शीतल अग्रवाल कालोनी गठन परख की उपयोगिता स्तन कैंसर की कोशिकाओं में Tumorigenicity के inhibitors पहचानें

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Horibata, S., Vo, T. V., Subramanian, V., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (99), e52727, doi:10.3791/52727 (2015).

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Abstract

Protocol

3% 2-Hydroxyethyl agarose के 1. तैयारी

  1. एक साफ, सूखे 100 मिलीलीटर कांच की बोतल में, आसुत जल का 30 मिलीलीटर द्वारा पीछा 2-hydroxyethyl agarose (Agarose सप्तम) के 0.9 जी जोड़ें।
  2. 15 सेकंड और धीरे लिए मिश्रण ज़ुल्फ़ माइक्रोवेव। Agarose पाउडर पूरी तरह से घुल जब तक इस चरण में कम से कम तीन बार दोहराएँ।
  3. 15 मिनट के लिए समाधान युक्त बोतल आटोक्लेव।
  4. Agarose समाधान के लिए आगे उपयोग करने से पहले आरटी को शांत करने के लिए अनुमति दें। आरटी पर समाधान स्टोर।

नीचे की परत के 2. तैयारी: 0.6% agarose जेल

  1. जब से निपटने पिपेट में solidifying से agarose को रोकने के लिए 5 मिलीलीटर और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 10 मिलीलीटर pipettes के पूर्व गर्म कई।
  2. आंशिक रूप से बोतल के ढक्कन और माइक्रोवेव 15 सेकंड के लिए पूर्व बनाया 3% 2-hydroxyethyl agarose समाधान ढीला। फिर, धीरे एक और 15 सेकंड के लिए समाधान और माइक्रोवेव ज़ुल्फ़। चेतावनी: agaro घूमता सावधान रहो, जबएसई समाधान समाधान हवा के संपर्क में है और फैल सकता है जब तक बढ़ जाता है।
  3. बोतल में अवशिष्ट ठोस जेल, कुछ और सेकंड के लिए माइक्रोवेव अगर वहाँ।
  4. समय से पहले ही solidifying से agarose समाधान को रोकने के लिए अगले चरणों के दौरान एक 45 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में agarose समाधान युक्त बोतल रखें।
  5. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म MCF10DCIS मीडिया। नोट: MCF10DCIS मीडिया DMEM / F12, 5% घोड़े सीरम, 5% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के होते हैं।
  6. स्थानांतरण एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पूर्व गर्म pipettes का उपयोग करते हुए 3% agarose समाधान के 3 मिलीलीटर।
  7. तुरंत गर्म MCF10DCIS मीडिया के 12 मिलीलीटर जोड़ने और धीरे मीडिया के साथ agarose मिश्रण करने के लिए शंक्वाकार ट्यूब पलटना। यह कॉलोनी बाद में गिनती के साथ हस्तक्षेप करेगा रूप में किसी भी बुलबुले फार्म के लिए नहीं की कोशिश करें।
  8. धीरे किसी भी हवाई बुलबुले के गठन के बिना 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में से प्रत्येक कुएं में इस मिश्रण के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  9. 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली horizonta सेतेlly के 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्लैट सतह पर मिश्रण जमना करने के लिए अनुमति देने के लिए।
  10. मिश्रण solidifies के बाद, 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली जगह है। नीचे की परत अब इस्तेमाल के लिए तैयार है।

सेल युक्त परत 3. तैयारी: 0.3% agarose जेल

  1. Trypsinize MCF10DCIS कोशिकाओं 4 एक्स 10 4 / एमएल के एक सेल एकाग्रता के लिए उन्हें कमजोर और।
  2. एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पूर्व गर्म pipettes और हस्तांतरण का उपयोग कर 3% agarose के 2 मिलीलीटर ले लो।
  3. इसके तत्काल बाद शंक्वाकार ट्यूब MCF10DCIS मीडिया के 8 मिलीलीटर जोड़ने और धीरे मीडिया के साथ agarose मिश्रण करने के लिए पलटना। किसी भी बुलबुले के गठन से बचें।
  4. (0 माइक्रोन (DMSO के) या 1 माइक्रोन) MCF10DCIS कोशिकाओं (4 एक्स 10 4 / एमएल) के 2 मिलीलीटर ले लो और बी बी सीएलए के साथ व्यवहार करते हैं।
  5. एक 1: 1 के कमजोर पड़ने, 0.6% agarose के साथ कोशिकाओं मिश्रण।
  6. सेल agarose के मिश्रण का 1 मिलीलीटर ले लो और धीरे से 6 अच्छी तरह से संस्कृति पी के नीचे की परत पर जोड़देर से (2 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल)।
  7. ऊपर परत जमना करने के लिए अनुमति देने के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सपाट सतह पर क्षैतिज 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली रखें।
  8. मिश्रण solidifies के बाद, खिला परत जोड़ने से पहले एक सप्ताह के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली जगह है।

फीडर परत 4. तैयारी: 0.3% agarose जेल

  1. माइक्रोवेव 15 सेकंड के लिए पूर्व बनाया 3% 2-Hydroxyethyl agarose समाधान। धीरे एक और 15 सेकंड के लिए समाधान और माइक्रोवेव ज़ुल्फ़।
  2. एक 45 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में agarose समाधान बोतल संतुलित करना।
  3. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में MCF10DCIS मीडिया गर्म।
  4. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में गर्म MCF10DCIS मीडिया के 9 मिलीलीटर के साथ 3% agarose समाधान के 1 मिलीलीटर मिक्स और धीरे मीडिया के साथ agarose मिश्रण करने के लिए पलटना। हवा के बुलबुले के गठन से बचें।
  5. बी बी सीएलए के साथ मिश्रण (0 माइक्रोन (DMSO के) या 1 माइक्रोन) समझो।
  6. धीरे लिए बिना (इस मिश्रण का 1 मिलीलीटर जोड़नेमिंग नीचे और नरम परतों युक्त 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में से प्रत्येक कुएं में) बुलबुले।
  7. मिश्रण जमना को अनुमति देने के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सपाट सतह पर क्षैतिज 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली रखें।
  8. फीडर परत जम जाने के बाद, एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली जगह है।
  9. कॉलोनी के गठन मनाया जाता है जब तक नए मीडिया के साथ कोशिकाओं की भरपाई करने के लिए मौजूदा फीडर परत पर 0.3% agarose / मध्यम / उपचार के समाधान के 1 मिलीलीटर overlaying द्वारा इस खिला प्रक्रिया साप्ताहिक दोहराएँ। नोट: अग्रवाल मुलायम और फीडर परतों में इसलिए, फीडर परत से जोड़ा पोषक तत्वों को आसानी से कोशिकाओं तक पहुंचने के लिए सेल युक्त परत में फैलाना होगा, बहुत नरम है और।

5. डेटा संग्रह

  1. नरम अगर में सेल के विकास के 2.5 सप्ताह के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करने में कालोनियों की संख्या गिनती। मात्रा का ठहराव की सुविधा के लिए, एक पारदर्शिता पर एक ग्रिड प्रिंट और करने के लिए ग्रिड देते हैं6 अच्छी तरह से थाली कोशिकाओं की गिनती के दौरान कर रहे हैं, जहां पता लगाने में मदद करने के लिए। (प्रत्येक कॉलोनी के व्यास द्वारा मात्रा के रूप में) कॉलोनी आकार भिन्न हो जाएगा के बाद से रन बनाए, जो किया जाएगा कालोनियों निर्धारित करने के लिए एक संदर्भ कॉलोनी आकार पूर्वपरिभाषित। उदाहरण के लिए, 70 माइक्रोन या डेटा विश्लेषण में बड़ा कॉलोनी आकार शामिल हैं।
  2. आगे कॉलोनी गठन और भविष्य की गिनती के लिए रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान। बाहर सुखाने से जैल को रोकने के लिए Parafilm के साथ 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली सील।

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Representative Results

नरम अगर कॉलोनी गठन परख कैंसर कोशिकाओं के tumorigenicity दस्तावेजीकरण आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ अर्द्ध ठोस मैट्रिक्स चुनिंदा एक लंगर स्वतंत्र ढंग से उत्पन्न कर सकते हैं कि कोशिकाओं के विकास के पक्ष में है। यह विशेषता मुख्य रूप से कैंसर की कोशिकाओं द्वारा नहीं बल्कि सामान्य कोशिकाओं द्वारा प्रदर्शन किया है। हम मुख्य रूप से दवाओं से ट्यूमर के विकास को निषेध की प्रभावोत्पादकता की जांच करने के लिए और स्तन कैंसर की कोशिकाओं की tumorigenicity पर, overexpression या PADI जीन सहित हित के हमारे जीन, की कमी के प्रभाव के लिए परीक्षण करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करें। यहाँ, हम PADI2-overexpressing MCF10DCIS कोशिकाओं के tumorigenic निषेध पर बीबी-सीएलए के प्रभाव का आकलन (चित्रा 1 और 2)।

परिणामों बी बी-सीएलए काफी MCF10DCIS सेल व्युत्पन्न कालोनियों के गठन रोकता है कि प्रदर्शित करता है। 3 चित्रा से पता चलता है, कि एक PADI अवरोध करनेवाला की उपस्थिति में, टी DMSO के नियंत्रण की तुलना में यहाँ जब दोनों कॉलोनी गठन और कॉलोनी आकार में कमी थी। [ध्यान दें:। बी बी-सीएलए DMSO में भंग कर दिया गया है और इस तरह, DMSO के एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था] बी बी-सीएलए के लिए कालोनियों के आकार MCF10DCIS कोशिकाओं 100 माइक्रोन से 20 की सीमा के भीतर मुख्य रूप से थे इलाज किया, जबकि DMSO के लिए कालोनियों का आकार नियंत्रण वृद्धि के 2.5 सप्ताह के बाद 70 माइक्रोन से 150 की एक बड़ी रेंज का प्रदर्शन किया।

70 माइक्रोन से बड़ा कालोनियों में गिना और (चित्रा 4) विश्लेषण किया गया। केवल 1967 कालोनियों नरम अगर संस्कृति का 2.5 हफ्तों के बाद बीबी-सीएलए इलाज समूह में देखा गया था, जबकि DMSO के नियंत्रण में 3536 कालोनियों के एक औसत हुई थी। इस PADI अवरोध करनेवाला द्वारा स्तन कैंसर की कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण tumorigenic निषेध (MCF10DCIS कोशिकाओं), यह दर्शाता है 1 माइक्रोन बी बी-सीएलए की उपस्थिति में औसत कॉलोनी गठन में एक 44% कमी का प्रतिनिधित्व करता है।

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बी बी-सीएलए के चित्रा 1. रासायनिक संरचना।

चित्र 2
शीतल अग्रवाल कालोनी गठन परख के लिए प्रोटोकॉल के चित्रा 2. योजनाबद्ध सिंहावलोकन। 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से पहले 0.6% agarose जेल (नीचे की परत) के साथ लेपित किया गया था। MCF10DCIS कोशिकाओं और बी बी-सीएलए अवरोध करनेवाला (1 माइक्रोन) या DMSO के (नियंत्रण) या तो युक्त एक 0.3% agarose जेल मिश्रण तो 0.6% जेल के शीर्ष पर स्तरित किया गया था। एक बार एक हफ्ते, 0.3% agarose जेल मिश्रण (बी बी-सीएलए युक्त) मुलायम परत के शीर्ष पर जोड़ा गया है। 2 से 4 सप्ताह के बाद, कॉलोनी गठन मनाया गया और डेटा विश्लेषण के लिए गिना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बी बी-सीएलए इलाज MCF10DCIS कोशिकाओं में कॉलोनी गठन के चित्रा 3. छवियां। MCF10DCIS कोशिकाओं बी बी-सीएलए (0 माइक्रोन DMSO) की उपस्थिति (1 माइक्रोन बी बी-सीएलए) या ​​अनुपस्थिति में नरम अगर में बड़े हो रहे थे। 2.5 सप्ताह, कालोनियों कम बढ़ाई छवियों के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप और उच्च बढ़ाई छवियों के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग imaged गई। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
MCF10DCIS कालोनी नंबर की चित्रा 4. मात्रा बी बी-सीएलए उपचार। MCF10DCIS कोशिकाओं बी बी-सीएलए (0 माइक्रोन (DMSO के), या 1 माइक्रोन बी बी-सीएलए) के विभिन्न सांद्रता में नरम अगर में बड़े हो रहे थे के बाद। 2.5 सप्ताह के बाद, व्यक्तिगत कालोनियों बड़ा वेंएक 70 माइक्रोन गिना रहे थे। प्रयोगों से 4 बार दोहराया गया (एन = 4)। नियंत्रण और उपचार के नमूनों के बीच कुल सेल गिनती अंतर का सांख्यिकीय महत्व दो नमूना छात्र के टी-परीक्षण (* पी <0.005) द्वारा निर्धारित किया गया था।

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Discussion

नरम अगर में कॉलोनी गठन की दर सेल प्रकार 9 पर निर्भर करता है। इसलिए, कोशिकाओं की संख्या अनुकूलित और तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए के साथ शुरू करने के लिए। एक सुझाव दिया शुरुआती रेंज में अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से थाली का उपयोग करते हुए 4 प्रति 10 एक्स 2-01 अक्टूबर एक्स 5 के बीच कोशिकाओं है। इसके अलावा, कॉलोनी आकार प्रत्येक कोशिका का विकास दर पर निर्भर करता है। इसलिए, कॉलोनी आकार के लिए एक पूर्वनिर्धारित एक कट ऑफ बहाव के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अलग-अलग कालोनियों व्याख्या करने की जरूरत है। इधर, बड़े से अधिक 70 माइक्रोन प्रारंभिक चढ़ाना से व्युत्पन्न गैर proliferating कोशिकाओं के शामिल किए जाने से बचने के लिए मात्रा निर्धारित किया गया कालोनियों।

3 डी agarose जैल बनाने जब इष्टतम विकास के लिए, यह सामान्य रूप से 2 डी सेल संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल एक ही सेल संस्कृति माध्यम का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। अक्सर बार मध्यम बदल रहा है, इस प्रकार की कोशिकाओं को नए माध्यम के लिए अनुकूल करने की अनुमति देने के लिए अतिरिक्त passaging की जरूरत महसूस की कोशिकाओं की वृद्धि दर को बदल देता है क्योंकि यह है। उदाहरण के लिए, MCF10DCIS कोशिकाओं RPMI-1640, DMEM, या DMEM / F12 के मीडिया में बेहतर हो सकता है। MCF10DCIS संस्कृति मीडिया DMEM / F12 के लिए RPMI-1640 से बदल रहा है हालांकि, जब सेल प्रसार दर में उल्लेखनीय कमी नहीं है। इसके अतिरिक्त, देखभाल सीरम के बिना, कॉलोनी गठन के 10 हिचकते होगा, क्योंकि एक निरंतर स्तर पर सीरम सांद्रता बनाए रखने के लिए लिया जाना चाहिए। Agarose microwaved होने के बाद इसके अलावा, बोतल मीडिया कोशिकाओं overheating रोकने के लिए कोशिकाओं को रोकने के साथ मिश्रण से पहले एक 45 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में संतुलित करने की अनुमति देते हैं। Agarose के कमरे के तापमान पर तेजी से solidifies यह देखते हुए कि, हम भी सभी pipettes और 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों से निपटने जबकि समय से पहले दृढ़ीभवन को रोकने के लिए agarose समाधान जोड़ने से पहले एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में छोड़ देते हैं जो सलाह देते हैं।

नरम अगर कॉलोनी गठन तकनीक कैंसर कोशिका लाइनों की एक श्रृंखला में tumorigenicity को मापने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, वहीं कुछ लाइनों नरम अगर में जाना नहीं है। Anotविधि की उसकी क्षमता का दोष यह है कि वे नरम अगर में चढ़ाया जाता है एक बार व्यवहार्य कोशिकाओं बरामद नहीं किया जा सकता है। एक परिसर में एक छोटी जैव उपलब्धता अवधि है इसके अतिरिक्त, यदि खिला कदम अधिक बार (यानी हर दूसरे दिन) का प्रदर्शन करने की आवश्यकता होगी और नमूने कम से कम सात दिनों में एकत्र करने की आवश्यकता होगी। कॉलोनी आकार के लिए सीमा भी अभी भी मनाया जा नमूनों के बीच संभावित मतभेद के लिए अनुमति देता है, जबकि कम करने की आवश्यकता होगी। इन उदाहरणों में, नियंत्रण-झूठी सकारात्मक और झूठी नकारात्मक परिणामों को कम से कम करने के लिए प्रयोगात्मक मापदंडों का अनुकूलन करने के लिए शामिल किया जा करने की आवश्यकता होगी। नमूनों की एक बड़ी संख्या का परीक्षण जब इसके अलावा, इस तकनीक का समय लगता है और मुश्किल हो सकता है। हालांकि, तकनीकी विकास के इन सीमाओं के कुछ काबू पाने के लिए मदद की है। (इस पांडुलिपि में दस्तावेज के रूप में) पारंपरिक नरम अगर परख आम तौर पर 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों या 6 मिमी संस्कृति व्यंजन का उपयोग करता है। स्वचालित थाली पाठकों के साथ, तथापि, multiplई नमूने 384 अच्छी तरह प्लेटें 11 में कार्रवाई की जा सकती है। उदाहरण के लिए, जांचकर्ताओं को इस प्रकार मैन्युअल रूप से कॉलोनी संख्या 11 गिनती करने के लिए आवश्यकता समाप्त, प्लेट रीडर का उपयोग मात्रा निर्धारित कर रहे ऐसे alamarBlue के रूप में रंगों और tetrazolium रंगों और कालोनियों के साथ ट्यूमर कोशिकाओं से भरी हुई प्री। इस उच्च throughput क्षमता है, इसलिए बड़े पैमाने पर कैंसर की दवा स्क्रीन के लिए उत्तरदायी है।

संक्षेप में, नरम अगर परख, दवाओं, हार्मोन के लिए उनकी संवेदनशीलता के संबंध के साथ कैंसर की कोशिकाओं (स्तन, प्रोस्टेट, डिम्बग्रंथि, और अन्य) की एक विस्तृत श्रृंखला के tumorigenicity का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक मूल्यवान पूर्व नैदानिक ​​तकनीक है गर्मी, हाइपोक्सिया, और अन्य उपचार की स्थिति की एक भीड़। परख बेहतर कैंसर की प्रगति के तंत्र को समझने के लिए और नए कैंसर के उपचार के विरोधी ट्यूमर क्षमता का परीक्षण करने के लिए इच्छा कैंसर शोधकर्ताओं के लिए एक सरल और सूचनाप्रद उपकरण उपलब्ध कराने के लिए जारी है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Axiopot Carl Zeiss Microscopy 1021859251
Inverted Microscope Olympus CKX41
DMEM/F-12 Lonza BioWhittaker 12-719F
HyClone Donor Equine Serum Fisher Scientific SH30074.03
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature Sigma-Aldrich 39346-81-1

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References

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