Isolement de cellules stromales mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical BAMBI^humain

Notre objectif est d’isoler des sous-groupes spécifiques de CSM-UC humaines et d’analyser leurs caractéristiques de base en fonction de leurs facteurs transcriptomiques unicellulaires. Nous essayons de répondre à quels sont les caractères et les fonctions distincts des différentes sous-populations de l’UC-MSC. Les développements les plus récents dans notre domaine sont la découverte de l’hétérogénéité des populations mixtes de CSM, principalement par l’utilisation du séquençage d’ARN unicellulaire.

Nous avons identifié les trois sous-populations au sein des UC-MSC humaines, y compris les cellules BAMBI à haute MFGE8. Ce sous-groupe présente un phénotype distinct, un profil transcriptomique unique, un potentiel adipogénique limité et une activité immunosuppressive réduite dans la néphrite lupique. Ces résultats font progresser la compréhension des CSM-UC et soutiennent la sélection de sous-groupes optimaux pour le traitement de maladies spécifiques.

Nous ouvrons la voie à la compréhension des fonctions réelles non seulement de BAMBI high MFGE8 high UC-MSC, mais aussi des deux autres sous-groupes, en particulier leurs rôles dans le traitement de différentes maladies. Nous continuerons à nous concentrer sur le démarrage des applications des sous-groupes humains UC-MSC sur de multiples maladies à médiation immunitaire et sur l’exploration de leurs mécanismes moléculaires dans le traitement de ces maladies. Pour isoler les UC-MSC BAMBI à haute MFGE8, cultivez des UC-MSC à une densité d’environ 5 à 10 fois 10 à la puissance 6 cellules dans un DMEM complet.

Ajoutez 0,5 millimolaire d’EDTA pendant cinq minutes pour dissocier les cellules. Ensuite, ajoutez le DMEM complet et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Pipetez la suspension cellulaire de haut en bas plusieurs fois pour préparer une suspension unicellulaire.

Prenez 10 microlitres de suspension cellulaire. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et calculez le nombre total de cellules prélevées. Après avoir compté, centrifugez le nombre requis de cellules à 300 G pendant cinq minutes.

Remettre la pastille en suspension dans un millilitre de milieu complet pour atteindre une concentration de 5 à 10 fois 10 à la puissance 6 cellules par millilitre, et placer le tube sur de la glace. Ensuite, divisez les cellules récoltées dans quatre tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ajouter les anticorps primaires à une dilution de 1 à 100 dans les tubes MFGE8 et BAMBI.

Mélangez soigneusement le contenu et incubez les cellules à température ambiante pendant 15 minutes. Après l’incubation, ajoutez du PBS pour laver les cellules marquées. Centrifuger les tubes à 300 G pendant cinq minutes et jeter le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans un millilitre de milieu complet.

Ajouter les anticorps secondaires fluorescents conjugués à une dilution de 1 à 1 000 dans les cellules remises en suspension. Bien mélanger et incuber les tubes à température ambiante dans l’obscurité pendant quatre 15 minutes. Après l’incubation, ajoutez du PBS et une centrifugeuse pour laver les cellules marquées.

Remettez le granulé en suspension dans 500 microlitres de milieu complet et filtrez-les à travers une passoire à cellules de 70 micromètres pour éliminer les grumeaux et les débris. Transférez le filtrat dans un tube de 15 millilitres pour le tri par cytométrie en flux. Exécutez le tube de cellules vierges comme contrôle négatif sans ajouter d’anticorps.

Ajustez les paramètres de diffusion vers l’avant et de diffusion latérale sur le cytomètre en flux afin d’établir l’échelle de déclenchement pour la population non colorée. Ensuite, exécutez MFGE8 et BAMBI marqués à un seul anticorps comme contrôle de contrôle pour déterminer où commence la positivité dans le graphique. Exécutez les tubes d’échantillonnage expérimentaux pour trier la population de cellules BAMBI à haut MFEG8 et collecter les cellules triées.

Plaquez les CSM triées dans une plaque à 24 puits et incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Une fois que les cellules triées se sont développées à travers deux passages, effectuez une analyse par cytométrie en flux pour confirmer la pureté de la population triée. Les UC-MSC en culture étaient fortement positives pour l’expression de CD44, CD73, CD90 et CD105, et négatives pour l’expression de CD14, CD34, CD45, CD79 et HLA DR.

Les CSM BAMBI à forte teneur en MFEG8 ont été triées à partir de CSU-UC humaines cultivées, et leurs niveaux d’expression élevés de BAMBI et MFEG8 ont été confirmés comme persistant à travers trois à quatre passages. La fréquence des CSM BAMBI élevées en MFEG8 variait en fonction du donneur et de la méthode de dissociation.