Fare Embriyonik From The Heart Epikardiyal Hücrelerinin Vitro Kültür

* These authors contributed equally
Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ramesh, S., Singh, A., Cibi, D. M., Hausenloy, D. J., Singh, M. K. In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart. J. Vis. Exp. (110), e53993, doi:10.3791/53993 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Deneysel verilerin bir servet epicardium kalp gelişiminde kritik adımlar etkilediğini gösterdik. Gelişimi sırasında, septum transversum proepicardium 1-4 şekilde bilinmektedir mezotelyal hücrelerinin bir yığın yol açar. proepicardium gelen hücreler, göç ve endokard oluşturucu miyokard zarf. Bunu takiben, epikardiyal hücrelerinin bir alt, daha sonra miyokard işgal epikardiyum türetilmiş hücreler (EPDCs) içindeki bir göç popülasyonuna EMT veren yükselmesine uğrar. Deney izleme genetik olarak retroviral nesilli EPDCs düz kas hücreleri, fibroblastlar, endotel hücreleri ve kardiyomiyositlerde (eğer varsa) dahil olmak üzere çeşitli soy ayırt olduğunu göstermiştir. Bu nedenle EPDCs koroner damar sistemi ve miyokard mimarisinin 1,2,4-9 gelişmesine önemli katkı sağlamaktadır. Ayrıca, epikardiyum ventriküler yoğun tabakaya 10-12 gelişimi için gereklidir. example Gittenberger-de Groot ve ark., proepicardium aşırı büyümesini inhibe etmek, örneğin ince bir miyokard, kalp ve anormal septum oluşumu eksikliği döngü gibi bir sonucu olarak, embriyo ölümüne 13 gibi kusurları bir dizi yol açtığı gösterilmiştir. embriyonik epicardium salgılanan parakrin faktörler kardiyomiyosit çoğalmasını ve farklılaşmasını modüle. Buna uygun olarak, bu tür retinoik asit (RA), fibroblast büyüme faktörleri (FGFs) ve Wnt / β-katenin olarak sinyal yollarının epikardiyum özgü silinmesi bozuk miyokardiyal büyüme ve embriyonik öldürücülüğü 14-16 sonuçlandı.

Epicardium yetişkin kalpte sessiz olduğuna inanılan olmasına rağmen, son yıllarda yapılan çalışmalarda gelişimsel bir program kardiyak hasar 17,18 aşağıdaki epicardium olarak yeniden olduğunu göstermiştir. aktivasyonu üzerine, hücreler EPDC oluşumuna neden hızla çoğalması ve EMT geçer. Bu hücreler capacit sergileyenY, fibroblast ve düz kas hücrelerinin değil kardiyomiyositlerde ve endotel hücreleri 18 ayırt etmek. Buna ek olarak, EPDCs yaralı bölgenin damarlanma yardım ve böylece enfarktüs boyutunu azaltarak gelişmiş kardiyak fonksiyonu kolaylaştıran proanjiyogenik faktörler salgılar. Nedeniyle bu bulgulara, epicardium kardiyovasküler geliştirme, hastalık ve yenilenme çalışmasında ilgi kazanmıştır.

Transgenik teknoloji 21. yüzyılda tıbbi araştırma devrim yarattı. Transgenik teknolojilerin yardımıyla, metabolik ve patofizyolojik insan durumunu taklit eden hastalıklı fare modelleri başarıyla geliştirilmiştir. Ancak, bu mutantlar epikardiyal hücre davranışını okuyan erken embriyonik öldürücülüğü kaynaklanmaktadır bir meydan okuma olmuştur. Epicardium kalp gelişim ve yenilenme oynadığı önemli rol göz önüne alındığında, biz fare epicardia için bir in vitro kültür sistemi kurdukL hücreleri. Bu yöntem, epikardiyal hücrelerin uzun süreli kültür sağlar ve endokard iki önemli özelliklerinin detaylı bir çalışma kolaylaştırır: göç eder ve ayırt etme yeteneği. fare eksize ventriküller geçiş deneyleri yürütmek için kullanılabilir kollajen jel üzerinde kültürlenebilir olabilir. Daha subepikardiyal tabakanın kollajen zengin hücre dışı matrisi çoğaltır, in vivo hücre fizyolojisi tekrarlar 3B matris içinde kültüre edildikten. Alternatif olarak daha sonra aşağı doğru çeşitli uygulamalar için kullanılabilir epikardiyal tek tabaka oluşturmak amacıyla oda slaytlar üzerinde kültürlenebilir. Bu tek-katmanın taşıma için çok önemlidir EMT geçmesi epikardiyumun yeteneği hakkında bilgiler sağlayacaktır sıkı bağlantı proteinleri için leke kullanılabilir. Buna ek olarak, farklılaşma deneyler de bu hücrelerde gerçekleştirilebilir. Bundan başka, gen ekspresyon profili hücrelerinden RNA ekstrakte ile analiz edilebilir vekantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) gerçekleştirmek. Son olarak, tek tabakalar, aynı zamanda potansiyel terapötikler test etmek için bir moleküler analiz, ardından maddelerle tedavi edilebilir. Birlikte koymak, bu epikardiyal kültür sistemi görselleştirmek ve epikardiyal gelişimi hakkında anlayışımızı furthers moleküler veri toplamak için fırsat sağlıyor.

Bu yöntemin diğer bir istenen özelliği, basittir ve herhangi karmaşık ayar gerekli olmasıdır. Kısaca, embriyolar kalp eksize E11.5 veya E12.5 aşağıda hasat edilir. ventriküller sonra kollajen jel veya oda slaytlar ya üzerinde yetiştirilmiştir. Daha sonra, bu hücreler, aşağı doğru deneyler kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneyler Duke-NUS Lisans Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1. Embriyonik karıncıklar alınıyor

  1. karbondioksit gaz temini veya başka bir onaylanmış ötenazi yöntemi ile bir ötenazi odasını kullanarak istenen embriyonik aşamada (E11.5 veya E12.5) bir zaman aşımına hamile fare Kurban.
  2. diseksiyon masaya sırtında fare yerleştirin. % 70 etanol ile kadın karın dezenfekte edin. karın üzerindeki deriyi kaldırın ve bir bıçak ile küçük bir kesi (1-2 cm) yapmak, sonra iki elinizle cildinizi tutun ve karın duvarı açığa çıkarmak için uzağa çekin.
  3. Şimdi uterin boynuz maruz karın duvarı kesti. uterin horn yukarı kaldırmak için steril forseps kullanın ve dikkatli uterin boynuz bağlı yağ doku ve kan damarları kesip. serviks kesilmiş uterusu almak için.
  4. Steril soğuk 1x Fosfat Buff içeren bir petri uterin horn koyun Ered tuz (PBS) ve yavaşça çalkalayın. Buz üzerinde petri yerleştirin.
  5. yumurta sarısının içinde hala ve plasenta yoluyla rahim duvarına bağlı embriyolar maruz (ters plasenta bulunduğu siteye) uterin horn orta hat boyunca kesmek için makas kullanın.
  6. Steril forseps kullanarak, embriyo serbest embriyonik yolk sac açık kesti.
  7. Steril soğuk 1x PBS içeren yeni bir petri embriyo yerleştirin. embriyo başını kesmek ve sırtında üzerine yerleştirin. kalp maruz göğüs duvarı açık kesti.
  8. kalbi kaldırın ve göğüs duvarından kalbini kurtarmak için onun etrafında damarları kesip steril forseps kullanabilir. cerrahi aletler ile kalbin epikardiyumu zarar vermemek için özen gösterin.
  9. çıkış yolunu hem atriyumları keserek. Soğuk 1x PBS ile başka bir çanak ventrikül aktarın. Buz üzerinde çanak yerleştirin.
  10. Tekrarlayın tüm karıncık alınır kadar 1.6-1.9 adımları.
le "> 2. Epikardiyal Eksplantasyon Kültür

Not: Kültür cam haznesi slaytlar üzerinde ya da alt uygulamalar için kollajen jel üzerinde ya bu epikardiyal eksplantlar.

  1. Cam Odası Slaytlar
    1. Kültür ortamı hazırlamak Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM)% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 penisilin / streptomisin ve 2 ng / ml yeniden birleştirici fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2) ekleyin. laminer akış kaputu tüm adımları uygulayın.
    2. 8 oyuklu bölmenin her bir kuyu için 500 ul kültür ortamı eklenir.
    3. Bir kuyunun merkezinde her eksize ventrikül yerleştirin. iyi alt yüzeyinde aşağı disseke tarafı tutmak için ventrikül yönlendirmek.
    4. Yavaşça 37 ° C,% 5 CO2, hücre kültürü inkübatöründe plaka koydu.
    5. eksplantlar uymak için izin minimum rahatsızlık kültürünü korumak. Epikardiyal tek tabaka oluşumu 48-72 saat sonra gözlenebilir.
    6. epicard ayrımındadüz kas hücreleri, kültür bir 6 gün farklılaşma medya epikardiyal tek tabakalı hücreler içine ial hücreleri. Farklılaşma ortam hazırlamak DMEM,% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve 50 ng / ml yeniden birleştirici transforme edici büyüme faktörü beta 1 (TGF-β1) ekleyin.
    7. diğer günlerde kültür ortamı değiştirin.
  2. kollajen jel
    1. imalatçının protokolüne göre, ticari bir 3 boyutlu Kollajen Kültür kiti kullanılarak bir 96-çukurlu plaka içinde kollajen jel hazırlayın.
    2. kollajen jel istenilen hacmi hazırlamak için, DMEM 5x ve pipet yukarı ve aşağı kollajen çözüm uygun miktarda karıştırın. Çözelti sarı dönmelidir.
    3. nötralizasyon solüsyonu gelen hacim ekleme ve yukarı ve aşağı pipetleme iyice hemen karıştırın. Çözelti pembe dönecek.
    4. Pipet, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, bu karışımın 100 ul. Al, 30-60 dakika boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde plakasınıdüşük jel polimerize etmek.
    5. Her bir oyuğa, yukarıda tarif edilen kültür ortamı 200 ul ekle.
    6. Bir kuyunun merkezinde her eksize ventrikül yerleştirin. Orient ventrikül (deneyci bakmalıdır ventrikül apeks) kollajen jel üzerinde disseke tarafı tutmak için. Yavaşça geri hücre kültürü inkübatör plaka koymak.
    7. 3 gün sonra, ventriküllere kaldırın. başka bir 2 gün hücre kültürü kuvöz içine geri plaka koyun.
    8. diğer günlerde kültür ortamı değiştirin.

3. Fiksasyon ve Görselleştirme

Not: Epikardiyal hücreler cam haznesi slaytlar veya kollajen jel ya da üzerinde görülebilir.

  1. kültür ortamı üzerinden aspire ve hücreleri yıkamak için steril 1x PBS eşit hacimde ekleyin.
  2. hücreleri kaplamak için yeterli miktarda% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca hücreler sabitleyin.
  3. PFA çıkarın ve 1x PBST (1x PBS ile eksplantlar yıkayın% 0.1 Triton X-100) hücreleri geçirgenliği.
  4. İstenen antikor (örneğin, Alexa Fluor 488-falloidin, ZO-1, α-tubulin α-düz kas aktini) ile immunostain 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu kültürün protokolü kullanılarak, primer epikardiyal hücreleri alt uygulamalar için yüksek saflıkta izole edilebilir. Kültürlü hücreler, EMT tabi göç ve epikardiyal hücreleri in vivo olduğu gibi ayırt edebiliyoruz.

Birincil epikardiyal hücre kültürünün saflığını belirlemek için, Sema3d GFPCre / + elde epikardiyal eksplantlar analiz R26 Tom / + embriyolar. Sema3d böylece, erken kalp gelişimi sırasında epikardiyal hücrelerde RFP etiketli olacak bu embriyolardan elde edilen epikardiyal hücreleri ifade edilir. Epikardiyal eksplantlar için R26 Tom / + embriyolar, biz Sema3d GFPCre / + 'dan ventriküllere izole edilmiştir. 48-72 saat sonra, biz epikardiyal hücre tek tabaka görmek mümkün. RFP immünofloresan ve aydınlık görüntüleri atma çoğunluğu olduğunu gösterdiventriküllerden göç hücrelerin epikardiyal kökenli (- C Şekil 1A) bulunmaktadır. Biz ayrıca, birinci epikardiyal hücrelerden RNA izole etmek ve kardiyomiyosit bir işaretleyici gen (Nkx2.5) (Şekil 1C) karşı epikardiyal özgü genler (Tbx18 ve WT1) güçlü bir ifade gösterdi qPCR gerçekleştirerek eden sonuçlar doğrulandı.

Daha sonra epikardiyal hücrelerin hücre polaritesi ve hücre-hücre teması analiz ederek EMT geçmesi hücrelerinin yeteneği araştırıldı. EMT bir epitel hücre bir göçmen mezenkimal hücre içine dönüştürmek için kendi hücre polarite ve hücre-hücre temas kaybetmek sağlayan bir biyolojik süreçtir. EMT ilk adımı hücre-hücre temas ayrılması olduğunu. Biz hücrelerin sahip olduğunu belirten plazma zarı ZO-1 lokalizasyonu gösterdi (aynı zamanda Tjp1 olarak da bilinen, Sıkı kavşak protein 1) ZO-1 ile epikardiyal hücreleri immunohistokimyasalİşte EMT (Şekil 2A) geçmesi. Sonraki biz epikardiyal hücrelerin yönlü göç kolaylaştıran bir polarize uyum gösterdi epikardiyal eksplant mikrotübüllerin, organizasyonunu gözlemlemek amacıyla α-tubulin (Şekil 2B) için immün yapıldı. Buna ek olarak, epikardiyal hücrelerinin farklılaşma potansiyelini belirlemek için, yeniden birleştirici TGF-ß1 ihtiva eden bir farklılaşma medya 6 gün süreyle kültürlendi. SMA immün düz kas hücreleri (Şekil 2C) doğru epikardiyal hücrelerinin başarılı bir şekilde ayrılmasına gösterdi.

Son olarak, epicardium-kaynaklı hücre göçü ve epikardiyal EMT analiz etmek, biz de bir kollajen jel işgali testi uygulandı. Epikardiyum türetilmiş hücreler immün phalloidin ile görselleştirilmiştir. Epikardiyum türevli hücrelerin geçiş başarılı eksplant (Şekil 3A) etrafında görülebilir. d belirlemekkollajen matrisi içine, hücre penetrasyon epth, 3D-yeniden konfokal görüntüler elde edilmiştir. Epikardiyum türetilmiş hücre penetrasyonu z yığınlarının (Şekil 3B) görülebilir.

Şekil 1
. Şekil 1: Embriyonik Fare Kalpler gelen Epikardiyal Hücreleri İlköğretim Kültür Temsilcisi aydınlık (A) ve RFP immünfloresans (B) E12.5 Sema3d GFPCre / + üretilen birincil epikardiyal hücrelerin görüntüleri; R26 Tom / + kalpleri. Birleştirilmiş aydınlık ve immünfloresans görüntü (C). Epikardiyal işaretleri (Tbx18 ve WT1) ve primer epikardiyal hücreleri (D) kardiyomiyosit işaretleyici (Nkx2.5) rölatif mRNA ekspresyon seviyeleri. Sonuçlar GAPDH ifade normalize edildi ve göreli ekspresyon seviyeleri Nkx2.5 ekspresyonu kıyasla kat fark olarak verilmiştir (N = 3). Veri ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Ölçek çubuğu = 200 mikron. * P <0.05. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2:. Primer Epikardiyal Hücreler (yeşil, B) ZO-1 (A, yeşil) ya da α-tubulin için epikardiyal eksplantlar EMT ve Farklılaşma immün boyanma Maruz onların yeteneği saklayın. DAPI çekirdekleri (mavi) görselleştirmek için kullanılmıştır. Epikardiyal hücreleri 6 gün süreyle, düz kas hücrelerinin ayrışmıştır ve α-düz kas aktini (SMA) (kırmızı Cı) ile boyanmıştır. Ölçek çubuğu = 100 mikron.3993fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3:. Kollajen jel yüzeyi üzerindeki Epikardiyal hücre gücü E12.5 embriyolar Karıncıklar üç boyutlu bir kollajen jel matrisi üzerinde kültürlendi ve epikardiyum türetilmiş hücre göçünü ve penetrasyon (A) görselleştirmek için Alexa Fluor 488-falloidinle boyandı. Konfokal görüntüler Z-eksenleri (B) boyunca, hücre penetrasyonunu belirlemek için üç boyutlu bir görüntü oluşturmak için kullanıldı. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kalp gelişme ve rejenerasyon epikarda artan önemi hitap epikardiyumun çalışma kolaylaştıran teknikleri geliştirmek için kilit önem taşımaktadır. epikardiyal kültür sistemi epikardiyal araştırma için önemli avantajlar getirmektedir.

Epikardiyal hücreleri izole etmek için alternatif bir yol floresans ile aktive edilen hücre tasnif (FACS) kullanmaktır. Bu yöntem, diğer soylarından epikardiyal hücreleri ayırmak için epikardiyal belirteçleri (veya floresan protein epikardiyum hücreye spesifik transgenik ekspresyonu) kullanımına dayanır. Ancak, kanıt artan miktarda epikardiyal belirteçler sadece epicardium ifade olmadığını göstermiştir. WT1 endotel 19-21 ifade edilir Örneğin, Tbx18 interventriküler septum (IVS) ve miyokard olarak ifade edilir. Bu nedenle izole edilmiş, epikardiyal hücre popülasyonunun saflığı sorgulanabilir. Bunun aksine, bu tarifnamede tarif edilen kültür yöntemi alırepikardiyal hücrelerin göç doğası dvantage. genetik etiketleme deneyleri ile gösterildiği gibi bu epikardiyal hücreler yüksek ölçüde saf bir nüfus izolasyonunu sağlar. epikardiyal hücreleri elde etmek için başka bir yolu öncelikle BMP, Wnt ve retinoik asit sinyal yolları modüle ederek epikardiyal hücrelerine insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) farklılaşması olacaktır. Bu farklılaşmış hücreler yakından embriyonik epikardiyal hücrelerin fiziksel ve moleküler özelliklerini andırır. Bunlar sadece EMT geçmesi mümkün değil, aynı zamanda fibroblastlar ve düz kas hücreleri 22,23 ayırt etmek mümkün bulunmaktadır. Bu yöntem çok umut verici olsa da, önemli ölçüde daha karmaşık ve zaman bu yazıda anlatılan epikardiyal kültürden daha alıcıdır.

Buna ek olarak, bu kültür tekniği ek özel ekipman gerektirmez ve varolan doku kültürü kurulumu yeterlidir. Bu protokol iken, s ödemek için çok önemlidirkalbi alırken pecial dikkat cerrahi aletler ile epikardiyumu zarar vermeyecek. Buna ek olarak, parçalara bir yan epikardiyal hücre göçü kolaylaştırmak için kollajen jel veya oda sürgünün yüzeyi ya bakacak şekilde eksize ventrikül yönlendirilmesi için çok önemlidir. eksplant kültür tabağına yapışma sağlamak üzere Son olarak, kültür az rahatsızlık ile muhafaza edilmelidir.

Elde edilen hücreler popülasyonu daha sonra epikardiyal hücre biyolojisi anlayışımızı ilerletmek olacak mansap deneyler çeşitli gerçekleştirmek için kullanılabilir. odacıklı slaytlar üzerinde eksplantlarm kardiyak soy içine epikardiyal hücre çoğalmasını, hayatta kalma, göç, EMT ve farklılaşma gibi çeşitli deneyler için epikardiyal mono tabakaları sağlar. Aynı zamanda ilaç tedavisi ile ilişkili bir epikardiyumun hücresel özellikleri üzerinde ilaçların etkisini test etmek için fırsat yanı sıra gen ifadesi değişikliklerini sağlar. Buna ek olarak, Cukollajen jel üzerinde epikardiyumu lturing 3B matris yerine in vivo fizyolojisi hakkında daha doğru bir çizimini vermektedir geleneksel 2D matris, hücreler analiz edilmesini sağlar.

Bununla birlikte, bu tekniğin bir dezavantajı, bu yöntem, sadece E11.5-E12.5 arasındaki embriyonik kalplerinden kültür epikardiyal hücreleri için kullanılabilir olacaktır. Daha sonra gebelik sırasında ya da yenidoğan döneminde epicardium çoğalırlar ve göç yeteneğini kaybeder. Böylece daha sonraki evrelerinde veya yetişkin farelerin epikardiyal hücreleri izole etmek için bu kültür yöntemi kullanmak zordur.

Bu sınırlamaya rağmen, bu tekniğin epikardiyumun ve kardiyak gelişim ve yenilenme onun rolleri çalışma için çok faydalı olacağını epikardiyal hücrelerin ex vivo büyümesini kolaylaştırmak için temel kültür beceri ve kurulum kullanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Bu çalışma DUKE-NUS Lisans Tıp Fakültesi Singapur, Manvendra K. Singh Goh vakıf ve Singapur NRF bursu (NRF-NRFF2016-01) fon tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Life tech invitrogen  11995065
Penicillin/streptomycin solution Life tech invitrogen  15140122
Fetal bovine serum (FBS)  Life tech invitrogen  10500064
Paraformaldehyde Sigma P6148-5KG
Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) PeproTech 450-33
Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) PeproTech 100-21
ZO-1 antibody Life tech invitrogen  40-2200
α-Tubulin antibody Sigma T 6074
α-smooth muscle actin (SMA) antibody Sigma A 2547
Phalloidin antibody Life tech invitrogen  A12379
3D Collagen Culture kit  Millipore  ECM 675
8-well chamber slide Fisher Scientific NNU 154534-PK
Trizol reagent Life Technologies 15596-018
ViiA 7 Real-Time PCR System Life Technologies 4453536
Superscript First Strand Synthesis kit Life Technologies 11904-018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mikawa, T., Fischman, D. A. Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).
  2. Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
  3. Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D., Munoz-Chapuli, R. The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review. Cells Tissues Organs. 169, 89-103 (2001).
  4. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
  5. von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
  6. Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
  7. Singh, M. K., Lu, M. M., Massera, D., Epstein, J. A. MicroRNA-processing enzyme Dicer is required in epicardium for coronary vasculature development. J Biol Chem. 286, 41036-41045 (2011).
  8. Degenhardt, K., Singh, M. K., Epstein, J. A. New approaches under development: cardiovascular embryology applied to heart disease. J Clin Invest. 123, 71-74 (2013).
  9. Singh, M. K., Epstein, J. A. Epicardium-derived cardiac mesenchymal stem cells: expanding the outer limit of heart repair. Circ Res. 110, 904-906 (2012).
  10. Manner, J. Experimental study on the formation of the epicardium in chick embryos. Anat Embryol (Berl). 187, 281-289 (1993).
  11. Manner, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Dev Dyn. 233, 1454-1463 (2005).
  12. Pennisi, D. J., Ballard, V. L., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Dev Dyn. 228, 161-172 (2003).
  13. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Bergwerff, M., Mentink, M. M., Poelmann, R. E. Epicardial outgrowth inhibition leads to compensatory mesothelial outflow tract collar and abnormal cardiac septation and coronary formation. Circ Res. 87, 969-971 (2000).
  14. Lavine, K. J., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
  15. Merki, E., et al. Epicardial retinoid X receptor alpha is required for myocardial growth and coronary artery formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18455-18460 (2005).
  16. Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev Biol. 255, 334-349 (2003).
  17. Huang, G. N., et al. C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury. Science. 338, 1599-1603 (2012).
  18. Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
  19. Christoffels, V. M., et al. Tbx18 and the fate of epicardial progenitors. Nature. 458, 8-9 (2009).
  20. Rudat, C., Kispert, A. Wt1 and epicardial fate mapping. Circ Res. 111, 165-169 (2012).
  21. Duim, S. N., Kurakula, K., Goumans, M. J., Kruithof, B. P. Cardiac endothelial cells express Wilms' tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarcted heart. J Mol Cell Cardiol. 81, 127-135 (2015).
  22. Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
  23. Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics