Usando Caenorhabditis elegans para estudar trans-e multi-Generational efeitos de toxicants

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Summary

Os efeitos trans e multigeracionais dos produtos químicos persistentes são essenciais para julgar as suas consequências a longo prazo no ambiente e na saúde humana. Nós fornecemos métodos detalhados novos para estudar efeitos trans e multi-Generational usando elegans da Caenorhabditisdo nematóide da livre-vida.

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Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z., Yin, D. Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants. J. Vis. Exp. (149), e59367, doi:10.3791/59367 (2019).

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Abstract

Informações sobre toxicidades de produtos químicos são essenciais na sua aplicação e gestão de resíduos. Para os produtos químicos em baixas concentrações, os efeitos a longo prazo são muito importantes para julgar as suas consequências no ambiente e na saúde humana. Ao demonstrar influências de longo prazo, os efeitos dos produtos químicos ao longo das gerações em estudos recentes fornecem novas percepções. Aqui, nós descrevemos protocolos para estudar efeitos dos produtos químicos sobre gerações múltiplas usando elegans da Caenorhabditisdo nematóide da livre-vida. Dois aspectos são apresentados: (1) estudos de efeito trans-geracional (TG) e (2) multigeracional, sendo este último separado para estudos de exposição multigeracional (MGE) e de efeito multigeracional residual (MGR). O estudo do efeito TG é robusto com um objetivo simples de determinar se a exposição química aos pais pode resultar em quaisquer consequências residuais na descendência. Após os efeitos são medidos sobre os pais, soluções de hipoclorito de sódio são usados para matar os pais e manter a prole de modo a facilitar a medição de efeito sobre a prole. O estudo do efeito TG é usado para determinar se a prole é afetada quando seu pai é exposto aos poluentes. O estudo do efeito MGE e MGR é sistematical usado para determinar se a exposição geracional contínua pode resultar em respostas adaptativas na prole ao longo das gerações. O pick-up e a transferência cuidadosos são usados para distinguir gerações para facilitar a medida do efeito em cada geração. Nós igualmente combinamos protocolos para medir mudanças do comportamento da locomoção, da reprodução, do tempo, as bioquímicas e da expressão genética. Alguns exemplos de experimentos também são apresentados para ilustrar os estudos de efeito trans e multigeracional.

Introduction

A aplicação e gestão de resíduos de produtos químicos é altamente dependente da informação dos seus efeitos em determinadas concentrações. Notavelmente, o tempo é outro elemento essencial entre efeitos e concentrações. Ou seja, produtos químicos, especialmente aqueles em baixas concentrações nos ambientes reais, precisam de tempo para provocar efeitos mensuráveis1. Portanto, os pesquisadores organizam diferentes comprimentos da duração da exposição em experimentos com animais, e até mesmo cobrem todo o ciclo de vida. Por exemplo, camundongos foram expostos à nicotina por 30, 90 ou 180 dias para estudar seus efeitos tóxicos 2. No entanto, tais durações de exposição ainda não são suficientes para elucidar os efeitos a longo prazo dos poluentes (por exemplo, poluentes orgânicos persistentes [POPs]) que podem durar mais de gerações de organismos no ambiente. Portanto, estudos sobre os efeitos sobre as gerações estão ganhando mais e mais atenção.

Existem dois aspectos principais nos estudos de efeito geracional. O primeiro é o estudo de efeito trans-geracional (TG) que pode testar de forma robusta se a exposição química aos pais pode resultar em quaisquer consequências na descendência3. O segundo é um estudo de efeito multigeracional que é mais sistemático com considerações tanto na exposição quanto nos efeitos residuais. Por um lado, os efeitos da exposição multigeracional (MGE) são usados para ilustrar as respostas adaptativas nos animais aos ambientes desafiadores de longo prazo. Por outro lado, os efeitos residuais multigeracionais (MGR) são utilizados para demonstrar as consequências residuais a longo prazo após a exposição, uma vez que a exposição materna é acompanhada com exposição embrionária à primeira prole e exposição da linha germinal à segunda descendência que torna a terceira descendência como a primeira geração completamente fora da exposição4.

Embora os mamíferos (por exemplo, camundongos) sejam organismos modelo em estudos de toxicidade, especialmente em relação aos seres humanos, sua aplicação no estudo de efeitos geracionais é bastante demorada, cara e eticamente a respeito de 5. Assim, os organismos, incluindo o crustásio Daphnia magna6, o inseto Drosophila melanogaster7 e o zebrafish Danio rerio8, proporcionam opções alternativas. No entanto, esses organismos ou falta de semelhanças com os seres humanos, ou necessitam de equipamentos específicos em estudos.

A Caenorhabditis elegans é um pequeno nematódeo de vida livre (aproximadamente 1 mm de comprimento) com um ciclo de duração curto (aproximadamente 84 h a 20 ° c)9. Este nematódeo compartilha muitas vias biológicas conservadoras para os seres humanos, e, portanto, tem sido amplamente empregado para ilustrar os efeitos de várias tensões ou tóxicos10. Notavelmente, 99,5% dos nematoides são hermafroditas, tornando esses organismos extremamente adequados para o estudo de efeitos geracionais, por exemplo, efeitos de TG de metais pesados e sulfonamidas3,11, efeitos de MGE de nanopartículas de ouro e pesados metais12 e temperatura13, Mgr efeitos da sulfonamida14, e ambos os efeitos MGE e Mgr da irradiação gama15 e lindano4. Além disso, foram encontrados resultados comparáveis entre os efeitos dos produtos químicos (por exemplo, zearalenona) no desenvolvimento e reprodução de camundongos e C. elegans16,17, o que proporcionaria uma vantagem para extrapolar efeitos deste pequeno animal para os seres humanos.

Ambos os estudos de efeito TG e MG são demorados e precisam de um design cuidadoso e desempenho. Notavelmente, existiam diferenças nas escolhas de estágio de vida, condições de exposição e métodos de separação de gerações nos estudos supracitados. Tais diferenças dificultaram a comparação direta entre os resultados e dificultaram a interpretação dos resultados. Portanto, é imperativo estabelecer protocolos uniformes para orientar os estudos de efeitos de TG e MG, e também para fornecer um quadro maior para revelar padrões semelhantes de vários tóxicos ou poluentes em conseqüências a longo prazo. O objetivo mais longo dos protocolos atuais demonstrará processos claros de operação no estudo de efeitos trans e multigeracionais com C. elegans. Os protocolos beneficiarão os pesquisadores que estão interessados em estudar os efeitos a longo prazo de tóxicos ou poluentes.

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Protocol

1. cultura E. coli OP50

  1. Prepare 1 M de solução de hidróxido de sódio dissolvendo 4 g de hidróxido de sódio em 100 mL de água.
  2. Prepare o meio de caldo de lisogenia (LB) dissolvendo 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura e 10 g de cloreto de sódio com 1 L de água ultrapura em um balão cônico de 1 L. Ajuste o pH para 7,0 com solução de hidróxido de sódio a 1 M.
  3. Aliquot o meio líquido LB da etapa 1.2 em 20 frascos cônicos (volume máximo admissível: 100 mL) com meio 50 mL em cada um. Cubra as garrafas cônicas com papel Kraft.
  4. Esterilizar o meio líquido LB a 121 ° c e 0,105 MPa durante 20 min. fixe o meio LB até à temperatura ambiente.
  5. Pipetar 200 μl das suspensões bacterianas (ver passo 1,8) ou escolher uma pequena Colónia a partir de ágares (no passo 2,14) utilizando um ciclo de inocular, coloque-o no meio lb.
  6. Incubar o meio LB com agitação a 150 rpm a 37 ° c por 24-48 h. O meio LB mudará de um líquido transparente marrom para suspensão turva de cor cáqui.
  7. Use as suspensões bacterianas de 80% dos frascos totais para fornecer E. coli OP50 como o alimento do nematoide a ser usado na etapa 2,11.
  8. Guarde o resto das garrafas contendo as suspensões bacterianas num frigorífico a 4 ° c. Pipetar 200 μL das suspensões LB para o lado superior do meio de LB fresco (passo 1,4) e repita o passo 1.6 para incubação subsequente.

2. cultura C. elegans

Observação: cultura C. elegans usando como por etapas 2,1 a 2,11 com base em métodos padrão18.

  1. Dissolver 22,8 g de K2HPO4• 3h2O em 100 ml de água destilada estéril.
  2. Dissolver 6,8 g de KH2po4 em 50 ml de água destilada estéril.
  3. Misture as soluções das etapas 2,1 e 2,2, para preparar 1 M K2HPO4-KH2po4 tampão (pH 6,0, 150 ml no total).
  4. Prepare 1,0 M MgSO4 dissolvendo 1,232 g de MgSO4• 7h2o em 5 ml de água destilada estéril, e esterilize-o filtrando a solução através de um filtro de membrana descartável estéril de 0,22 μm em um recipiente estéril.
  5. Prepare 1 M de CaCl2 dissolvendo 0,554 g de CAcl2 em 5 ml de água destilada estéril e esterilize-o filtrando as soluções através de um filtro de membrana descartável estéril de 0,22 μm em um recipiente estéril.
  6. Prepare 1 M de solução de colesterol dissolvendo 0, 25 g de colesterol em 5 mL de etanol absoluto e esterilize-o filtrando a solução através de um filtro de membrana descartável estéril de 0,22 μm em um recipiente estéril.
  7. Prepare o agar de meio de crescimento de nematoides (NGM) adicionando 17 g de pó de ágar, 2,5 g de peptona e 3 g de cloreto de sódio a um balão cônico de 1 L contendo 1 L de água ultrapura. Adicionar 25 mL de K2HPO4-KH2po4 solução a partir do passo 2,3.
  8. Esterilizar o agar NGM da etapa 2,7 a 121 ° c com 0,105 MPa por 20 min.
  9. Fixe o agar NGM a cerca de 50 ° c, adicione 1 mL de solução de 1 M MgSO4, 1 m CAcl2e 5 mg/ml de colesterol-etanol das etapas 2,4 a 2,6 no meio e misture-as completamente.
  10. Despeje ~ 10 mL de agar NGM médio por prato em 100 placas de Petri estéreis (6,0 cm de diâmetro). Fixe o meio nas placas de Petri à temperatura ambiente para formar agar sólido.
  11. Pipete 170 μL das suspensões bacterianas da etapa 1,7 para o agar NGM acima mencionado usando uma ponta estéril. Agite ligeiramente o agar NGM para distribuir o meio LB uniformemente sobre a superfície de agar NGM.
  12. Inocular o agar NGM com o lado superior acima a 37 ° c por 8-12 h para formar um gramado bacteriano.
  13. Use a maioria do ágar com gramados bacterianos da etapa 2,12 aos nematóides da cultura na etapa 2,15 ou 2,19.
  14. Armazene 1 ou 2 ágares acima do lado para baixo para evitar a evaporação e a contaminação da água nos refrigeradores a 4 ° c para sustentar as bactérias dentro da contaminação.
  15. Quando há menos de 2.000 nematóides na estocagem ngm ágares (de experimentos anteriores ou dotado de outros laboratórios), corte um sexto do agar ngm que contém C. elegans com uma ponta estéril e transferi-lo para ágares recém-preparados ngm com bactérias gramado (da etapa 2,13). Mantenha o ngm ágares acima do lado para baixo em uma incubadora de 22 ° c para a cultura subseqüente.
  16. Quando há mais de 2.000 nematóides no agar NGM de estocagem, lave os nematóides do agar NGM com 2 mL de água estéril em tubos de centrifugação. A entrada de 2 mL de água resultará em uma saída de aproximadamente 1,5 mL.
  17. Permitir que os nematóides se instalem nos tubos de centrifugação durante 30 min. descarte 1 mL dos sobrenadantes introduzindo pipetagem e adicione 1 mL de água estéril em cada tubo para lavar as pastilhas (ou seja, os nematoides).
  18. Deite abaixo os nematóides nos tubos de centrifugação durante 30 min. descarte 1 mL dos sobrenadantes por pipetagem. Adicione 1 mL de água estéril em cada tubo para suspender os nematóides.
  19. Distribua as suspensões de nematódeos (aproximadamente 1,5 ml no total) pipetando 150 μl para cada novo Agar ngm com gramado bacteriano (da etapa 2,13), tornando 8-10 novos ágares ngm no total.
  20. Mantenha os ágares de ngm da etapa 2,19 acima-lado acima em uma incubadora de 20 ° c durante a noite e então acima do lado para baixo para a cultura subseqüente.
  21. Repita a etapa 2,15 ou a etapa 2.16-2.20 cada três dias.

3. prepare ovos sincronizados e larvas L3 de C. elegans

  1. Lave os nematóides gravid e os ovos recém-produzidos dos ágares de ngm em tubos de centrifugação estéreis, com 2 ml de água estéril em cada Agar ngm, resultando em aproximadamente 1,5 ml de saída.
  2. Estabeleça os nematóides nos tubos de centrifugação durante 30 minutos e, em seguida, elimine 85% dos sobrenadantes introduzindo pipetagem.
  3. Prepare soluções de hipoclorito de sódio dissolvendo 0,6 g de NaOH e 5 mL de NaOCl (4-6% gradientes ativos, consulte a tabela de materiais para obter detalhes) com 25 ml de água para trazer o naoh para 0,5 M e NaOCl para 1%.
  4. Misture as pelotas da etapa 3,2 (marque o volume como V0) com 7 vezes v0 de soluções de hipoclorito de sódio de (etapa 3,3, ou seja, proporção de volume de 1:7)19.
  5. Agitar os tubos de centrifugação a cada 2 min para 10-15 min para lyse as larvas e NEMATODES adultos; a cor de suspensões de nematódeos vai virar de turva para limpar.
  6. Centrifugue os tubos a 700 x g durante 3 min a 20 ° c e, em seguida, elimine os sobrenadantes introduzindo pipetagem.
  7. Ressuscitem as pelotas em 5 vezes V0 de água estéril para lavar os ovos sincronizados com a idade. Centrifugue a 700 x g durante 3 min a 20 ° c e, em seguida, elimine os sobrenadantes.
  8. Repita o passo 3,7 duas vezes.
  9. Adicionar 1 dobra V0 de água estéril nos tubos para ressuscidar os ovos sincronizados com a idade.
  10. Distribua as suspensões de ovos pipetando 50 μL para cada novo ágares ngm com gramado bacteriano do passo 2,13. Mantenha o ngm ágares Top-side acima em uma incubadora de 20 ° c por 30 minutos, permitindo que a água evate ou seja adsorvido pelo gramado bacteriano. Em seguida, faça o ngm ágares up-side para baixo para a cultura subseqüente. Marque a hora como o tempo do ovo (ovode T).
  11. Prepare o K-Medium dissolvendo 3 g de NaCl e 2,36 g de KCl em 1 L de água. Esterilizar o meio a 121 ° c e 0,105 MPa por 20 min e resfriá-lo até a temperatura ambiente.
  12. Quando o tempo atinge 36 h após TEgg, o nematóides chegará ao estágio de larvas L3 (nematoides L3)20. Lave os nematóides fora dos ágares de ngm em tubos de centrifugação, com 2 ml de água estéril em cada Agar ngm, resultando em aproximadamente 1,5 ml de saída.
  13. Após uma liquidação por 30 min, substitua 85% dos sobrenadantes (por pipetagem) com K-Medium de 2 h para digerir o alimento nas entranhas3.
  14. Descarte os sobrenadantes. Use K-Medium (da etapa 3,11) para ajustar as suspensões de nematoides a cerca de 200 nematóides por 100 μL para experimentos subsequentes.

4. use C. elegans para estudo de efeito trans-geracional

  1. Prepare soluções químicas com 5 níveis de concentração e um solvente ou controle absoluto, ou seja, 6 grupos no total.
  2. Adicionar 100 μL de controle ou soluções químicas com 10 poços como repetições em cada grupo (ou seja, 60 poços no total) na área intermediária de uma microplaca 96-poço estéril para evitar efeitos de aresta.
  3. Diluir as suspensões de nematódeos da etapa 3,14 com K-Medium da etapa 3,11 por 10 vezes. Adicionar 100 μL de suspensões de nematódeos a cada um dos 60 poços da etapa 4,2. Marque a hora como t0.
  4. Quando o tempo atinge 24 h após t0, contar os nematoides vivos e mortos nos poços. Calcule a concentração letal mediana (LC50).
  5. Prepare uma série de 5 concentrações abaixo de 10% dos valores de LC50 .
  6. Adicione 100 μL de soluções químicas ou de controle (da etapa 4,5) com 10 poços como repetições em cada grupo (ou seja, 60 poços no total) na área intermediária de uma microplaca estéril 96-bem para evitar efeitos de aresta.
  7. Adicionar 100 μL de K-médio contendo aproximadamente 200 L3 nematoides (da etapa 3,14) a cada um dos 60 poços da etapa 4,6. Marque a hora como T0.
  8. Realize a exposição de 24 a 96 h desde T0.
  9. Após a exposição, colete nematóides de cinco poços em cada grupo em 1,5 mL tubos de centrifugação por pipetagem (ou seja, 6 tubos no total).
  10. Liquidar os nematoides por 30 min, descartar os sobrenadantes por pipetagem, e ressuscitar e lavar nematoides na parte inferior com 1 mL de água esterilizada.
  11. Liquidar os nematóides durante 30 min, descartar os sobrenadantes introduzindo pipetagem e utilizar os nematóides na parte inferior para as medições do indicador (ver secção 7) da geração dos pais expostos marcada como F0.
  12. Coletar, liquidar e lavar (por ressuscita) os nematoides dos cinco poços restantes em cada grupo na etapa 4,9 de acordo com a etapa 4,10.
  13. Liquidar os nematoides da etapa 4,12 por 30 min. Descarte os sobrenadantes introduzindo pipetagem e adicione 100 μL de água estéril para ressuscitar os nematoides. Transfira as suspensões do nematoide uniformente em três ágares recentemente preparados de ngm com gramado bacteriano da etapa 2,13.
  14. Incubar os nematoides para 36 h para se tornar gravid e executar a sincronização de idade de acordo com as etapas 3.1-3.9. Incubar os ovos sincronizados em ágares respectivos de ngm com gramado bacteriano da etapa 2,13 para 36 h.
  15. Lave os nematóides nos ágares ngm da etapa 4,14 em seis tubos de centrifugação.
  16. Liquidar os nematóides por 30 min, e descartar os sobrenadantes por pipetagem. Ressuspender e lavar os pellets com 1 mL de água esterilizada.
  17. Liquidar os nematóides por 30 min, e descartar os sobrenadantes por pipetagem. Use os nematóides na parte inferior para as medições do indicador (ver seção 7) da geração de descendentes marcada como T1.

5. use C. elegans para estudo de efeito de exposição multigeracional (MGE)

  1. Misture 99,0 ml de ágares de ngm (da etapa 2,9) com 1 ml de soluções do controle ou do produto químico (concentrações baixas e elevadas no protocolo atual como exemplos, isto é, três grupos no total).
  2. Despeje cerca de 10 mL de meio de agar NGM por prato da etapa 5,1 em 100 pratos de Petri estéreis (6,0 cm de diâmetro). Fixe o meio nas placas de Petri à temperatura ambiente para formar agar sólido.
  3. Pipetam suspensões bacterianas para o agar como por passo 2,11.
  4. Reserve as tampas superiores dos pratos de Petri e expor o gramado bacteriano à luz UV (145 μW/cm2) no armário da Biossegurança por 15 minutos.
  5. Escolha uma pequena colônia usando um loop de inocular, coloque-o no meio lb de ágares na etapa 1,4. Incubar o meio LB com agitação a uma velocidade de 150 rpm a 37 ° c por 24 h para confirmar o crescimento bacteriano negligle, validando o passo de matança 5,4.
  6. Pipeta os ovos sincronizados com a idade da etapa 3,9 para os ágares (da etapa 5,4). Marque o início da exposição à geração principal F0 e marque o dia 0 (D0).
  7. Incubar os ágares para 3 d em 20 ° c. Em seguida (ou seja, em D3), use os nematóides maduros para medir os efeitos na F0 (ver secção 7).
  8. Também em D3, pick F0 maduro nematóides para novos ágares ngm (a partir do passo 5,4) usando uma haste de vidro, cuja extremidade é equipado com um fio de fibra feita pelo homem dobrado em um anel.
  9. No D4, escolha e descarte os nematódeos maduros F0 de agars NGM. Marque os nematoides recém-ecloados dentro destes 24 h (de D3 a D4) como F1 para experimentar a exposição de segunda geração.
  10. Em D6, os índices da medida (veja a seção 7) dos nematóides F1 maduros que experimentaram a exposição por 3 dias.
  11. No D9, repita as etapas 5.8-5.10, use nematoides F1 para reproduzir worms F2 e medir efeitos em nematoides F2.
  12. Em D12, repita o passo 5,11, use os nematoides F2 para reproduzir worms F3 e medir os efeitos em nematoides F3. Através da mesma maneira, reproduza os descendentes e meça os efeitos da MGE na geração de descendentes de nª (FN).

6. use C. elegans para o estudo de efeito de resíduo multigeracional (MGR)

  1. Repita os passos 5.1-5.7. Em D3, pick F0 maduro nematóides para novos ágares ngm sem adição de produtos químicos (a partir do passo 2,13).
  2. No D4, escolha e descarte os nematoides maduros da F0. Marque os nematodos de filhotes recém-ecloídos dentro destes 24 h como nematoides T1.
  3. No D6, os índices de medida (ver secção 7) dos nematoides maduros T1 que cresceram durante 3 dias.
  4. No D9, repita os passos 6.2-6.3, use nematoides T1 para reproduzir nematoides T2 e medir efeitos em nematoides T1.
  5. Em D12, repita os passos 6,4, use nematoides T2 para reproduzir os nematoides T3 e medir os efeitos em nematoides T2. Da mesma forma, reproduza os descendentes e meça os efeitos do MGR nos nematóides de geração de descendentes de nª (TN) da F0, ou os nematoides nth descendentes (TN ') de FN da etapa 5,12.

7. indicadores de medida

  1. Medir o comportamento de locomoção.
    1. Lave os nematóides fora do ágares ngm usando água estéril e recolhê-los em tubos de centrifugação. Liquidar os nematoides durante 30 min, descartar os sobrenadantes e usar os nematódeos nas pelotas para medição de efeito.
    2. Ressuscitem os nematódeos nas pelotas com 1 ml de água estéril e pipetam-nos para os ágares ngm sem gramado bacteriano da etapa 2,10.
    3. Use um microscópio de dissecação para marcar os nematóides para a (número de) freqüência de dobra do corpo (BBF) que se refere aos tempos em que o bulbo posterior da faringe muda de direção ao longo do sentido vertical do trajeto de viagem dentro de um intervalo de 60 s.
    4. Use o microscópio de dissecação para marcar o movimento de reversão (RM) que se refere aos tempos em que a direção de viagem muda mais de 90 °, incluindo voltas para trás e Omega Turn (OT) em um intervalo de 60 s. O OT refere-se ao movimento quando a cabeça do nematódeo toca ou quase toca a sua cauda fazendo a forma de nematódeo como a letra grega Omega (Ω).
      Nota: pelo menos 6 nematoides foram examinados para cada tratamento em cada repetição experimental.
Exemplos para efeitos de MGE (F0 a F3) na reprodução e vida útil com 3 grupos (um controle e dois tratamentos de exposição).
Dia Número de agar NGM para estudo MGE Explicação
Vida útil Reprodução
0 30 (exposição F0) 10 repetições para cada grupo, marcadas como F0-1-1-0 a F0-3-10-0, com o último dígito para mostrar os dias de sobrevivência.
1 30 (F0 sobrevive a 1 d) F0-1-1-0 a F0-3-10-0 deve ser alterado para F0-1-1-1 para F0-3-10-1.
2 30 (F0 sobrevive a 2 d) F0-1-1-1 a F0-3-10-1 deve ser alterado para F0-1-1-2 para F0-3-10-2.
Não há necessidade de transferir nematoides F0 até 3 d.
3 30 (F0 sobrevive 3 d, cancelado após a transferência e a coleção dos nematóides) Após 3 d, os nematoides F0 são maduros e 36 novos ágares de ngm (com 2 nematóides em cada agar) são usados para observar sua sobrevivência e reprodução.
36 (F0-1-1-3 a F0-3-12-3) Experimentos preliminares devem ser realizados para organizar o número de nematoides F0, assegurando pelo menos 200 descendentes para operações multigeracionais subsequentes.
Notavelmente, se os efeitos do Mgr são estudados, os nematódeos F0 devem ser transferidos para ágares claros de ngm sem exposição química, e deve ser observado como início de T1.
A maioria dos nematoides F0 são coletadas para medir índices químicos e genéticos e os 30 ágares em F0 são limpos.
4 36 (F0-1-1-4 a F0-3-12-4) 36 (F1-1-1-1 a F1-3-12-1) A medição da vida útil e da reprodução requer transferência todos os dias.
Os nematoides dos pais em F0-1-1-3 a F0-3-12-3 são escolhidos para os novos ágares ngm marcados como F0-1-1-4 a F0-3-12-4.
Os nematoides remanescentes (i.e., F1 em MGE, ou T1 em MGR) em F0-1-1-3 a F0-3-12-3 ágares cresceram por 1 d, e os marcadores são alterados para F1-1-1-1 para F1-3-12-1. Estes ágares também são usados para monitorar a vida útil da F1 com transferência diária.
5 36 (F0-1-1-5 a F0-3-12-5) 36 (F1-1-1-2 a F1-3-12-2) Os nematoides nos ágares F1-1-1-1 a F1-3-12-1 cresceram por 2 d e tornam-se facilmente observáveis e os nematoides são contados, e os marcadores são alterados para F1-1-1-2 para F1-3-12-2.
36 (F0-1-1-4 a F0-3-12-4) Os nematoides da prole em F0-1-1-4 a F0-3-12-4 ágares cresceram para 1 d.
6 36 (F0-1-1-6 a F0-3-12-6) 36 (F0-1-1-4 a F0-3-12-4, cancelado após contado) NEMATODES em F1-1-1-2 para F1-3-12-2 ágares cresceram para 3 d e os marcadores são alterados para F1-1-1-3 para F1-3-12-3. Notavelmente, os nematoides F1 começam a reproduzir F2 neste dia, os nematoides F1 devem ser transferidos para novos ágares ngm fazendo F2-1-1-0 para F1-3-12-0. Para estudos do MGR, o T2 começa hoje.
36 (F1-1-1-3 a F1-3-12-3) 36 (F0-1-1-5 a F0-3-12-5) Isto pode ser atrasado pela exposição química, e conseqüentemente as mudanças flexíveis devem ser executadas em cada experimento para assegurar bastante nematóides para gerações subseqüentes.
36 (F2-1-1-0 a F1-3-12-0) Os nematoides da prole em F0-1-1-4 a F0-3-12-4 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
Os nematoides da prole em F0-1-1-5 a F0-3-12-5 ágares cresceram para 1 d.
7 36 (F0-1-1-7 a F0-3-12-7) 36 (F0-1-1-5 a F0-3-12-5, cancelado após contado) Os nematoides da prole em F0-1-1-5 a F0-3-12-5 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F1-1-1-4 a F1-3-12-4) 36 (F0-1-1-6 a F0-3-12-6) O número total de nematódeos em ágares F1-1-1-1 a F1-3-12-1, F0-1-1-4 a F0-3-12-4 ágares e F0-1-1-5 a F0-3-12-5 é utilizado para calcular a reprodução inicial de F0.
36 (F2-1-1-1 a F2-3-12-1) Os nematoides da prole em F0-1-1-6 a F0-3-12-6 ágares cresceram para 1 d.
Os nematoides F2 em F2-1-1-0 a F1-3-12-0 cresceram para 1 d e seus marcadores são alterados em F2-1-1-1 para F2-3-12-1.
8 36 (F0-1-1-8 a F0-3-12-8) 36 (F0-1-1-6 a F0-3-12-6, cancelado após contado) Os nematoides da prole em F0-1-1-6 a F0-3-12-6 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F1-1-1-5 a F1-3-12-5) 36 (F0-1-1-7 a F0-3-12-7) Os nematoides da prole de F0 em F0-1-1-7 a F0-3-12-7 ágares cresceram para 1 d.
36 (F2-1-1-2 a F2-3-12-2) 36 (F1-1-1-4 a F1-3-12-4) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-4 a F1-3-12-4 ágares cresceram para 1 d.
36 (F2-1-1-1 a F2-3-12-1, mudado a F2-1-1-2 a F2-3-12-2 após contado) Os nematoides F2 em F2-1-1-1 a F2-3-12-1 cresceram para 2 d, os nematoides são contados e seus marcadores são alterados em F2-1-1-2 para F2-3-12-2.
9 36 (F0-1-1-9 a F0-3-12-9) 36 (F0-1-1-7 a F0-3-12-7, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F0 em F0-1-1-7 a F0-3-12-7 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F1-1-1-6 a F1-3-12-6) 36 (F1-1-1-4 a F1-3-12-4, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-4 a F1-3-12-4 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F2-1-1-3 a F2-3-12-3) 36 (F0-1-1-8 a F0-3-12-8) Os nematoides da prole de F0 em F0-1-1-8 a F0-3-12-8 ágares cresceram para 1 d.
36 (F3-1-1-0 a F3-3-12-0) 36 (F1-1-1-5 a F1-3-12-5) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-5 a F1-3-12-5 ágares cresceram para 1 d.
Os nematoides F2 em F2-1-1-2 a F2-3-12-2 cresceram por 3 dias e seus marcadores são alterados para F2-1-1-3 para F2-3-12-3. Os nematoides F2 começam a se reproduzir hoje e são transferidos para 36 novos ágares ngm são necessários e marcados como F3-1-1-0 para F3-3-12-0. Para estudos de MGR, T3 começar hoje.
10 36 (F0-1-1-10 a F0-3-12-10) 36 (F0-1-1-8 a F0-3-12-8, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F0 em F0-1-1-8 a F0-3-12-8 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F1-1-1-7 a F1-3-12-7) 36 (F1-1-1-5 a F1-3-12-5, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-5 a F1-3-12-5 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F2-1-1-4 a F2-3-12-4) 36 (F0-1-1-9 a F0-3-12-9) O número total de nematódeos em F2-1-1-1 a F2-3-12-1, F1-1-1-4 a F1-3-12-4 ágares e F1-1-1-5 a F1-3-12-5 são usados para calcular a reprodução inicial de F1.
36 (F3-1-1-1 a F3-3-12-1) 36 (F1-1-1-6 a F1-3-12-6) Os nematoides da prole de F0 em F0-1-1-9 a F0-3-12-9 ágares cresceram para 1 d.
Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-6 a F1-3-12-6 ágares cresceram para 1 d.
O nematódeo da prole em F3-1-1-0 a F3-3-12-0 ágares cresceu para 1 d e os marcadores são mudados em F3-1-1-1 a F3-3-12-1.
Notavelmente, a reprodução de nematoides F0 diminuirá significativamente após os primeiros dias. Portanto, a transferência de nematódeos não é estritamente necessária para ser diariamente após D10 e pode ser realizada a cada 2 dias. No entanto, a sobrevivência ainda requer observação diária.
A mesma regra também se aplica em F1 (T1, T1 '), F2 (T2, T2 ') e F3 (T3, T3 ').
11 36 (F0-1-1-11 a F0-3-12-11) 36 (F0-1-1-9 a F0-3-12-9, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F0 em F0-1-1-9 a F0-3-12-9 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F1-1-1-8 a F1-3-12-8) 36 (F1-1-1-6 a F1-3-12-6, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-6 a F1-3-12-6 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F2-1-1-5 a F2-3-12-5) 36 (F0-1-1-10 a F0-3-12-10) Os nematoides da prole de F0 em F0-1-1-10 a F0-3-12-10 ágares cresceram para 1 d.
36 (F3-1-1-2 a F3-3-12-2) 36 (F1-1-1-7 a F1-3-12-7) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-7 a F1-3-12-7 ágares cresceram para 1 d.
36 (F2-1-1-4 a F2-3-12-4) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-4 a F2-3-12-4 ágares cresceram para 1 d.
36 (F3-1-1-1 a F3-3-12-1, alterado para F3-1-1-2 para F3-3-12-2 após a contagem) Os nematoides nos ágares F3-1-1-1 a F3-3-12-1 cresceram para 2 d, os nematoides são contados e os marcadores são alterados para F3-1-1-2 para F3-3-12-2.
12 36 (F0-1-1-12 a F0-3-12-12) 36 (F0-1-1-10 a F0-3-12-10, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F0 em F0-1-1-10 a F0-3-12-10 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F1-1-1-9 a F1-3-12-9) 36 (F1-1-1-7 a F1-3-12-7, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-7 a F1-3-12-7 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F2-1-1-6 a F2-3-12-6) 36 (F2-1-1-4 a F2-3-12-4, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-4 a F2-3-12-4 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F3-1-1-3 a F3-3-12-3) 36 (F0-1-1-11 a F0-3-12-11) Os nematoides da prole de F0 em F0-1-1-11 a F0-3-12-11 ágares cresceram para 1 d.
36 (F4-1-1-0 a F4-3-12-0) 36 (F1-1-1-8 a F1-3-12-8) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-8 a F1-3-12-8 ágares cresceram para 1 d.
36 (F2-1-1-5 a F2-3-12-5) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-5 a F2-3-12-5 ágares cresceram para 1 d.
Os nematoides em F3-1-1-2 a F3-3-12-2 ágares cresceram para 3 d e os marcadores são transformados em F3-1-1-3 a F3-3-12-3. Os nematóides F3 começam a se reproduzir hoje e são transferidos para 36 novos ágares ngm são necessários e marcados como F4-1-1-0 para F4-3-12-0. Para estudos de MGR, a descendência de F3 (i.e., T1 ') começa hoje.
13 36 (F0-1-1-13 a F0-3-12-13) 36 (F0-1-1-11 a F0-3-12-11, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F0 em F0-1-1-11 a F0-3-12-11 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F1-1-1-10 a F1-3-12-10) 36 (F1-1-1-8 a F1-3-12-8, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-8 a F1-3-12-8 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F2-1-1-7 a F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-5 a F2-3-12-5, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-5 a F2-3-12-5 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F3-1-1-4 a F3-3-12-4) 36 (F0-1-1-12 a F0-3-12-12) O número total de nematódeos em F3-1-1-1 a F3-3-12-1, F2-1-1-4 a F2-3-12-4 ágares e F2-1-1-5 a F2-3-12-5 são usados para calcular a reprodução inicial de F2.
36 (F4-1-1-1 a F4-3-12-1) 36 (F1-1-1-9 a F1-3-12-9) Os nematoides da prole de F0 em F0-1-1-12 a F0-3-12-12 ágares cresceram para 1 d.
36 (F2-1-1-6 a F2-3-12-6) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-9 a F1-3-12-9 ágares cresceram para 1 d.
Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-6 a F2-3-12-6 ágares cresceram para 1 d.
Os nematoides descendentes de F3 em F4-1-1-0 a F4-3-12-0 cresceram para 1 d, e os marcadores são alterados em F4-1-1-1 para F4-3-12-1.
14 36 (F0-1-1-14 a F0-3-12-14) 36 (F0-1-1-12 a F0-3-12-12, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F0 em F0-1-1-12 a F0-3-12-12 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F1-1-1-11 a F1-3-12-11) 36 (F1-1-1-9 a F1-3-12-9, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-9 a F1-3-12-9 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F2-1-1-8 a F2-3-12-8) 36 (F2-1-1-6 a F2-3-12-6, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-6 a F2-3-12-6 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F3-1-1-5 a F3-3-12-5) 36 (F4-1-1-1 a F4-3-12-1, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F3 em F4-1-1-1 a F4-3-12-1 cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados. Para os estudos de Mgr, T1 ' nematóides cresceram para 2 d, e começará a reproduzir T2 ' no dia seguinte (D15), e T2 ' começará a reproduzir T3 ' em D18. O tempo de vida selvagem do tipo C. elegans é exampled como 15 dias. Em seguida, o término do tempo de vida do T3 será no D33.
36 (F0-1-1-13 a F0-3-12-13) Os nematoides da prole de F0 em F0-1-1-13 a F0-3-12-13 ágares cresceram para 1 d.
36 (F1-1-1-10 a F1-3-12-10) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-10 a F1-3-12-10 ágares cresceram para 1 d.
36 (F2-1-1-7 a F2-3-12-7) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-7 a F2-3-12-7 ágares cresceram para 1 d.
36 (F3-1-1-4 a F3-3-12-4) Os nematoides da prole de F3 em F3-1-1-4 a F2-3-12-4 ágares cresceram para 1 d.
15 36 (F0-1-1-15 a F0-3-12-15) 36 (F0-1-1-13 a F0-3-12-13, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F0 em F0-1-1-13 a F0-3-12-13 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F1-1-1-12 a F1-3-12-12) 36 (F1-1-1-10 a F1-3-12-10, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F1 em F1-1-1-10 a F1-3-12-10 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F2-1-1-9 a F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-7 a F2-3-12-7, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-7 a F2-3-12-7 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F3-1-1-6 a F3-3-12-6) 36 (F3-1-1-4 a F3-3-12-4, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F3 em F3-1-1-4 a F3-3-12-4 ágares cresceram para 2D, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F0-1-1-14 a F0-3-12-14) Os nematoides da prole de F0 em F0-1-1-14 a F0-3-12-14 ágares cresceram para 1 d.
36 (F1-1-1-11 a F1-3-12-11) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-11 a F1-3-12-11 ágares cresceram para 1 d.
36 (F2-1-1-8 a F2-3-12-8) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-8 a F2-3-12-8 ágares cresceram para 1 d.
36 (F3-1-1-5 a F3-3-12-5) Os nematoides da prole de F3 em F3-1-1-5 a F2-3-12-5 ágares cresceram para 1 d.
16 36 (F0-1-1-15 a F0-3-12-15, sobre) 36 (F0-1-1-14 a F0-3-12-14, cancelado após contado) O tempo de vida selvagem do tipo C. elegans é exampled como 15 dias. Portanto, F0 deve ter todos morreram antes do dia 16 desde a exposição.
36 (F1-1-1-13 a F1-3-12-13) 36 (F1-1-1-11 a F1-3-12-11, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F0 em F0-1-1-14 a F0-3-12-14 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F2-1-1-10 a F2-3-12-10) 36 (F2-1-1-8 a F2-3-12-8, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-11 a F1-3-12-11 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F3-1-1-7 a F3-3-12-7) 36 (F3-1-1-5 a F3-3-12-5, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-8 a F2-3-12-8 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F0-1-1-15 a F0-3-12-15) Os nematoides da prole de F3 em F3-1-1-5 a F3-3-12-5 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F1-1-1-12 a F1-3-12-12) O número total de nematódeos em F4-1-1-1 a F4-3-12-1, F3-1-1-4 a F3-3-12-4 ágares e F3-1-1-5 a F3-3-12-5 são usados para calcular a reprodução inicial de F3.
36 (F2-1-1-9 a F2-3-12-9) Os nematoides da prole de F0 em F0-1-1-15 a F0-3-12-15 ágares cresceram para 1 d.
36 (F3-1-1-6 a F3-3-12-6) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-12 a F1-3-12-12 ágares cresceram para 1 d.
Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-9 a F2-3-12-9 ágares cresceram para 1 d.
Os nematoides da prole de F3 em F3-1-1-6 a F2-3-12-6 ágares cresceram para 1 d.
17 36 (F1-1-1-14 a F1-3-12-14) 36 (F0-1-1-15 a F0-3-12-15, cancelado após contado, sobre) Os nematóides da prole de F0 em F0-1-1-15 a F0-3-12-15 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados. Não haverá mais descendentes de F0.
36 (F2-1-1-11 a F2-3-12-11) 36 (F1-1-1-12 a F1-3-12-12, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F1 em F1-1-1-12 a F1-3-12-12 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F3-1-1-8 a F3-3-12-8) 36 (F2-1-1-9 a F2-3-12-9, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-9 a F2-3-12-9 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F3-1-1-6 a F3-3-12-6, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F3 em F3-1-1-6 a F3-3-12-6 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F1-1-1-13 a F1-3-12-13) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-13 a F1-3-12-13 ágares cresceram para 1 d.
36 (F2-1-1-10 a F2-3-12-10) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-10 a F2-3-12-10 ágares cresceram para 1 d.
36 (F3-1-1-7 a F3-3-12-7) Os nematoides da prole de F3 em F3-1-1-7 a F2-3-12-7 ágares cresceram para 1 d.
18 36 (F1-1-1-15 a F1-3-12-15) 36 (F1-1-1-13 a F1-3-12-13, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F1 em F1-1-1-13 a F1-3-12-13 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F2-1-1-12 a F2-3-12-12) 36 (F2-1-1-10 a F2-3-12-10, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-10 a F2-3-12-10 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F3-1-1-9 a F3-3-12-9) 36 (F3-1-1-7 a F3-3-12-7, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F3 em F3-1-1-7 a F3-3-12-7 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F1-1-1-14 a F1-3-12-14) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-14 a F1-3-12-14 ágares cresceram para 1 d.
36 (F2-1-1-11 a F2-3-12-11) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-11 a F2-3-12-11 ágares cresceram para 1 d.
36 (F3-1-1-8 a F3-3-12-8) Os nematoides da prole de F3 em F3-1-1-8 a F2-3-12-8 ágares cresceram para 1 d.
Em estudos de MGR, T2 ' começará a reproduzir T3 ' hoje. O tempo de vida selvagem do tipo C. elegans é exampled como 15 dias. Em seguida, o término do tempo de vida do T3 será no D33.
19 36 (F1-1-1-15 a F1-3-12-15, sobre) 36 (F1-1-1-14 a F1-3-12-14, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F1 em F1-1-1-14 a F1-3-12-14 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F2-1-1-13 a F2-3-12-13) 36 (F2-1-1-11 a F2-3-12-11, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-11 a F2-3-12-11 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F3-1-1-10 a F3-3-12-10) 36 (F3-1-1-8 a F3-3-12-8, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F3 em F3-1-1-8 a F3-3-12-8 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F1-1-1-15 a F1-3-12-15) Os nematoides da prole de F1 em F1-1-1-15 a F1-3-12-15 ágares cresceram para 1 d.
36 (F2-1-1-12 a F2-3-12-12) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-12 a F2-3-12-12 ágares cresceram para 1 d.
36 (F3-1-1-9 a F3-3-12-9) Os nematoides da prole de F3 em F3-1-1-9 a F2-3-12-9 ágares cresceram para 1 d.
20 36 (F2-1-1-14 a F2-3-12-14) 36 (F1-1-1-15 a F1-3-12-15, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F1 em F1-1-1-14 a F1-3-12-14 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados. Não haverá mais descendentes de F1.
36 (F3-1-1-11 a F3-3-12-11) 36 (F2-1-1-12 a F2-3-12-12, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-12 a F2-3-12-12 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F3-1-1-9 a F3-3-12-9, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F3 em F3-1-1-9 a F3-3-12-9 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F2-1-1-13 a F2-3-12-13) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-13 a F2-3-12-13 ágares cresceram para 1 d.
36 (F3-1-1-10 a F3-3-12-10) Os nematóides da prole de F3 em F3-1-1-10 a F2-3-12-10 ágares cresceram para 1 d.
21 36 (F2-1-1-15 a F2-3-12-15) 36 (F2-1-1-13 a F2-3-12-13, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-13 a F2-3-12-13 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F3-1-1-12 a F3-3-12-12) 36 (F3-1-1-10 a F3-3-12-10, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F3 em F3-1-1-10 a F3-3-12-10 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F2-1-1-14 a F2-3-12-14) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-14 a F2-3-12-14 ágares cresceram para 1 d.
36 (F3-1-1-11 a F3-3-12-11) Os nematóides da prole de F3 em F3-1-1-11 a F2-3-12-11 ágares cresceram para 1 d.
22 36 (F2-1-1-15 a F2-3-12-15, sobre) 36 (F2-1-1-14 a F2-3-12-14, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-14 a F2-3-12-14 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F3-1-1-13 a F3-3-12-13) 36 (F3-1-1-11 a F3-3-12-11, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F3 em F3-1-1-11 a F3-3-12-11 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F3-1-1-12 a F3-3-12-12) Os nematóides da prole de F3 em F3-1-1-12 a F2-3-12-12 ágares cresceram para 1 d.
23 36 (F3-1-1-14 a F3-3-12-14) 36 (F2-1-1-15 a F2-3-12-15, cancelado após contado) Os nematoides da prole de F2 em F2-1-1-15 a F2-3-12-15 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados. Não haverá mais descendentes de F2.
36 (F3-1-1-12 a F3-3-12-12, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F3 em F3-1-1-12 a F3-3-12-12 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F3-1-1-13 a F3-3-12-13) Os nematoides descendentes de F3 em F3-1-1-13 a F2-3-12-13 ágares cresceram por 1 d.
24 36 (F3-1-1-15 a F3-3-12-15) 36 (F3-1-1-13 a F3-3-12-13, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F3 em F3-1-1-13 a F3-3-12-13 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F3-1-1-14 a F3-3-12-14) Os nematóides da prole de F3 em F3-1-1-14 a F2-3-12-14 ágares cresceram para 1 d.
25 36 (F3-1-1-15 a F3-3-12-15, sobre) 36 (F3-1-1-14 a F3-3-12-14, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F3 em F3-1-1-14 a F3-3-12-14 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
36 (F3-1-1-15 a F3-3-12-15) Os nematóides da prole de F3 em F3-1-1-15 a F2-3-12-15 ágares cresceram para 1 d.
26 36 (F3-1-1-15 a F3-3-12-15, cancelado após contado) Os nematóides da prole de F3 em F3-1-1-15 a F3-3-12-15 ágares cresceram para 2 d, e os ágares são cancelados depois que os nematóides são contados.
Notavelmente, em estudos de MGR, a primeira descendência não exposta de F3 (i.e., T3 ') nasceria em D18. O tempo de vida selvagem do tipo C. elegans é exampled como 15 dias. Em seguida, o término do tempo de vida do T3 será no D33.
Os estudos de MGE e de MGR cobrirá mais dias em que a vida do nematoide é mais longa.

Tabela 1: lista de marcadores e suas definições.

  1. Reproduça a reprodução e a vida útil em estudos de efeito MGE.
    1. No D0, repita o passo 5,6. Marcar os ágares (3 grupos com 10 repetições em cada) como Fx-a-b-c, onde x refere-se ao número de geração, a refere-se ao número do grupo (1 para controle, 2 para a baixa concentração e 3 para a alta concentração ); b refere-se à repetição de 1 a 10; e c refere-se à duração da exposição (0 indica o início). Para D0, marca os ágares como F0-1-1-0 a F0-3-10-0. Os leitores podem consultar a tabela 1 para obter informações detalhadas.
    2. Em D1, verifique o crescimento de nematódeos nos agars e mude os marcadores de F0-1-1-0 para F0-3-10-0 para F0-1-1-1 para F0-3-10-1.
    3. Em D2, verifique o crescimento de nematódeos nos agars e mude os marcadores F0-1-1-2 para F0-3-10-2.
    4. Na D3, escolha 24 nematoides F0 de cada grupo para 12 novos ágares ngm com dois Agar ngm da etapa 5,4. Marque os ágares como F0-1-1-3 a F0-3-12-3.
    5. No D4, transfira os dois nematoides dos pais de F0-1-1-3 para F0-3-12-3 escolhendo novos ágares ngm da etapa 5,4. Marque o novo ngm ágares como F0-1-1-4 para F0-3-12-4. Mude os marcadores de F0-1-1-3 para F0-3-12-3 para F1-1-1-1 para F1-3-12-1 para representar a descendência de F0 (i.e., F1) no primeiro dia desde que a F0 começa a se reproduzir.
    6. Em d5, use um microscópio de dissecação para contar os nematoides em F1-1-1-1 a F1-3-12-1 ágares onde os nematóides cresceram 2 dias. Permitir F1-1-1-1 para F1-3-12-1 ágares para reproduzir F2 para sucessivas gerações.
    7. Transfira os dois nematoides dos pais de F0-1-1-4 para F0-3-12-4 ágares, escolhendo em novos ágares ngm da etapa 5,4. Mark ngm ágares como F0-1-1-5 a F0-3-12-5. Altere as marcas de F0-1-1-4 para F0-3-12-4 para F1-1-1-2 para F1-3-12-2 para representar a descendência de F0 (i.e., F1) no segundo dia desde que a F0 começa a se reproduzir.
    8. Em D6, conte os nematóides em F1-1-1-2 para F1-3-12-2 agars. Transfira os nematoides dos pais de F0-1-1-5 para F0-3-12-5 ágares para F0-1-1-6 para F0-3-12-6. Altere os marcadores de F0-1-1-5 para F0-3-12-5 para F1-1-1-3 para F1-3-12-3 para representar a descendência de F0 (i.e., F1) no terceiro dia desde que a F0 começa a se reproduzir.
    9. Os nematoides nos ágares F1-1-1-1 a F1-3-12-1 cresceram por 3 dias. Use-os para reproduzir F2 em estudos de efeito de MGE sucedendo. Através da mesma maneira, use os nematoides F2 para reproduzir F3 para continuar os estudos de efeito MGE.
    10. Através da mesma forma, transfira os dois nematoides pais diariamente e conte os nematoides dos descendentes no dia seguinte, até que os nematoides dos pais em 6 ágares de ngm (i.e., metade do total de ágares em cada grupo) Parem a reprodução.
    11. Calcule o número total de descendentes ao longo de toda a duração da reprodução como o tamanho total da ninhada. Use o número de descendentes dentro dos primeiros 3 dias para representar a reprodução inicial dos pais.
    12. Use o dia em que a reprodução do nematoide pai parar em 6 ágares de ngm para estimar a duração da reprodução. Use os dias que cada pai individual sobreviveu como sua vida útil.
    13. Obter a reprodução inicial, a duração da reprodução, o tamanho total da ninhada e o tempo de vida da F1 da mesma forma que o feito para F0. Similarmente, repetindo o procedimento acima mencionado, a reprodução e a informação do Lifespan de F2 (a FN) podem ser obtidas.
  2. Medida de reprodução e vida útil em estudos de efeito MGR.
    1. Execute a etapa 7.2.4 com os ágares ngm da etapa 5,4 mudado àqueles da etapa 2,13.
  3. Medir índices bioquímicos.
    1. Lave os nematóides fora do ngm ágares com água estéril e recolhê-los em tubos de centrifugação. Liquidar os nematoides durante 30 min e descartar os sobrenadantes. Use os nematóides nas pelotas para a medida do efeito.
    2. Adicione 1 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato gelado (PBS, pH 7,0) nos nematóides (pellets) nos tubos de centrifugação de 1,5 mL para lavar os nematódeos.
    3. Centrifugue a 10.000 x g durante 5 min a 4 ° c e elimine cuidadosamente os sobrenadantes com uma pipeta.
    4. Fixar o congelamento das pelotas por nitrogênio líquido ou em um freezer-80 ° c.
    5. Homogeneizar as pelotas usando pilões em um banho de gelo. Use 200 μL de PBS gelo-frio para lavar os líquidos residuais no pilão no tubo de centrifugação antes de tirar o pilão.
    6. Centrifugue a 10.000 x g por 5 min a 4 ° c novamente e use os sobrenadantes para determinar as atividades ou quantidades de bioquímicos com os kits comerciais (consulte a tabela de materiais para obter detalhes).
    7. Medir as quantidades da proteína total (TP) em amostras, e usar os resultados como o denominador na representação de outros indicadores bioquímicos, de modo que a diferença entre os números de nematódeos entre as amostras pode ser eliminada.
  4. Medir a expressão gênica.
    1. Repita as etapas 7.4.1 para 7.4.4. Isolar o RNA total das amostras de nematódeos usando um kit de extração de RNA comercial (consulte a tabela de materiais para obter detalhes) de acordo com as instruções do fabricante21.
    2. Use o RNA para sintetizar cDNA de acordo com as instruções do fabricante21.
    3. Analise a amostra de cDNA na reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) usando kits SYBR Green RT-PCR de acordo com as instruções do fabricante (ver tabela de materiais)21.
    4. Quantificar os níveis de expressão relativa dos genes escolhidos pelo método 2-δδct 22, e tratar os níveis de expressão do PIB-2 (ou outro gene de referência) como referência negativa.

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Representative Results

Aqui, nós descrevemos protocolos para estudar efeitos de produtos químicos ao longo de gerações usando C. elegans em trans-geracional (TG), exposição multigeracional (MGE) e multigeracional residual (MGR) estudos de efeito. Nossos próprios resultados de pesquisa são apresentados como exemplos. Um estudo apresenta os efeitos do TG de metais pesados no comportamento da locomoção3. Os outros dois estudos apresentam efeitos de MGE e MGR de sulfometoxazol e lindano sobre a reprodução e as medidas de índices bioquímicos e genéticos4,14.

Efeitos de TG de metais pesados no comportamento de locomoção de C. elegans

Os efeitos do TG de cádmio (CD), cobre (UC), chumbo (PB) e zinco (Zn) na freqüência de flexão do corpo (BBF) foram estudados no pai do nematoide (F0) após a exposição materna e sua descendência (T1)3. Os efeitos dos metais no BBF mostraram que as inibições em T1 foram maiores que na F0, demonstrando toxicidades mais severas de metais pesados sobre o comportamento de locomoção na descendência exposta ao embrião do que no pai diretamente exposto. Os efeitos de TG de metais pesados em concentrações ambientalmente realistas demonstraram que a exposição materna pode multiplicar os perigos da poluição de metais pesados em gerações sucedendo. Consulte a Figura 1.

Figure 1
Figura 1 : Os efeitos do cádmio (CD), cobre (UC), chumbo (PB) e zinco (Zn) na freqüência de flexão do corpo do nematoide (F0, em branco) após a exposição pré-natal e sua descendência (T1, sombreado). Barra de erro = erro padrão; * = significativamente diferente do controle, p < 0, 5; # = significativamente diferente da menor concentração, p < 0, 5; + implica efeitos significativamente diferentes na F1 do que na F0, p < 0, 5. Este número foi modificado de Yu et al.3 com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Efeitos do MGR do sulfametoxazol (SMX) sobre o tempo de vida e a reprodução do nematódeo

Os efeitos do MGR do sulfametoxazol (SMX) sobre o tempo de vida e a reprodução do nematódeo14 foram estudados no pai gestante (F0), progênie embrionária exposta (T1), progênie exposta ao germline (T2), primeira prole não exposta (T3) e as três gerações seguintes (T4-T6). Os resultados mostraram que a reprodução (um tamanho total de ninhada como 49% do controle) foi significativamente afetada na exposição germinal (T2), e as toxicidades persistiram em gerações não expostas de T3 a T6 gerações (Figura 2). Nossos achados levantaram novas preocupações quanto às influências de longo prazo dos próprios antibióticos, além de seus efeitos sobre a resistência a antibióticos.

Figure 2
Figura 2 : Tamanho de Brood (em (A), expresso em percentagem de controlo) e reprodução inicial (em (B)) de C. elegans no progenitor exposto e na sua descendência (F0, T1 a T6, da esquerda para a direita em cada concentração). Barra de erro = erro padrão; a = significativamente diferente do controle por ANOVA (p < 0, 5); b = significativamente diferente do controle e da geração anterior na mesma concentração (p < 0, 5); c = significativamente diferente do controle e da menor concentração na mesma geração (p < 0, 5); d = significativamente diferente do controle e da geração anterior na mesma concentração e menor concentração na mesma geração (p < 0, 5); e = significativamente diferente da geração anterior na mesma concentração e menor concentração na mesma geração (p < 0, 5); f = significativamente diferente da geração anterior na mesma concentração (p < 0, 5). Este número foi modificado de Yu et al.14 com permissão.

Efeitos do MGE e do MGR do lindano sobre os índices bioquímicos e genéticos do nematódeo

Os efeitos do MGE e do MGR do lindano (um poluente orgânico persistente [POP]) foram estudados sobre bioquímicos-chave nos metabolismos lipídicos e alterações da expressão genética na via semelhante à insulina4. Os resultados mostraram que o lindano apresentou efeitos obesogênicos com distúrbios na regulação do sinal de insulina (Figura 3). Além disso, as alterações entre o SGK-1 (F0, F3, T1 ' e T3 ') e a sinalização Akt-1 (T1 e T3) indicaram que os nematoides de diferentes gerações de exposição apresentaram diferentes estratégias de resposta para tolerância e evitação.

Figure 3
Figura 3 : Alterações dos níveis de expressão de genes-chave na via de sinal semelhante à insulina em nematoides com diferentes experiências de exposição. →: regulação positiva; symbol : regulação negativa; : expressão acima-Regulamento; : expressão para baixo-regulação. Este número foi modificado de Chen em Al.4 com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A fim conduzir com sucesso o protocolo descrito, as seguintes sugestões devem ser levadas em consideração. Realize as operações experimentais gerais em um ambiente estéril. A operação inadequada pode resultar na contaminação das cepas de e. coli , por exemplo, fungos e ácaros podem dificultar o crescimento normal de C. elegans e, portanto, afetam os resultados experimentais. Na seção que descreve cultivar c. elegans, Observe a escala de crescimento de c. elegans sobre o ngm ágares por olhos nus ou microscópios. Quando a escala de c. elegans no ágar excede 75% na área, ou o tempo da cultura excede uma semana, realize uma nova rodada de inoculação para evitar o excesso de crescimento ou declínio populacional de c. elegans. Antes do processo da sincronização, use um microscópio para observar o crescimento de C. elegans, e continue o processo quando os ovos do nematoide são distribuídos extensamente no ágar. Além disso, se forem utilizados solventes (por exemplo, dimetil sulfóxido [DMSO]), as suas concentrações nas soluções de ações devem ser inferiores a 1% para garantir que as suas concentrações finais não excedam 0,5% (v/v) para evitar os efeitos adversos dos próprios solventes. Em estudos de efeito TG, a duração da exposição acima de 24 h é necessária para garantir que o tempo de exposição abrange a formação de embriões da próxima geração, e a duração deve ser dentro de 96 h para facilitar a separação da geração subsequente. Use pequenas quantidades de nematóides (geralmente dentro de 20) para medir a vida útil e a reprodução. Por outro lado, usar grandes quantidades de nematóides (geralmente mais de 500) para a medição de índices de regulação bioquímica e genética. Assim, a fim de garantir um número suficiente de amostras, realize experimentos preliminares para estimar aproximadamente quantos descendentes os nematoides maduros de F0 podem se reproduzir dentro dos primeiros 24 h desde que iniciam a reprodução. Em seguida, determine o número de nematoides F0 necessários para garantir que haja pelo menos 200 descendentes para os estudos multigeracionais de processo.

Em comparação com relatos anteriores de estudos de TG com C. elegans, o presente protocolo experimental foi mais atencioso com a escolha do estágio de vida. Em C. elegans, os espermas são formados no estágio L4 para fertilizar os oócitos mais tarde formados23. Assim, a exposição que abrange o período de Espermiogênese e oocigênese fornecerá uma janela específica para estudar os efeitos do TG na prole. Os ovos sincronizados com a idade são utilizados para estudos de efeito multigeracional para garantir que a exposição abrange o período global desde o início de cada ciclo de vida. Comparado com estudos multigeracionais anteriores, o presente protocolo experimental facilitou a mensuração de efeitos sobre várias gerações em vez de apenas 1-2 gerações. Além disso, o presente protocolo considerou os efeitos do MGE e do MGR, o que é mais sistemático do que os estudos anteriores que apenas mediram os efeitos do MGE ou MGR.

Notavelmente, ainda existem algumas questões a serem consideradas no presente protocolo experimental. O protocolo atual emprega o selvagem-tipo C. elegans cujo o tempo da geração é ao redor 60 h e o Lifespan é 20 dias. Isso faz com que a duração total da experiência bastante longa (por exemplo, o estudo de efeitos MGE sobre a vida útil mais de 3 gerações requer pelo menos 30 dias). A fim de encurtar o tempo, os pesquisadores podem escolher mutante C. elegans, como os nematoides mutantes de curta duração. Outra questão é o tratamento da matança sobre as bactérias, o estado vivo do que é necessário para manter os nematóides saudáveis 24. Além disso, o processo de matança UV pode introduzir alterações nos produtos químicos25. Portanto, outros tratamentos sobre as bactérias devem ser considerados, e a monitorização cuidadosa das alterações químicas durante o processo de preparação ou exposição pode ser necessária, especialmente para compostos instáveis. Ao mesmo tempo, há limitações no estudo das diferenças sexuais em efeitos tóxicos, porque a maior parte do fato de que C. elegans é hermafrodita. Outras melhorias para investigar a contribuição sexual nos efeitos TG, MGE ou MGR são necessárias. Em síntese, prevemos que o protocolo proposto será um grande significado para o uso de C. elegans para estudar os efeitos de TG, MGE e MGR de tóxicos.

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Disclosures

Os autores são gratos pelas sustentações financeiras pelo projeto principal nacional da ciência e da tecnologia para o controle e o tratamento da poluição da água (2017ZX07201004), e o programa internacional da cooperação da ciência & da tecnologia de China (no. 2016YFE0123700).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 agar powder OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System  Applied Biosystems 
96-well sterile microplate Costar?Corning?America
Autoclave sterilizer Tomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinet LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10043-52-4
centrifuge  5417R Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubes Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 57-88-5
Dimethyl sulfoxide VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America 67-68-5
disodium hydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7558-79-4
ethanol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 64-17-5
Filter Thermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubator YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 16788-57-1
kraft paper
Mcroplate Reader Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TD BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
Pipette Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7447-40-7
potassium dihydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7778-77-0
Qiagen RNeasy kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7647-14-5
sodium hydroxide Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 1310-73-2
sodium hypochlorite solution Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China 7681-52-9
tryptone OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 73049-73-7
yeast extract OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 119-44-8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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