Évaluation de la propriétés immunomodulatrices des mésenchymateuses humaines cellules souches (MSC)

L’objectif général de cette expérience est d’évaluer les propriétés immunomodulatrices des cellules souches mésenchymateuses humaines ou CSM. Cette méthode peut aider à élucider les mécanismes impliqués dans l’immunomodulation des cellules souches mésenchymateuses humaines, un processus qui peut avoir une pertinence thérapeutique. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible d’évaluer à la fois l’apparition d’un effecteur, la prolifération leucocytaire et le nombre de divisions cellulaires, ce qui démontre que la procédure sera effectuée par chaussure.

Un technicien de mon laboratoire Pour isoler le PBMC, commencez par diluer 25 millilitres d’un échantillon de sang total hépariné avec 25 millilitres de PBS dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, ajoutez 15 millilitres de phi, appelez le gradient de densité du pack à un nouveau tube de 50 millilitres. Ensuite, en tenant le tube en biais, superposez lentement la suspension cellulaire diluée sur le gradient de densité.

En prenant soin de cela, il n’y a pas de mélange des couches. L’une des étapes les plus critiques de cette expérience est une stratification du sang sans perturber le gradient de densité. Il s’agit d’assurer une grande pureté et une faible contamination par les globules rouges du pbmc isolé.

Maintenant, séparez les cellules par centrifugation. Trois couches distinctes doivent être apparentes. La couche supérieure de plasma, la couche inférieure de gradient de densité de fial pack et une fine couche intermédiaire PBMC.

À l’aide d’une pipette en PE, retirez la couche supérieure en prenant soin de ne pas aspirer la couche interphasique. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 10 millilitres, transférez soigneusement le pbmc dans un tube conique de 50 millilitres. Mélangez les cellules avec 20 millilitres de PBS, puis faites-les tourner vers le bas pour éliminer toute trace de gradient de densité.

Ensuite, lavez la pastille dans 20 millilitres supplémentaires de PBS pour éliminer les plaquettes. Resus en suspension de la deuxième pastille dans un milieu leucocytaire complet à une concentration d’une fois 10 des sept cellules par millilitre. Pour mettre en place une co-culture de leucocytes MSC préchauffée, remplissez le milieu MSC à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes maximum.

Ensuite, ensemencez cinq fois 10 à la quatrième CSM par un millilitre de milieu CSM complet par puits dans des plaques de 24 puits pour une fixation de nuit à 37 degrés Celsius, permettant aux cellules d’atteindre 80 % de confluence. Le lendemain matin, aspirez le milieu et ajoutez le nombre approprié de BMC P marqués CFSE au MSC dans un millilitre de milieu leucocytaire complet. À un rapport de 1 à 10 MSC / PBMC, activez les cellules avec 10 microgrammes de PHA par millilitre de milieu leucocytaire complet.

Ensuite, aux troisième et cinquième jours de la co-culture, transférez le nombre approprié de co-cultures dans des tubes de fax à fond rond et évaluez la prolifération des leucocytes marqués au CFSE par analyse cytométrique en flux pour effectuer un test de suppression des effecteurs. Commencez par mettre en place une co-culture M-S-C-P-B-M-C comme nous venons de le démontrer avec 2,5 fois 10 à la sixième co-culture p BMCs avec 250 000 MSC. Pour assurer une co-culture MSC suffisante pour la sélection des sous-populations.

Après 48 à 72 heures à 37 degrés Celsius, sélectionnez les leucocytes immunomodulateurs induits par les CSM d’intérêt avec les billes magnétiques appropriées. Ensuite, ajoutez quatre lymphocytes T allogéniques marqués au CFSE dans un millilitre de milieu leucocytaire complet par puits à divers ratios expérimentaux. Ensuite, ajoutez des microbilles conjuguées anti-CD 3 28 dans un rapport B/cellule de un à un pour un pour stimuler les cellules T positives de quatre CD.

Le troisième jour de la co-culture, évaluez la prolifération des cellules T CD quatre positives marquées au CFSE par cytométrie en flux Les CSM sont des cellules adhérentes avec une morphologie en forme de fuseau fibroblastique. Et les pbmc et les leucocytes sont de petites cellules rondes non adhérentes, ce qui permet de distinguer clairement ces deux populations cellulaires. Dans une co-culture, lorsqu’il n’y a pas de prolifération, les cellules marquées au CFSE sont observées comme un pic hautement positif et fortement fluorescent lorsque les cellules ont été activées.

La prolifération se manifeste par plusieurs pics plus petits avec une perte et un décalage vers la gauche de l’intensité de la fluorescence lorsque la suppression de la prolifération s’est produite. Par exemple, dans une co-culture MSC, le nombre de plusieurs pics plus petits diminue avec une augmentation concomitante de l’intensité de la fluorescence, comme en témoigne le décalage des pics vers la droite et l’augmentation de la netteté du pic le plus à droite, qui représente les cellules non divisées dans un test de suppression des effecteurs. L’effet suppressif de la CSM sur la prolifération des lymphocytes T positifs pour la CD quatre peut être évalué plus en détail de manière dose-dépendante.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’évaluer l’immunomodulation des cellules souches mésenchymateuses humaines. N’oubliez pas que travailler avec des cellules humaines peut être dangereux et que des précautions doivent toujours être prises.