Cultura in vitro de células epicárdicas De Coração embrionárias de camundongos

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Ramesh, S., Singh, A., Cibi, D. M., Hausenloy, D. J., Singh, M. K. In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart. J. Vis. Exp. (110), e53993, doi:10.3791/53993 (2016).

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Abstract

Introduction

A riqueza de dados experimentais têm mostrado que o epicárdio influencia passos críticos no desenvolvimento cardíaco. Durante o desenvolvimento, o septo transverso dá origem a um grupo de células mesoteliais conhecidos como o proepicardium 1-4. As células do proepicardium seguida, migrar e envelope do miocárdio formando o epicárdio. Depois disso, um subconjunto de células do epicárdio sofrer EMT dando origem a uma população de células derivadas migratória-epicárdio (EPDCs) que invadem posteriormente o miocárdio. Genética retroviral, bem como a linhagem rastreio experimentos demonstraram que EPDCs diferenciar em linhagens diferentes, incluindo células musculares lisas, fibroblastos, células endoteliais e cardiomiócitos (se qualquer). Portanto EPDCs contribuir significativamente para o desenvolvimento da vasculatura coronária e miocárdica arquitectura 1,2,4-9. Além disso, o epicárdio é essencial para o desenvolvimento da camada compacta do ventrículo 10-12. para example Gittenberger-Groot et ai. demonstraram que a inibição do crescimento do proepicardium leva a uma variedade de defeitos, tais como uma fina miocárdio, looping deficiente do coração e septo interventricular formação anormal e, como resultado, a letalidade embrionária 13. factores parácrinos secretadas a partir do epicárdio embrionário modular a proliferação e diferenciação de cardiomiócitos. Consistente com isto, supressão específica do epicárdio de vias de sinalização, tais como o ácido retinóico (RA), factores de crescimento de fibroblastos (FGF) e Wnt / β-catenina resultou no crescimento do miocárdio com defeito e letalidade embrionária 14-16.

Embora o epicárdio se acreditava ser de repouso em corações adultos, estudos recentes têm mostrado que o programa de desenvolvimento é reativado no epicárdio após lesão cardíaca 17,18. Após a activação, as células sofrem uma rápida proliferação e EMT que resultam na formação EPDC. Estas células exibem a capacitY para se diferenciarem em fibroblastos e células do músculo liso, mas não cardiomiócitos e células endoteliais 18. Além disso, os pró-angiogénico EPDCs segregam factores que ajuda na vascularização da área ferida e, assim, facilitar a melhoria da função cardíaca ao reduzir o tamanho do enfarte. Devido a estes resultados, o epicárdio ganhou interesse no estudo do desenvolvimento cardiovascular, doença e regeneração.

tecnologia transgênica tem revolucionado a investigação médica no século 21. Com o auxílio de tecnologias transgénicos, modelos de ratos doentes que mimetizam a condição humana metabolicamente e fisiopatologicamente ter sido desenvolvida com sucesso. No entanto, o estudo do comportamento das células do epicárdio nestes mutantes tem sido um desafio devido principalmente a letalidade embrionária precoce. Considerando o papel significativo que o epicárdio desempenha no desenvolvimento cardíaco e regeneração, nós estabelecemos um sistema de cultura in vitro para epicardia ratocélulas L. Este método permite que a cultura de longo prazo das células do epicárdio e facilita o estudo detalhado das duas propriedades importantes do epicárdio: a sua capacidade para migrar e diferenciar-se. Os ventrículos cortados do rato poderia ser cultivados em géis de colagénio que podem ser utilizados para conduzir ensaios de migração. Sendo cultivadas em uma matriz 3D que replica a matriz extracelular rica em colágeno da camada subepicárdica recapitula a na fisiologia da célula vivo melhor. Alternativamente, eles podem ser cultivadas em lâminas de câmara, a fim de estabelecer uma monocamada epicárdico que pode então ser utilizado para uma variedade de aplicações a jusante. Esta monocamada pode ser utilizado para corar para proteínas de junções apertadas, que irá proporcionar conhecimentos sobre a capacidade do epicárdio se submeter EMT que é crucial para a migração. Além disso, as experiências de diferenciação pode também ser levada a cabo sobre estas células. Além disso, o perfil de expressão do gene pode ser analisado através da extracção de ARN a partir das células erealização da reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Por último, as monocamadas também poderiam ser tratados com agentes seguido por uma análise molecular para testar potenciais agentes terapêuticos. Juntos, este sistema de cultura epicárdica nos proporciona a oportunidade de visualizar e reunir dados molecular que possibilita a compreensão sobre o desenvolvimento do epicárdio.

Outra característica desejável deste método é que é simples e não é necessária configuração elaborada. Em resumo, os embriões são colhidos em E11.5 E12.5 ou após o que o coração é excisado. Os ventrículos são então cultivadas em qualquer um gel de colagénio ou lâminas de câmara. Subsequentemente, estas células podem ser usadas para conduzir experiências jusante.

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Protocol

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use a Duke-NUS Graduate Medical School.

1. Recuperar o Embryonic ventrículos

  1. Sacrificar um rato grávida cronometrado na fase embrionária desejado (E11.5 ou E12.5), utilizando uma câmara de eutanásia com fornecimento de gás dióxido de carbono ou outro método de eutanásia aprovado.
  2. Posicione o mouse sobre as suas costas sobre uma mesa de dissecação. Desinfectar o abdômen da fêmea, com 70% de etanol. Levante a pele sobre a barriga e fazer uma pequena incisão (1-2 cm) com uma lâmina, em seguida, mantenha a pele com ambas as mãos e puxe para expor a parede abdominal.
  3. Agora cortar a parede abdominal para expor o corno uterino. Use uma pinça estéreis para levantar o corno uterino e cortar cuidadosamente os tecidos de gordura e vasos sanguíneos ligados ao corno uterino. Corte no colo do útero para recuperar o útero.
  4. Coloque o corno uterino em uma placa de petri contendo estéril frio 1x fosfato Buff Ered Saline (PBS) e lave delicadamente. Colocar a placa de petri em gelo.
  5. Utilize uma tesoura para cortar através da linha mediana da trompa uterina (oposto ao local onde a placenta está localizado) para expor os embriões que estão ainda dentro do saco vitelino e ligados a parede uterina através da placenta.
  6. Utilizando uma pinça estéril, cortado do saco vitelino embrionário para liberar o embrião.
  7. Coloque o embrião de uma nova placa de Petri contendo estéril frio 1x PBS. Decapitar o embrião e colocá-lo em suas costas. Cortado da parede torácica para expor o coração.
  8. Use uma pinça estéreis para levantar o coração e cortar os vasos em torno dele para libertar o coração da parede torácica. Preste atenção especial para não danificar o epicárdio do coração com as ferramentas cirúrgicas.
  9. Aparar a via de saída e ambos os átrios. Transferir o ventrículo a outro prato com 1x PBS frio. Coloque o prato no gelo.
  10. Repita os passos de 1,6-1,9 até que todos os ventrículos são recuperadas.
le "> 2. Cultura Explant Epicárdica

Nota: Cultura esses explantes do epicárdio, quer em lâminas de câmara de vidro ou em gel de colágeno para aplicações a jusante.

  1. Slides câmara de vidro
    1. Para preparar o meio de cultura, adicionar 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1% de penicilina / estreptomicina e 2 ng / ml de factor de crescimento de fibroblastos recombinante 2 (FGF2) para meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Executar todas as etapas da capela de fluxo laminar.
    2. Adicionar 500 ul de meio de cultura a cada poço de uma câmara de 8 poços.
    3. Colocar cada ventrículo excisado no centro de um poço. Orientar o ventrículo para manter o lado dissecados para baixo sobre a superfície do fundo do poço.
    4. Suavemente colocar a placa num banho a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultura de células.
    5. Manter a cultura com uma perturbação mínima para permitir que os explantes a aderir. A formação da monocamada epicárdio pode ser observada depois de 48-72 horas.
    6. Para a diferenciação de epicardcélulas ial em células musculares lisas, a cultura das células do epicárdio monocamada em meio de diferenciação por mais 6 dias. Para preparar os meios de diferenciação, adicionam-se 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina e 50 ng / ml de factor de crescimento de transformação recombinante beta 1 (TGF-β1) para DMEM.
    7. Alterar o meio de cultura em dias alternados.
  2. colágeno Gel
    1. Prepara-se o gel de colagénio numa placa de 96 poços utilizando um kit de cultura 3D colagénio comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
    2. Para preparar o volume desejado de gel de colagénio, misturar a quantidade apropriada de solução de colagénio com 5x de DMEM e pipeta cima e para baixo. A solução deve ficar amarelo.
    3. Adicionar um volume correspondente de solução de neutralização e misture bem imediatamente pipetando cima e para baixo. A solução vai virar rosa.
    4. Pipetar 100 ul desta mistura em cada poço de uma placa de 96 poços. Colocar a placa num banho a 37 ° C, 5% de CO2 durante 30-60 min para albaixo o gel para polimerizar.
    5. Adicionar 200 ul de meio de cultura descritas acima para cada poço.
    6. Colocar cada ventrículo excisado no centro de um poço. Orient o ventrículo para manter o lado dissecados para baixo sobre o gel de colágeno (ápice do ventrículo deve enfrentar o experimentador). Suavemente colocar a placa de volta na incubadora de cultura de células.
    7. Após 3 dias, remover os ventrículos. Colocar a placa de volta na incubadora de cultura de células durante mais 2 dias.
    8. Alterar o meio de cultura em dias alternados.

3. Fixação e Visualização

Nota: as células epicárdicas pode ser visualizado em ambos lâminas de câmara de vidro ou de gel de colagénio.

  1. Aspirar o meio de cultura e adicionar um volume igual de PBS estéril 1x para lavar as células.
  2. Adicionar apenas o suficiente paraformaldeído a 4% (PFA) para cobrir as células. Fixar as células durante 10 min a 4 ° C.
  3. Remover e lavar PFA explantes com 1x PBST (PBS 1x com0,1% de Triton X-100) para permeabilizar as células.
  4. Imunocoloração com anticorpo desejado (por exemplo, Alexa Fluor 488-faloidina; ZO-1, α-tubulina e actina de músculo liso-α) 7.

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Representative Results

Usando este protocolo cultura, as células do epicárdio primárias podem ser isolados com elevado grau de pureza para aplicações a jusante. As células cultivadas são capazes de sofrer EMT, migrar e diferenciar células do epicárdio, assim como faz in vivo.

Para determinar a pureza da nossa cultura de células do epicárdio primário, analisamos os explantes do epicárdio gerados a partir Sema3d GFPCre / +; R26 Tom / + embriões. Sema3d é expresso em células do epicárdio durante o desenvolvimento precoce cardíaca, assim as células do epicárdio derivados destes embriões será RFP marcado. Nós isolado ventrículos de Sema3d GFPCre / +; R26 Tom / + embriões para explantes do epicárdio. Depois de 48-72 h, fomos capazes de ver uma monocamada de células do epicárdio. Sobrepondo a imunofluorescência RFP e as imagens de campo claro mostrou que a maioriadas células que migraram a partir dos ventrículos são de origem epicárdica (Figura 1A - C). Nós ainda validado nossos resultados através do isolamento de ARN a partir de células do epicárdio primárias e realizando qPCR que mostrou uma forte expressão de genes específicos do epicárdio (Tbx18 e WT1), em oposição a um gene marcador de cardiomiócitos (Nkx2.5) (Figura 1C).

Em seguida, examinaram a capacidade das células de se submeter EMT através da análise da polaridade celular e o contacto célula-célula de células do epicárdio. EMT é um processo biológico que permite que uma célula epitelial a perder a sua polaridade celular e o contacto célula-célula, a fim de se transformar em uma célula mesenquimatosa migratório. O primeiro passo de EMT é a separação de contactos célula-célula. Nós imunocoradas com células do epicárdio ZO-1 (também conhecido como Tjp1, apertado proteína de junção 1) mostrou que a localização de ZO-1 para a membrana plasmática, indicando que as células têmainda submeter-se a EMT (Figura 2A). Em seguida, realizada a imunocoloração para α-tubulina (Figura 2B), de modo a observar a organização dos microtúbulos em explantes do epicárdio, que mostraram um alinhamento polarizada que facilita a migração direccional de células do epicárdio. Além disso, para determinar o potencial de diferenciação das células do epicárdio, cultivaram-se durante 6 dias num meio de diferenciação contendo recombinante de TGF-β1. A imunocoloração demonstrou SMA para a diferenciação com êxito de células do epicárdio em células de músculo liso (Figura 2C).

Por último, para analisar a migração de células derivadas do epicárdio e EMT do epicárdio, também realizado um ensaio de invasão gel de colágeno. células derivadas de epicárdio foram visualizadas por imunocoloração faloidina. Sucesso na migração de células derivadas do epicárdio pode ser vista em todo o explante (Figura 3A). Para determinar o depth de penetração celular na matriz de colágeno, 3D-reconstrução foi gerado a partir de imagens confocal. Penetração de células derivadas do epicárdio pode ser visto em z-pilhas (Figura 3B).

figura 1
. Figura 1: cultura primária de células embrionárias de rato epicárdicas corações de campo claro representativas (A) e RFP imunofluorescência (B) imagens de células do epicárdio primárias geradas a partir E12.5 Sema3d GFPCre / +; R26 tom / + corações. Imagem claro e imunofluorescência fundiu (C). Os níveis de expressão de ARNm relativos dos marcadores do epicárdio (Tbx18 e WT1) e marcador de cardiomiócitos (Nkx2.5) em células do epicárdio primárias (D). Os resultados foram normalizados para a expressão de GAPDH e do os níveis de expressão relativos são dadas como uma diferença de dobragem em comparação com a expressão Nkx2.5 (n = 3). Os dados são apresentados como a média ± DP. Barra de escala = 200 pm. *, P <0,05. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Primário células epicárdicas conservar a sua capacidade de sofrer EMT e Diferenciação imunocoloração em explantes do epicárdio para ZO-1 (A, verde) ou α-tubulina (B, verde).. DAPI foi utilizado para visualizar os núcleos (azul). Epicárdicas células foram diferenciadas em células de músculo liso durante 6 dias e coradas com actina de músculo liso-α (SMA) (C, vermelho). Barra de escala = 100 pm.3993fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. A migração celular epicárdica na superfície Collagen Gel ventrículos a partir de embriões E12.5 foram cultivadas numa matriz de gel de colagénio tridimensional e coradas com Alexa Fluor 488-faloidina para visualizar a migração de células derivadas de epicárdio e penetração (A). Imagens confocais foram usadas para construir uma imagem tridimensional para determinar a penetração de células ao longo dos eixos z (B). Barra de escala = 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

É crucial para desenvolver técnicas que facilitam o estudo do epicárdio para atender à crescente importância do epicárdio no desenvolvimento cardíaco e regeneração. O sistema de cultura do epicárdio representa vantagens significativas para a investigação do epicárdio.

Um modo alternativo para isolar as células do epicárdio é a utilização de triagem de células activadas por fluorescência (FACS). Este método baseia-se na utilização de marcadores do epicárdio (ou expressão transgénica epicárdio-específico de células de uma proteína fluorescente) para separar as células do epicárdio de outras linhagens. No entanto, uma quantidade crescente de evidências tem mostrado que os marcadores do epicárdio não são expressos exclusivamente no epicárdio. Por exemplo, Tbx18 é expresso no miocárdio do septo interventricular (IVS), enquanto WT1 é expresso no endotélio 19-21. Por isso, a pureza da população de células do epicárdio isolado é questionável. Em contraste, o método de cultura aqui descrito converte umdvantage da natureza migratória das células do epicárdio. Isto permite o isolamento de uma população altamente pura de células do epicárdio, como mostrado pelas nossas experiências de marcação genética. Outra forma para obter células do epicárdio seria a diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs) em células do epicárdio, modulando principalmente a BMP, WNT e as vias de sinalização do ácido retinóico. Estas células assemelham-se muito diferenciadas as características físicas e molecular das células do epicárdio embrionárias. Eles não são apenas capazes de sofrer EMT mas também são capazes de se diferenciar em fibroblastos e células musculares lisas 22,23. Embora este método seja muito promissor, é significativamente mais complicada e demorada do que a cultura do epicárdio descrito no presente documento.

Além disso, esta técnica de cultura não necessita de equipamento especializado adicional e uma configuração existente de cultura de tecidos é suficiente. Ao seguir este protocolo, é crucial para pagar satenção pecial para não danificar o epicárdio com ferramentas cirúrgicas ao recuperar o coração. Além disso, é fundamental para orientar o ventrículo excisado com o lado voltado para dissecados quer a superfície do gel de colagénio ou corrediça câmara, a fim de facilitar a migração de células do epicárdio. Por último, a cultura deve ser mantida com uma perturbação mínima, de modo a permitir que o explante para aderir à placa de cultura.

A população de células obtida pode então ser usada para executar uma variedade de experiências de jusante que vai ainda mais a nossa compreensão da biologia das células do epicárdio. A cultura dos explantes em lâminas de câmaras fornece monocamadas epicárdio para vários ensaios, incluindo a proliferação de células do epicárdio, sobrevivência, migração, EMT e diferenciação em linhagens cardíacas. Ele também fornece uma oportunidade de testar o efeito da droga sobre as propriedades celulares do epicárdio, assim como alterações de expressão de genes associados com o tratamento da droga. Além disso, Culturing o epicárdio em géis de colagénio permite a análise das células numa matriz 3D, em vez da matriz 2D tradicional, que proporciona uma ilustração mais precisa da fisiologia in vivo.

No entanto, uma desvantagem desta técnica seria a de que este método apenas pode ser utilizado para cultura de células do epicárdio do coração embrionárias entre E11.5-E12.5. Durante a gestação mais tarde ou no período neonatal do epicárdio perde a capacidade de proliferar e migrar. Assim, é difícil usar este método de cultura para isolar células do epicárdio de estágios embrionários posteriores ou camundongos adultos.

Apesar desta limitação, esta técnica utiliza capacidades de cultura de base e de configuração para facilitar o crescimento das células do epicárdio ex vivo que seria muito benéfico para o estudo do epicárdio e os seus papéis no desenvolvimento e regeneração cardíaca.

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Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por fundos de Duke-NUS Graduate Medical School Singapura, Goh fundação e Singapura NRF comunhão (NRF-NRFF2016-01) para Manvendra K. Singh.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Life tech invitrogen  11995065
Penicillin/streptomycin solution Life tech invitrogen  15140122
Fetal bovine serum (FBS)  Life tech invitrogen  10500064
Paraformaldehyde Sigma P6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) PeproTech 450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) PeproTech 100-21
ZO-1 antibody Life tech invitrogen  40-2200
α-Tubulin antibody Sigma T 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibody Sigma A 2547
Phalloidin antibody Life tech invitrogen  A12379
3D Collagen Culture kit  Millipore  ECM 675
8-well chamber slide Fisher Scientific NNU 154534-PK
Trizol reagent Life Technologies 15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR System Life Technologies 4453536
Superscript First Strand Synthesis kit Life Technologies 11904-018

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References

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