外膜细胞小鼠胚胎心脏的体外培养

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Ramesh, S., Singh, A., Cibi, D. M., Hausenloy, D. J., Singh, M. K. In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart. J. Vis. Exp. (110), e53993, doi:10.3791/53993 (2016).

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Abstract

Introduction

实验数据的财富已经说明了外膜影响心脏发育的关键步骤。在开发过程中,所述横隔引起称为proepicardium 1-4间皮细胞丛。从proepicardium细胞然后迁移和信封心肌形成心外膜。在此之后,心外膜细胞的子集经历EMT引起心外膜衍生细胞(EPDCs),该随后侵入心肌的迁徙人口。遗传以及逆转录病毒谱系追踪实验已经证明,EPDCs分化成各种细胞谱系,包括平滑肌细胞,成纤维细胞,内皮细胞和心肌细胞(如有的话)。因此EPDCs显著向冠状脉管和心肌架构1,2,4-9的发展。此外,心外膜是心室致密层10-12的发展至关重要。前面xample Gittenberger德Groot 等人证明了抑制proepicardium的生长导致的缺陷的阵列例如薄心肌,心脏和室间隔形成异常的缺陷循环,其结果,胚胎致死13。从胚胎外膜分泌的旁分泌因子调节心肌细胞的增殖和分化。与此相一致,信号传导途径,如视黄酸(RA),成纤维细胞生长因子(的FGFs)和Wnt /β-catenin的特异性外膜-缺失导致有缺陷的心肌的生长和胚胎致死14-16。

虽然心外膜被认为是在成年心脏静止的,最近的研究已经表明,在发育程序跟随的心脏损伤17,18激活的心外膜。在激活时,将细胞进行快速增殖和EMT导致在EPDC形成。这些细胞表现出capacity以分化成成纤维细胞和平滑肌细胞,但不心肌或血管内皮细胞18。此外,EPDCs分泌促血管生成因子,援助在受伤部位的血管形成,从而通过减小梗塞尺寸促进改善心脏功能。由于这些发现,心外膜已经获得了在心血管发育,疾病和再生的研究兴趣。

转基因技术在21世纪革命性的医学研究。随着转基因技术的帮助下,患病小鼠模型代谢和病理生理模仿人类状况已开发成功。然而,在研究这些突变体的外膜细胞行为一直主要是由于早期胚胎死亡的一个挑战。考虑到心外膜在心脏发育和再生发挥的作用显著,我们已经建立了鼠标epicardia 体外培养体系L细胞。这种方法允许心外膜细胞的长期培养和便于心外膜的两个重要的属性的详细研究:其迁移和分化的能力。从小鼠切下的心室可以在其可以被用来进行迁移测定胶原凝胶中培养。在复制层外膜的富含胶原蛋白的细胞外基质更好地概括了体内细胞生理学3D矩阵待培养。或者,它们可以在腔室玻片,以建立一个心外膜单层然后可以用于各种下游应用进行培养。此单层可用于染色为紧密连接蛋白,这将提供在外膜的经历EMT的能力是用于迁移至关重要的见解。此外,分化实验也可以在这些细胞中进行。此外,基因表达模式可以通过从细胞中提取的RNA进行分析,并执行定量聚合酶链反应(qPCR的)。最后,单层也可以与代理后跟一个分子分析来测试潜在治疗处理。放在一起,这个心外膜培养体系为我们提供了机会,可视化和收集这进一步加强了我们对心外膜发展的理解分子数据。

这种方法的另一个期望的特征是,它是简单的,并且不需要复杂的设置。简言之,将胚胎在其中心脏切除E11.5或E12.5以下收获。脑室然后在任胶原凝胶或玻片培养。随后,这些细胞可以被用来进行下行实验。

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Protocol

所有实验均在杜克 - 新加坡国立大学医学研究生院机构动物护理和使用委员会批准。

1.检索心室胚胎

  1. 在祭祀用二氧化碳气体供应或其他认可的安乐死方法的安乐死室所需的萌芽阶段(E11.5 E12.5或)一个定时孕鼠。
  2. 把鼠标放在其解剖台上。消毒用70%乙醇女性的腹部。提起在腹部皮肤,使一个小切口(1-2厘米),用刀片,然后用双手握住皮肤拉掉,露出腹壁。
  3. 现在,切开腹壁,露出子宫角。使用无菌镊子抬起子宫角,小心切掉附着于子宫角的脂肪组织和血管。在宫颈切检索子宫。
  4. 放置子宫角中含有无菌冷的1×磷酸盐的Buff培养皿 ERED液(PBS),轻轻冲洗。广场上冰的培养皿。
  5. 用剪刀通过子宫角(相对到胎盘位于的站点)的中线切割以暴露仍然卵黄囊内,并通过胎盘附着于子宫壁的胚胎。
  6. 使用无菌镊子,剖开胚胎卵黄囊释放胚胎。
  7. 放入装有无菌冷1X PBS一个新的培养皿胚胎。斩首胚胎,并将其放置在它的后面。切开胸壁暴露心脏。
  8. 使用无菌镊子解除心脏和切掉周围的血管从胸壁释放心脏。要特别注意不要用手术工具破坏心脏的外膜。
  9. 剪掉流出道和两个心房。转移心室与冷1X PBS另一道菜。广场上冰的菜。
  10. 重复步骤1.6-1.9,直到所有的心室检索。
乐“> 2。心外膜外植体培养

注意:这些文化心外膜外植体无论是在玻璃玻片或胶原凝胶下游应用。

  1. 玻璃商会幻灯片
    1. 以制备培养基,10%胎牛血清(FBS),1%青霉素/链霉素和2纳克/ ml重组成纤维细胞生长因子2(FGF2)加入Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)。执行在层流罩中的所有步骤。
    2. 将500μl培养基添加到8孔腔室的每个孔中。
    3. 将每个切心室在井的中心。定向心室保持解剖面朝下的阱的底表面上。
    4. 轻轻的把盘子在37℃,5% CO 2细胞培养孵化器。
    5. 保持与最小的干扰文化,让植坚持。心外膜单层的形成可后48-72小时进行观察。
    6. 对于epicard分化胶质细胞分化成平滑肌细胞,培养的心外膜单层细胞在分化培养基中再6天。为了制备分化培养基,10%FBS,1%青霉素/链霉素和50ng / ml重组转化生长因子β1(TGF-β1)添加到DMEM中。
    7. 更改隔日培养基。
  2. 胶原凝胶
    1. 准备使用根据制造商的协议的商用3D胶原培养试剂盒在一个96孔板的胶原凝胶。
    2. 为了制备胶原凝胶的所需体积,用DMEM的5倍和移液器上下混合的胶原溶液的适当的量。该解决方案应该变黄。
    3. 加入中和液相应的体积和吹打向上和向下以及立即混合。该解决方案将变成粉红色。
    4. 吸管100微升该混合物到96孔板的每个孔中。放置板在37℃,5%CO 2培养箱中30-60分钟,以人的低的凝胶聚合。
    5. 添加培养基的200微升上面充分描述的每个。
    6. 将每个切心室在井的中心。东方心室保持解剖面朝下放在胶原凝胶(心室心尖部应面对实验者)。轻轻把盘子放回细胞培养孵化器。
    7. 在3天之后,取出心室。把盘子放回另外2天细胞培养孵化器。
    8. 更改隔日培养基。

3.固定和可视化

注意:心外膜细胞可以在任一玻璃玻片或胶原凝胶被可视化。

  1. 吸出培养基并加入无菌1×PBS中的等体积的洗细胞。
  2. 加入足够的4%低聚甲醛(PFA),以覆盖细胞。定为10分钟,将细胞在4℃。
  3. 删除PFA和1X PBST(1X PBS洗具植0.1%的Triton X-100),以透化细胞。
  4. 具有所需的抗体( 的Alexa Fluor 488鬼笔环肽; ZO-1,α微管蛋白和α平滑肌肌动蛋白)免疫染色7。

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Representative Results

使用该培养协议,主心外膜细胞可以用高纯度的下游应用中分离。培养的细胞能够经历EMT,迁移和分化,正如心外膜细胞在体内做。

为了确定我们的主要心外膜细胞培养的纯度,我们分析Sema3d GFPCre / +生成的心外膜外植体; R26 汤姆/ +胚胎。 Sema3d是早期心脏发育过程中的心外膜细胞中表达,从而从这些胚将RFP标记心外膜细胞。我们孤立心室从Sema3d GFPCre / +; R26 汤姆/ +胚胎心外膜外植体。 48-72小时后,我们能够看到心外膜细胞的单层。叠加RFP免疫荧光和明图像显示,多数从心室迁移的细胞是心外膜起源( 图1A - C)的。我们通过分离从主心外膜细胞的RNA并进行定量PCR这表明的,而不是一个心肌细胞标记基因( 的Nkx2.5)( 图1C)外膜特异性基因(Tbx18Wt1的 )强烈表达进一步验证我们的结果。

接下来,我们研究了细胞通过分析心外膜细胞的细胞极性和细胞 - 细胞接触经历EMT的能力。 EMT是一种生物过程,允许上皮细胞失去其细胞极性和细胞 - 细胞接触,以转化成一个洄游间充质细胞。 EMT的第一步是细胞 - 细胞接触的脱离。我们免疫染色心外膜细胞用这表明ZO-1的定位于质膜表明细胞具有ZO-1(也称为Tj​​p1,紧密连接蛋白1)尚未经历EMT( 图2A)。接下来,我们进行免疫染色α微管蛋白( 图2B),以便观察心外膜外植体的微管,这表明促进心外膜细胞的定向迁移一个偏振取向的组织。此外,为了确定心外膜细胞的分化潜能,我们培养他们6天在分化培养基含有重组TGF-β1。免疫染色对SMA表现出心外膜细胞成功分化成平滑肌细胞( 图2C)。

最后,分析外膜的细胞迁移和心外膜的EMT,我们还进行了胶原凝胶侵袭测定。心外膜衍生细胞通过鬼笔环肽染色可视化。心外膜来源的细胞成功迁移可以看出所有周围的外植体( 图3A)。以确定对d细胞渗入胶原基质EPTH,由共焦图像生成的3D重建。心外膜来源的细胞的渗透可在Z轴堆叠( 图3B)中可以看出。

图1
1: 从胚胎小鼠心脏心外膜细胞原代培养代表性明(A)和RFP免疫(B)从E12.5 Sema3d GFPCre / +生成的主心外膜细胞的图像; R26 汤姆/ +心。合并后的明和免疫荧光图像(C)。心外膜标记(Tbx18Wt1的 ),并在原心外膜细胞(D)心肌标志物( 的Nkx2.5)的相对mRNA表达水平。结果被标准化为GAPDH表达,并且相对表达水平被给予了倍的差距相比,表达的Nkx2.5(N = 3)。数据被表示为平均值±标准差。比例尺= 200微米。 *,P <0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:主心外膜细胞保留他们的能力接受EMT和分化的免疫染色的心外膜外植ZO-1(A,绿色)或α微管蛋白(B,绿色)。 DAPI被用于可视化的细胞核(蓝色)。心外膜细胞分化成平滑肌细胞6天,用α平滑肌肌动蛋白(SMA)(C,红)染色。比例尺= 100微米。3993fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图3
3: 在胶原凝胶表面心外膜细胞迁移脑室从E12.5胚胎培养上的三维胶原蛋白凝胶基质和带的Alexa Fluor 488鬼笔环肽染色来可视化外膜的细胞迁移和渗透(A)中。共焦图像用于构建三维图像,以确定沿z轴(B)的细胞穿透。比例尺= 50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

这是关键的发展促进了外膜的研究,以满足在心脏发育和再生心外膜的日益重要的技术。心外膜培养体系带来显著优势心外膜的研究。

分离心外膜细胞的另一种方法是使用荧光激活细胞分选(FACS)。此方法依赖于使用心外膜标记(或荧光蛋白的外膜细胞特异性的转基因表达)的心外膜细胞从其他谱系分离。然而,越来越的证据量表明心外膜标记不是仅仅在外膜表达。例如,Tbx18在室间隔(IVS)的心肌,而Wt1的在内皮19-21表示表示。因此,心外膜细胞的分离群体的纯度是有问题的。与此相反,本文所描述的培养方法采用心外膜细胞的迁移性质dvantage。这使得心外膜细胞的高纯度的人口的隔离所示由我们的遗传标记实验。获得心外膜细胞的另一种方法将通过主要调节BMP,WNT和维甲酸信号通路是人多能干细胞(hPSCs)插入心外膜细胞的分化。这些分化的细胞酷似胚胎外膜细胞的物理和分子特性。它们不仅能够经历EMT的,但也能够分化成成纤维细胞和平滑肌细胞22,23。虽然这种方法是非常有前途的,它是显著更复杂和耗时比在本文中所描述的心外膜培养。

另外,该培养技术不需要附加的专门的设备和现有的组织培养的设置是足够的。虽然按照此协议,关键是要缴付新检索时心脏注意pecial不损害与手术工具的外膜。此外,重要的是与解剖面朝胶原凝胶或室滑动的任一表面,以便于心外膜细胞迁移来定向切除心室。最后,培养应该以最小的干扰被保持,以便允许外植体附着在培养皿。

获得的细胞群可以被用来执行多种下游实验,这将进一步提供了心外膜细胞生物学的理解。培养上腔室玻片外植体提供了各种实验,包括心外膜细胞增殖,存活,迁移,EMT和分化成心肌谱系心外膜单层。它也提供了与药物治疗相关的机会测试药物对心外膜的细胞特性的影响,以及基因表达的变化。此外,铜lturing上胶原凝胶心外膜能够使细胞在三维矩阵而不是传统的二维矩阵,其提供的体内生理学的更准确的说明进行分析。

然而,该技术的一个缺点是,该方法只能从E11.5-E12.5之间胚胎心脏用于培养心外膜细胞。在妊娠后期或新生儿期心外膜失去增殖和迁移的能力。因此,它是很难使用该培养方法,以心外膜细胞后胚胎阶段或成年小鼠隔离。

尽管有这种限制,该技术使用基本培养技能和设置,以促进心外膜细胞体外这对于心外膜和其在心脏发育和再生的作用的研究非常有利的生长。

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Acknowledgments

这项工作是由来自杜克 - 新加坡国立大学医学研究生院新加坡吴作栋基础和新加坡NRF奖学金(NRF-NRFF2016-01),以Manvendra K.辛格的资金支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Life tech invitrogen  11995065
Penicillin/streptomycin solution Life tech invitrogen  15140122
Fetal bovine serum (FBS)  Life tech invitrogen  10500064
Paraformaldehyde Sigma P6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) PeproTech 450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) PeproTech 100-21
ZO-1 antibody Life tech invitrogen  40-2200
α-Tubulin antibody Sigma T 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibody Sigma A 2547
Phalloidin antibody Life tech invitrogen  A12379
3D Collagen Culture kit  Millipore  ECM 675
8-well chamber slide Fisher Scientific NNU 154534-PK
Trizol reagent Life Technologies 15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR System Life Technologies 4453536
Superscript First Strand Synthesis kit Life Technologies 11904-018

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