLのsnap cool DNAをビーズに加え、室温で緩やかに撹拌しながら30分間インキュベートします。インキュベート後、ビーズを分離し、上清を廃棄します。DNA濃度を算出し、ビーズに結合したDNA量を決定します。

次に、200 µLの結合バッファーでビーズを3回洗浄します。緩やかに撹拌しながら、1回につき5分間、結合バッファーでビーズを洗浄させます。その後、結合バッファーを用いて標的分子を100 µMに調製し、この標的分子溶液200 µLでビーズを再懸濁します。

この場合、通常、第1ラウンドの選択ではコルチゾールが高濃度に存在します。ビーズをターゲットとともに、室温条件下で緩やかに撹拌しながら30分間インキュベートします。インキュベート後、ターゲットとなる配列を含む上清を回収します。

濃縮の1回おきに、プロセスのモニタリングのために最終上清からサンプルを採取します。透析によって上清からコルチゾールを除去します。標的分子が260 nmでのDNA吸光度測定を妨げない場合は、この工程を省略できます。毎ラウンド後、ポジティブセレクションステップで回収した上清をテンプレートとして、PCRにより標的結合DNAを増幅させます。

あらかじめ少量のテストPCRを行い、最適な増幅回数を決定してください。各サイクルの後に10 µLのサンプルを採取し、25 bpラダーと比較します。ここでは、ライブラリは85 bpで走行するはずです。10サイクル後に増幅産物が確認される場合は、サイクル数を減らす必要があります。

この結果は回によって異なる可能性があるため、常にテストランが必要です。その後、8本入りストリップチューブを用いて、選択したサイクル数で大規模なPCRを行います。次回の選択ラウンドに必要な1～2.5 nanomolesのDNAアンプリコンを得るために、6～8 mLの反応混合液を増幅させます。

PCR産物のサンプルをゲルを用いてダブルチェックします。その後、非磁性ストレプトコートビーズを用いて、産物の大部分を一本鎖DNAに変換します。フリッツで塞いだ小型カラムに、ビーズを300 µLロードします。

次に、ルアーロックシリンジを用いて、5 mLの結合バッファーでビーズを穏やかに洗浄します。カラム洗浄のために溶液を交換する際は、シリンジをカラムから外し、シリンジからプランジャーを抜いてください。これにより、ビーズへの不必要な乱れを防ぐことができます。

1列あたり1mLのPCR産物に対応する十分な数のビーズカラムを作成し、洗浄します。緩やかな圧力をかけてPCR産物をカラムに通します。DNA産物は、アンチセンス鎖を介して結合したビーズによって保持されます。

次に、DNA結合カラムを5 mLの結合バッファーで洗浄してすべてのPCR成分を除去し、結合プールDNAのみを残します。カラムからDNAを脱ハイブリダイズさせるために、0.2 Mの水酸化ナトリウムを0.5 mL加えます。その後、ヌクレアーゼフリーウォーターで調製した脱塩カラムを用いて、溶出液中の単鎖DNAを脱塩します。最初の0.5 mLのフロースルーは廃棄してください。

次に、1 mLのヌクレアーゼフリー水をカラムに通し、脱塩されたDNAを回収します。回収したDNAの吸光度を測定し、次ラウンドの選択に備えます。テキストプロトコルで説明した通り、ここで回収した一本鎖DNAを、キャプチャープローブを用いて調製したBeadsの新しい分注量に再度添加します。

2回目の選択は1回目と同様ですが、より低い濃度のコルチゾールを使用します。ただし、3回目からは、ポジティブセレクションの前にネガティブセレクションのステップを組み込んでください。最初のネガティブセレクションでは、結合バッファーで調製した1 µM プロゲステロン 200 µLをビーズに加えます。

構造はコルチゾールに似ていますが、それとは異なります。以降のラウンドでは、混合液を室温で30分間穏やかに振盪させた後、プロゲステロンの濃度を上げます。上清を廃棄し、200 µLの結合バッファーを用いてビーズを2回洗浄します。

次に、ポジティブセレクションを行います。以前に述べたように、ラウンドが進むにつれて、セレクションプロセスの厳格性に影響を与えるために基質濃度を変化させました。詳細はテキストプロトコルで説明しています。

次に、テキストプロトコルに従って、コルチゾール検出のための金ナノ粒子アッセイを実施します。この迅速かつ簡便な比色読み取り法は、標的結合時のアプタマーの構造変化に基づいています。したがって、本手法が構造スイッチング特性を持つアバー（aber）を選択できる能力を評価するための指標となります。

金ナノ粒子アッセイのもう一つの利点は、信号が増幅されるため、低分子に一般的なマイクロモル単位の親和性を持つアプタマーであっても、解離定数より数桁低いレベルで検出できることです。コルチゾールに特異的なアベル（abers）を単離するために、以下の選別プロトコルを用いました。透析および濃縮モニタリングを用いて、後半の選別ステップ後に標的分子の溶出量が増加したことを示しました。

最終段階において、標的分子の量を減らし、キャプチャープローブを長くしたところ、溶出量の減少が観察されました。数回の異なるラウンドを経て、溶出されたDNAを次世代シーケンシングを用いて解析しました。選択の第6ラウンド後では、コピー数が増加した配列の割合は低かったですが、13ラウンド後にはそれらが20のビンにランク付けされました。

はるかに高い割合のaberが高コピー数で存在していました。その後、選択プロセスをより厳格にした結果、ラウンド14および15では、選択されたaberのほぼ半分がコピー数頻度の第1ランクに属していました。

この時点で、30,000回のランにおいて約3,000種類の固有配列が存在していました。選別されたAPを金ナノ粒子とともにインキュベートし、続いてターゲットまたは比較用のコントロール基質を添加しました。このアッセイにより、APは胆汁酸よりもコルチゾールに対して、またこの手順の試行中に、より高い特異性を持つことが示されました。

各ラウンドにおける選別の厳格さを制御すること、およびPCRサイクル数を最適化することが重要です。このビデオを視聴することで、構造変化を起こすアプタマー（AP）の選別方法と、金ナノ粒子を用いた検出アッセイの実施方法について十分に理解することができるはずです。