Образование карбоната кальция в присутствии биополимерных добавок

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы описываем протокол для осадков и характеристики кристаллов карбоната кальция, которые образуются в присутствии биополимеров.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Azulay, D. N., Chai, L. Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives. J. Vis. Exp. (147), e59638, doi:10.3791/59638 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Биоминерализация – это образование минералов в присутствии органических молекул, часто связанных с функциональными и/или структурными ролями в живых организмах. Это сложный процесс и, следовательно, простой, in vitro, система необходима, чтобы понять влияние изолированных молекул на процесс биоминерализации. Во многих случаях биоминерализация направлена биополимерами во внеклеточной матрице. Для того, чтобы оценить влияние изолированных биополимеров на морфологию и структуру кальцита in vitro, мы использовали метод диффузии пара для выпадения карбоната кальция, сканирования электронной микроскопии и микро-Раман для характеристики, и ультрафиолетовое (УФ/Вис) абсорбция для измерения количества биополимера в кристаллах. В этом методе мы подвергаем изолированные биополимеры, растворенные в растворе хлорида кальция, газоемкому аммиаку и углекислому газу, которые происходят из разложения твердого карбоната аммония. В условиях, когда растворительный продукт карбоната кальция достигается, образуются карбонат кальция и кристаллы. Карбонат кальция имеет различные полиморфы, которые отличаются по своей термодинамической стабильности: аморфный карбонат кальция, ватерит, арагонит и кальцит. При отсутствии биополимеров, в чистых условиях, карбонат кальция в основном присутствует в форме кальцита, который является наиболее термодинамически стабильной полиморфной карбоната кальция. Этот метод исследует влияние биополимерных добавок на морфологию и структуру кристаллов карбоната кальция. Здесь мы демонстрируем протокол путем изучения внеклеточного бактериального белка TapA, на образование кристаллов карбоната кальция. В частности, мы сосредоточиваемся на экспериментальных методах и методах характеристик, таких как оптическая и электронная микроскопия, а также раманской спектроскопии.

Introduction

Биоминерализация – это образование минералов в присутствии органических молекул, часто связанных с функциональными и/или структурными ролями в живых организмах. Биоминерализация может быть внутриклеточной, как при образовании магнетита внутри магнитотаксических бактерий1,или внеклеточной, так как при образовании карбоната кальция в морском еже шипы2, гидроксиапатит, который связан с коллагеном в кости3 и эмали, что связано с амелологином в зубах4. Биоминерализация – это сложный процесс, который зависит от многих параметров живого организма. Поэтому для упрощения исследуемой системы необходимо оценить влияние отдельных компонентов на процесс. Во многих случаях биоминерализация индуцируется наличием внеклеточных биополимеров. Цель метода, представленного здесь, заключается в следующем: (1) Формирование кристаллов карбоната кальция в присутствии изолированных биополимеров in vitro, используя метод диффузии паров. (2) Изучить влияние биополимеров на морфологию и структуру карбоната кальция.

Три основных метода осаждения карбоната кальция in vitro вприсутствии органических добавок используются 5,6. Первый метод, который мы будем называть методом раствора, основан на смешивании растворимых соли кальция (например, CaCl2) с растворимым солью карбоната (например, карбонат натрия). Процесс смешивания может быть выполнен несколькими способами: внутри реактора стремя клетками, которые разделены пористыми мембранами 7. Здесь каждая из наружных клеток содержит растворимую соль, а центральная клетка содержит раствор с добавкой для тестирования. Кальций и карбонат диффундуют от внешней к средней клетке, в результате чего выпадает менее растворимый карбонат кальция, когда концентрации кальция и карбоната превышают их растворительный продукт, Ksp и «Ca 2-я-К. Дополнительным методом смешивания является двухструйная процедура8. В этом методе каждая растворимые соли вводят из отдельного шприца в перемешиваемый раствор, содержащий добавку, где осаждается карбонат кальция. Здесь, инъекции и, следовательно, скорость смешивания хорошо контролируется, в отличие от предыдущего метода, где смешивание контролируется диффузии.

Второй метод, используемый для кристаллизации CaCO3 является метод Китано9. Этот метод основан на карбонатном/ водородном карбонатном равновесии (2HCO 3- (aq) - Ca 2(aq) Image 1 CaCO3 (ы) Здесь CO2 пузырится в раствор, содержащий CaCO3 в твердой форме, сдвигая равновесие влево и, следовательно, растворяя карбонат кальция. Нерастворенный карбонат кальция фильтруется, а желаемые добавки добавляются в раствор, богатый бикарбонатом. CO2 затем разрешается испаряться, тем самым смещая реакцию вправо, образуя карбонат кальция в присутствии добавок.

Третий метод кристаллизации карбоната кальция, который мы опишите здесь, является метод диффузии пара10. В этой установке органическая добавка, растворенный в растворе хлорида кальция, помещается в закрытую камеру вблизи карбоната аммония в виде порошка. Когда карбонат аммония разлагается на углекислый газ и аммиак, они рассеивается в раствор, содержащий ионы кальция (например, CaCl2),и карбонат кальция осаждается (см. рисунок 1 для иллюстрации). Кристаллы карбоната кальция могут расти медленными осадками или быстрыми осадками. Для медленного выпадения осадков раствор, содержащий добавку в растворе CaCl 2, помещается в раствор рядом с карбонатным порошком аммония. При быстром осадке, подробно описанном в протоколе, как аддитивный раствор, так и карбонат аммония помещаются ближе друг к другу в многослойную пластину. Метод медленного выпадения осадков приведет к уменьшению количества нуклеационных центров и более крупных кристаллов, а быстрые осадки приведут к большему количеству нуклеационных центров и меньших кристаллов.

Описанные выше методы отличаются по своей технической сложности, уровню контроля и скорости процесса выпадения осадков. Метод смешивания требует специальной настройки6 как для двойной струи, так и для трехклеточной системы. В методе смешивания, наличие других растворимых встречных ионов (например, Naq, Cl-)6 неизбежно, в то время как в методе Китано, кальций и (би) карбонат являются единственными ионами в растворе и не связаны с наличием дополнительных встречные ионы (например, Naq,Cl-). Кроме того, метод смешивания требует относительно больших объемов и поэтому не подходит для работы с дорогими биополимерами. Преимущество двойной струи в том, что можно контролировать скорость инъекций раствора и что это быстрый процесс по сравнению с другими методами.

Преимущество метода Китано и метода диффузии пара заключается в том, что образование карбоната кальция контролируется путем диффузии CO2 в/из раствора CaCl2, что позволяет зондировать более медленные процессы ядер и осадков 11 Год , 12. Кроме того, образование карбоната кальция путем распространения CO2 может напоминать процессы кальцификации в vivo13,14,15. В этом методе образуются четко определенные и разделенные кристаллы16. Наконец, влияние одиночных или множественных биополимеров на образование карбоната кальция может быть проверено. Это позволяет систематически изучать влияние ряда концентраций добавок на образование карбоната кальция, а также изучение смесей биополимеров - все это осуществляется контролируемым образом. Этот метод подходит для использования с большим диапазоном концентраций и объемов добавок. Минимальный объем используется примерно 50 Зл, и поэтому этот метод является выгодным, когда есть ограниченное количество доступных биополимеров. Максимальный объем зависит от доступности более крупной скважины, или изобезливки, в которую должна быть вставлена пластина или стакан, содержащий CaCl 2. Метод, описанный ниже, был оптимизирован для работы в 96-хорошо пластины с биополимером выбрали для белка TapA17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Кристаллизация карбоната кальция

  1. Подготовка и оптимизация управления
    1. Приготовьте чистые кусочки стекла. Используйте ту же процедуру очистки для очистки стеклянной посуды.
      1. Используйте алмазную ручку, чтобы орезать куски стеклянного микроскопа слайд так, что они помещаются в колодец 96-хорошо пластины.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 5 мм х 5 мм штук должны в значительной степени подходят.
      2. Поместите стеклянные кусочки в стакан с тройной дистиллированной водой (TDW), так что вода покрывает стеклянные горки и sonicate в ванну звуковой в течение 10 минут.
      3. Декант воды, добавить этанол для покрытия стеклянные горки, и sonicate в ванне звуковой в течение 10 минут.
      4. Высушите горки и стеклянную посуду с потоком азотного газа и поместите их в очиститель воздушной плазмы в течение 10 мин при 130 Вт.
    2. Оптимизируйте концентрацию CaCl 2, используемой в экспериментах по кальцификации, выполненных в желаемых экспериментальных условиях для получения образца, богатого гладкограными кристаллами кальцита (без или, по крайней мере, с дефицитным количеством ватерита кристаллов).
      1. Заполните колодцы по углам 96-колодца пластины с аммония карбонат порошок и печать пластины с использованием алюминиевой фольги; покрыть фольгу парафинаю пленкой. Очистите любой остаточный карбонат аммония с помощью азотного газа.
        ВНИМАНИЕ: карбонат аммония раздражает нос и легкие; использовать только внутри дыма капот.
      2. Подготовьте биржевое решение 0,5 M CaCl2. Это решение запасов будет использоваться для подготовки градиента концентраций растворов CaCl2 в многоскважинной пластине.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для всего эксперимента достаточно стокового раствора объемом 10 мл.
      3. Поместите ранее вырезанные и очищенные кусочки стекла в пять различных колодцев. Используйте ближайшие скважины к центру.
      4. Заполните каждый колодец, несущий стеклянный кусок с 100 зл и л из раствора CaCl2 16. Смешайте TDW и 0.5 M CaCl2 (запас) для достижения возрастающего градиента концентрации CaCl2 в различных скважинах. Если используется хорошая пластина другого размера, отрегулируйте концентрацию CaCl2 для достижения отдельных кристаллов кальцита (шаг 1.1.2.10, и см. раздел Обсуждение).
        ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется увеличивающийся градиент CaCl2 из 10, 20, 30, 40,50 мМ в отдельных скважинах. Для увеличения концентрационного диапазона или количества проверенных концентраций используйте дополнительные скважины.
      5. Проколите иголкой крышку каждой из скважин, содержащих карбонат аммония 3x.
      6. Положите обратно крышку, печать границ с парафина пленки и держать его на 18 градусов по Цельсию в инкубаторе в течение 20 ч.
      7. После инкубации, откройте крышку тщательно внутри дыма капот и удалить кристаллы, сформированные на воде / воздухе интерфейс с петлей.
      8. Используйте пинцет для переноса кусочков стекла в стакан, содержащий двойную дистиллированную воду (DDW). Удалите образцы из стакана и используйте двустороннюю ленту, чтобы зафиксировать кусочки стекла на дно чашки Петри.
      9. Сухая чрезмерная вода, касающаяся границ горки салфетками. Обложка чашку Петри и поместите его в desiccator для 24 ч.
      10. Наблюдайте кристаллы, образовавшиеся на стеклянных кусочках со стереоскопом (3,5-кратным увеличением) и/или вертикально оптическим микроскопом (увеличение 10x-40x). Если решения управления чисты, ромбохедральные кристаллы (скорее всего, кальцит) будут наблюдаться с помощью оптического микроскопа(рисунок 2А).
      11. Если в дополнение к ромбохедральные кристаллы, контроль содержит сферические кристаллы (скорее всего, ватерит, Рисунок 2B), или если сканирование электронного микроскопа (SEM) изображения показывают ромбохедральные кристаллы с грубыми, а не гладкие лица ( Рисунок 3 A,B), повторите протокол кристаллизации, убедившись, что шаг очистки (1.1.1) выполняется правильно. Кроме того, лучше заботиться о том, чтобы в районах на плите не было карбоната аммония, кроме выделенных колодцев. В противном случае, перейдите к следующему шагу.
  2. Кристаллизация в присутствии добавок
    1. Для изучения влияния добавок на кристаллизацию CaCO3,назначайте многослойную пластину, которая содержит (в разных скважинах), решение управления CaCl2 без добавок и решения CaCl2 с добавками. Используйте оптимальную концентрацию CaCl2, найденную в разделе 1.1.2 для эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол ниже использует оптимальные условия, как те, которые сообщили в предыдущем исследовании16.
    2. Повторите шаг 1.1.2.2.
    3. Поместите порошок карбоната аммония в углах пластины, как описано в шаге 1.1.2.1.
    4. В каждой скважине, где будут осадки, поместите стеклянный кусок, который был вырезан и очищен, как описано в разделе 1.1.1.
    5. Для подготовки контрольных скважин, пипетка 90 Зл ТДВ в контрольные скважины. Подготовьте по крайней мере одну репликацию каждой скважины, включая элемент управления. Если используемая добавка находится в буферном растворе, то пипетка 90 л буфера вместо воды TDW.
    6. Приготовьте аддитивные колодцы. Повторите шаг 1.2.5, добавив 90 зл аддитивного раствора в воду. Если добавка находится в буфере (вместо TDW), предварительно отрегулируйте концентрацию добавки с буфером, чтобы соответствовать желаемой конечной концентрации. Сохранить общий объем 90 л; pipette сперва добавка, после этого буфер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация 10 мкм белка TapA в 100 мМ NaCl, 25 мм Tris pH 8.0 буфер16 используется в этом протоколе.
    7. Добавьте 10 кл/л из 0,5 М CaCl2 бульонного раствора (подготовленного в шаге 1.2.2) как к элементам управления, так и к добавкам, содержащим скважины, чтобы достичь конечной концентрации 50 мМ CaCl2.
    8. Повторите шаги 1.1.2.5-1.1.2.9.

2. Характеристика кристаллов карбоната кальция

  1. С помощью сканирующего электронного микроскопа наблюдайте за кристаллами карбоната кальция, образующиеся в присутствии добавок с более высоким разрешением, чем полученные с помощью оптической микроскопии (см. шаг 1.1.2.10).
    1. Смонтировать стеклянные кусочки, содержащие кристаллы, на алюминиевой заглушке с двусторонней углеродной лентой.
    2. Пальто со слоем Au/Pd для 40-50 с.
    3. Приобретайте изображения при разгонном напряжении 5 кВ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3А показано репрезентативное изображение SEM кристаллов карбоната кальция, образовавшихся в ходе надлежащего эксперимента по контролю, в то время как на рисунке 4 показаны репрезентативные изображения кристаллов карбоната кальция, образовавшихся в присутствии белка TapA .
  2. Выполните микро-Раман спектроскопии для определения кальция карбонат ныхполиморфов формируется. Micro Raman позволяет сбор спектра Рамына из одиночных кристаллов, а не из целого порошка.
    1. Используйте 20x цель микроскопа, чтобы выбрать кристалл интереса.
    2. Соберите спектр Рамына в диапазоне от 100 до 3200 см-1 с помощью лазера аргона 514 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 5 показаны репрезентативные спектры кальцита (A) и ватерита (B). Для спектра арагонита, обратитесь к ссылке18.
  3. Количественная оценка массы добавок в осаждается осажданием CaCO3
    1. Проверить/измерить коэффициент вымирания (к) используемой добавки. Коэффициент вымирания белка может быть дан онлайн-серверами19. Если коэффициент вымирания неизвестен, измерьте абсорбцию добавки в разных концентрациях, потяните абсорбцию против концентрации и вычислите коэффициент вымирания со склона кривой.
    2. Взвешивание стеклянных частей, где кристаллы образуются, предпочтительно использовать микробаланс.
    3. Очистите кристаллы от стекла в 1,2 мл 0,1 м уксусной кислоты раствор, вихрь и sonicate образца. Храните образец при комнатной температуре 24 ч.
      ВНИМАНИЕ: Ацетическая кислота очень опасна при кожаном или зрительном контакте; с осторожностью и распоряжаться правилами.
    4. Взвесьте стеклянную горку после соскабливания кристаллов.
    5. Измерьте спектр УФ/висабсоциации (A) раствора. Если добавка является белком, измерьте абсорбцию на уровне 280 нм и вычислите его концентрацию (C),используя уравнение Пива-Ламберта:
      Equation 1
      где l оптический путь внутри cuvette.
    6. Используйте концентрацию (C), найденную в 2.3.5, и объем, используемый(V й 1,2 мл) для расчета массы (м) добавок в/на кристаллах. Если концентрация находится в мг/мл, используйте уравнение C и V и m.
      1. Если концентрация находится в мол / L, а затем рассчитать моли (n) применения C и V n . Затем используйте молекулярный вес (Mw) для расчета массы (м) добавок (м и п. МВ).
    7. Рассчитайте процент веса добавок в / на Equation 2 кристаллы с помощью уравнения: , где м масса добавок, и ММс является масса кристаллов карбоната кальция, которые были отменены со стекла Кусок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Схема экспериментального набора показана на рисунке 1. Вкратце, метод диффузии используется для того, чтобы сформировать кристаллы карбоната кальция в 96-колодцах пластин и проверить влияние биополимеров на морфологию и структуру кристаллов карбоната кальция. В этих экспериментах карбонат аммония разлагается на аммиак и CO2,которые рассеивается в растворы карбоната кальция, что приводит к образованию кристаллов карбоната кальция (Рисунок 1 и рисунок2 ).

Эффект биополимеров оценивается путем сравнения кристаллов карбоната кальция, образовавшихся с добавками и без их.). До добавления добавок выбирается оптимизированная концентрация карбоната кальция и проверяется чистота растворов и стеклянной посуды. Рисунок 2 A показывает репрезентативное изображение контрольного эксперимента, где образуются различные ромбохедральные кристаллы карбоната кальция. Эти кристаллы, скорее всего, кальцит (см. Рисунок 5). Если растворы или пластикилиили или стеклянную посуду не были должным образом очищены, то образуются сферические кристаллы(рисунок 2B,отмеченный красными кругами), в дополнение к кристаллам ромбохедрала. Сферические кристаллы, скорее всего, ватерит (см. Рисунок 5). Дополнительным показателем для использования надлежащих условий является плавность кальцитовых граней в ходе контрольного эксперимента. Это можно наблюдать с SEM, как показано на рисунке 3. Рисунок 3 А показывает надлежащий контроль с гладкими кальцитовыми гранями, в то время как на рисунке 3B показаны кристаллы кальцита с лицами, состоящими из ступеней. Сферические кристаллы здесь ватерит. Кристаллы управления должны быть разделены и гладкой граненой, так что влияние добавок на кристаллическую морфологию ясно.

Чтобы продемонстрировать влияние биополимера на морфологию карбоната кальция, мы использовали здесь белок TapA. На рисунке 4 показаны кристаллы карбоната кальция, образуемые в присутствии TapA в растворе. Кристаллы отличаются от контрольных кристаллов. Они образуют сложную сферическую сборку карбоната кальция, состоящую из нескольких микрокристаллов кальцита (см. Рамане в рисунке 5). Одним из методов, характеризующих структуру кристаллов, является раманская спектроскопия. На рисунке 5 показаны типичные спектры кальцита(рисунок 5А) и ватерита (рисунок5В), взятые из успешных (A) и неудачных (B) контрольных экспериментов. Типичные пики абсорбции20 находятся в диапазоне от 100–400 смдо -1 (режимы решетки), пик на уровне 710 см-1 (симметричный изгиб CO32-) и на 1090 см-1 (симметричное растяжение CO3 2-). Обратите внимание на сплит Смены Рамына на 1080 см-1, что является наиболее очевидной характеристикой ватерита21. Ссылайтесь на ссылку22 для полного спектра арагонита. Рамановый спектр кристаллов, образованных в присутствии TapA, похож на спектр кальцита(рисунок 5А). В тех случаях, когда появляются дополнительные пики, которые не соответствуют единому спектру одного полиморфа карбоната кальция, или их комбинации, они могут быть отнесены к избытку хлорида кальция, который не был тщательно промыт в шаге 1.1.2.8.

В заключительном разделе протокола мы измерили процент (вес/вес) органического содержания внутри или на кристаллах карбоната кальция. Кристаллы растворялись в уксусной кислоте, и биополимер был выпущен в раствор. В тех случаях, когда биополимер имеет характерный спектр абсорбции, его концентрация в растворе может быть определена. В случае белков, содержащих ароматические побочные группы, как в тематическом исследовании здесь TapA, абсорбция на 280 нм используется. Спектр абсорбции TapA, измеренный после растворения кристаллов в кислоте, показан на рисунке 6 (зеленый) вместе со спектром контроля (кислотно-растворенные кристаллы карбоната кальция без добавки; черный). Используя закон Пив-Ламберта (см. шаг 2.3.5) и используя коэффициент вымирания 29700 М-1 см-1, мы обнаружили, что процент массы TapA составил 1,8% и 0,2%. Измерение абсорбции раствора после растворения кристалла в кислоте возможно, когда биополимеры не агрегируются при низком рН. Нулевой сигнал о поглощении раствора, содержащего добавку, свидетельствует о его агрегации. В этом случае для оценки массы добавок внутри/на кристаллах могут использоваться различные методы анализа, такие как тепловой гравитационный анализ (ТГА).

Figure 1
Рисунок 1 : Схематическое описание метода диффузии быстрого пара для образования кристаллов карбоната кальция. Содержащая кальций растворительная соль (например, хлорид кальция) помещается рядом с карбонатным порошком аммония. Здесь мы показываем две скважины в 96-колодцевой пластине. Пластина затем герметичен, и карбонат аммония разлагается в аммиак и углекислый газ, которые рассеивают в кальциево-содержащих хорошо, в результате чего осадки кристаллов карбоната кальция (показано здесь SEM изображение кальцитового кристалла). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Оптический микроскоп изображения кристаллов карбоната кальция. Чистый контроль содержит в основном кальцит, который характеризуется ромбохедральными кристаллами(A). Когда контрольный образец включает в себя сферические кристаллы(например, те, которые отмечены красным кругом) ( B), повторите протокол очистки, как это предлагается в разделе 1.1.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Сканирование электронных микрографов кристаллов карбоната кальция, образовавшихся в двух контрольных экспериментах. (A) Изображение образца, который содержит в основном ромбохедральные кристаллы (кальцит). (B) Микрограф образца со сломанными кальцитовыми гранями и сферическими кристаллами, которые, скорее всего, ватерит. В этом случае контрольные эксперименты должны быть повторены. Эта цифра была изменена с Azulay и др.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 : SEM изображения кристаллов кальцита, образуется в присутствии белка TapA. Шкала баров представляют 50 мкм (A) и 10 мкм (B), соответственно. Эта цифра была изменена с Azulay и др.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5 : Раманские спектры двух полиморфов карбоната кальция. (A) Кальцит. (B) Ватерит. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6 : спектр абсорбции UV/vis TapA (зеленый) и буферный раствор (100 мМ NaCl, 25 мм Tris pH 8.0; черный). Абсорбция была использована для расчета концентрации TapA в кристаллах карбоната кальция, после их растворения в кислоте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанный здесь метод направлен на формирование кристаллов карбоната кальция в присутствии органических добавок и оценку влияния органических биополимеров на морфологию и структуру кристаллов карбоната кальция in vitro. Метод основан на сравнении кристаллов, образуювшихся в присутствии органических добавок к кристаллам кальцита, образовавшихся в ходе контрольного эксперимента. Мы показали, как использовать метод диффузии для формирования кристаллов карбоната кальция, как охарактеризовать их морфологию с помощью оптической и электронной микроскопии, как охарактеризовать их структуру с помощью Раманской спектроскопии, и как определить органическое содержание (вес/вес) кристаллов.

Мы описали протокол, который мы использовали для оценки влияния бактериального внеклеточного белка, TapA, на морфологию и структуру карбоната кальция, но протокол может быть израсходован на любой другой полимер, который биологически очищен или синтезирован. В дополнение к эффекту одного биополимера, этот метод может быть использован со смесями биополимеров для того, чтобы оценить любые взаимности между различными полимерами в их влиянии на выпадение карбоната кальция. Мы ограничили экспериментальную установку 96-хорошо пластины; однако возможна любая другая установка, в которой карбонатные растворы кальция расположены и физически отделены от источника карбоната аммония (т.е. растворы и порошок помещаются в герметичную сосуду). Типичными используемыми сосудами являются многоскважинные пластины, а типичный диапазон концентрации 10-50 мМ используется для экспериментальной настройки с 96-колодскими пластинами10,16,23. Также можно использовать запечатанный стакан или обезопадок.

Этот метод прост в использовании и совместим с низкими концентрациями и низкими объемами биополимерных добавок. Работа в многоскважинной пластине позволяет скрининг нескольких параметров одновременно в одном эксперименте с несколькими скважинами. Этот метод может быть чувствителен к относительному положению карбонатных скважин кальция в отношении положения карбоната аммония. Поэтому необходимо всегда использовать скважины в одном и том же положении в многоскважинной плите, а также проверить, что изменение расположения скважин не влияет на результаты. Как правило, использование достаточно большого расстояния между скважинами, где проводятся эксперименты, и карбонатным порошком аммония гарантирует, что результаты воспроизводимы. Кроме того, крайне важно скорректировать концентрацию раствора CaCl2 таким образом, чтобы в ходе контрольного эксперимента образовались отдельные кристаллы, как описано в разделе 1.1.2. Концентрация добавок также должна быть оптимизирована, чтобы превысить минимальную концентрацию ниже, которая не наблюдается. Обратите внимание, что метод очень чувствителен к концентрации добавок; различные концентрации добавок могут вызвать различное влияние на морфологию и структуру кристаллов карбоната кальция24.

Одним из основных ограничений этого метода является то, что аммиак и CO2 как диффундировать в растворы теста хлорида кальция и, следовательно, существует плохой контроль рН на протяжении всего эксперимента. В результате распространения аммиака, рН в растворе увеличивается (когда аммиак становится аммонием), как показано в уравнениях равновесия5,6 ((NH4)2CO3 (s) 2NH 3(г) 2 O (l), NH3 (aq) Image 1 CaCO3 (ы) и H2O (l)) и это способствует образованию карбоната кальция. 

По сравнению с дополнительными методами, описанными во введении, этот метод технически прост. Из-за медленного процесса осадков, рост кристалла может следовать в режиме реального времени, используя абсорбцию или рассеяние методы из прозрачной мульти-хорошо техники. Кроме того, для того, чтобы следовать кинетике роста кристалла, можно также исследовать кристаллическую морфологию и структуру в разных точках времени, а не после 20 часов, как это выполняется в нашем исследовании. Этот метод может быть расширен для изучения осадков других солей карбоната, несущих достаточно небольшой Ksp, таких как магний, барий и карбонат кадмия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить профессора Лию Аддади, профессора Джонатана Эреза и д-ра Яэля Полити за плодотворные дискуссии. Это исследование было поддержано Израильским научным фондом (ISF), грантом 1150/14.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Gadot 64-19-7
Ammonium carbonate Sigma-Aldrich 506-87-6
Calcium chloride dihydrate Merck KGaA 10035-04-8
Ethanol Absolute Gadot 64-17-5
Micro-Raman Renishaw inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope
Microscope Nikon Eclipse 90i model
Nis elements Br software Nikon For microscope imaging
Scanning Electron Microscope ThermoFisher Scientific FEI Sirion microscope
Spectrophotometer JASCO V-670 model
Sputter coater Polaron SC7640 model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190, (4212), 377-379 (1975).
  2. Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase. Science. 306, (5699), 1161-1164 (2004).
  3. Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. Journal of Structural Biology. 183, (2), 258-269 (2013).
  4. Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. Biomineralization: from nature to application. 12, John Wiley & Sons. (2008).
  5. Nielsen, M. H., Lee, J. R. I. Methods in Enzymology. De Yoreo, J. J. 532, Academic Press. 209-224 (2013).
  6. Page, M. G., Cölfen, H. Improved Control of CaCO3 Precipitation by Direct Carbon Dioxide Diffusion: Application in Mesocrystal Assembly. Crystal Growth & Design. 6, (8), 1915-1920 (2006).
  7. Wang, H., Huang, W., Han, Y. Diffusion-reaction compromise the polymorphs of precipitated calcium carbonate. Particuology. 11, (3), 301-308 (2013).
  8. Sedlák, M., Antonietti, M., Cölfen, H. Synthesis of a new class of double-hydrophilic block copolymers with calcium binding capacity as builders and for biomimetic structure control of minerals. Macromolecular Chemistry and Physics. 199, (2), 247-254 (1998).
  9. Kitano, Y., Park, K., Hood, D. W. Pure aragonite synthesis. Journal of Geophysical Research. 67, (12), 4873-4874 (1962).
  10. Politi, Y., Mahamid, J., Goldberg, H., Weiner, S., Addadi, L. Asprich mollusk shell protein: in vitro experiments aimed at elucidating function in CaCO3 crystallization. CrystEngComm. 9, (12), 1171-1177 (2007).
  11. Gehrke, N., Cölfen, H., Pinna, N., Antonietti, M., Nassif, N. Superstructures of Calcium Carbonate Crystals by Oriented Attachment. Crystal Growth & Design. 5, (4), 1317-1319 (2005).
  12. Rudloff, J., et al. Double-Hydrophilic Block Copolymers with Monophosphate Ester Moieties as Crystal Growth Modifiers of CaCO3. Macromolecular Chemistry and Physics. 203, (4), 627-635 (2002).
  13. Boquet, E., Boronat, A., Ramos-Cormenzana, A. Production of Calcite (Calcium Carbonate) Crystals by Soil Bacteria is a General Phenomenon. Nature. 246, 527 (1973).
  14. Cohen, A. L., McConnaughey, T. A. Geochemical Perspectives on Coral Mineralization. Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54, (1), 151-187 (2003).
  15. Erez, J. Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons. Nature. 273, 199 (1978).
  16. Azulay, D. N., et al. Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals. Crystal Growth & Design. 18, (9), 5582-5591 (2018).
  17. Abbasi, R., et al. The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein. ChemBioChem. (2018).
  18. Gauldie, R. W., Sharma, S. K., Volk, E. Micro-raman spectral study of vaterite and aragonite otoliths of the coho salmon, Oncorhynchus kisutch. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 118, (3), 753-757 (1997).
  19. Gasteiger, E., et al. The Proteomics Protocols Handbook. Springer. 571-607 (2005).
  20. Gunasekaran, S., Anbalagan, G., Pandi, S. Raman and infrared spectra of carbonates of calcite structure. Journal of Raman Spectroscopy. 37, (9), 892-899 (2006).
  21. Trushina, D. B., Bukreeva, T. V., Kovalchuk, M. V., Antipina, M. N. CaCO3 vaterite microparticles for biomedical and personal care applications. Materials Science and Engineering: C. 45, 644-658 (2014).
  22. Weiss, I. M., Tuross, N., Addadi, L., Weiner, S. Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite. Journal of Experimental Zoology. 293, (5), 478-491 (2002).
  23. Yamamoto, Y., Nishimura, T., Saito, T., Kato, T. CaCO3/chitin-whisker hybrids: formation of CaCO3 crystals in chitin-based liquid-crystalline suspension. Polymer Journal. 42, 583 (2010).
  24. Magnabosco, G., et al. Insights on the interaction of calcein with calcium carbonate and its implications in biomineralization studies. CrystEngComm. 20, (30), 4221-4224 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics