Formation de carbonate de calcium en présence d'additifs biopolymères

Chemistry

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Summary

Nous décrivons un protocole pour la précipitation et la caractérisation des cristaux de carbonate de calcium qui se forment en présence de biopolymères.

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Azulay, D. N., Chai, L. Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives. J. Vis. Exp. (147), e59638, doi:10.3791/59638 (2019).

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Abstract

La biominéralisation est la formation de minéraux en présence de molécules organiques, souvent liées à des rôles fonctionnels et/ou structurels dans les organismes vivants. Il s'agit d'un processus complexe et, par conséquent, un système simple, in vitro, est nécessaire pour comprendre l'effet des molécules isolées sur le processus de biominéralisation. Dans de nombreux cas, la biominéralisation est dirigée par des biopolymères dans la matrice extracellulaire. Afin d'évaluer l'effet des biopolymères isolés sur la morphologie et la structure de la calcite in vitro, nous avons utilisé la méthode de diffusion de vapeur pour la précipitation du carbonate de calcium, la microscopie électronique à balayage et le micro Raman pour la caractérisation, et l'absorption ultraviolet-visible (UV/Vis) pour mesurer la quantité d'un biopolymère dans les cristaux. Dans cette méthode, nous exposons les biopolymères isolés, dissous dans une solution de chlorure de calcium, à l'ammoniac gazeux et au dioxyde de carbone qui proviennent de la décomposition du carbonate d'ammonium solide. Dans les conditions où le produit de solubilité du carbonate de calcium est atteint, le carbonate de calcium se précipite et des cristaux sont formés. Le carbonate de calcium a différents polymorphes qui diffèrent dans leur stabilité thermodynamique : carbonate de calcium amorphe, vaterite, aragonite et calcite. En l'absence de biopolymères, dans des conditions propres, le carbonate de calcium est principalement présent sous forme de calcite, qui est le polymorphe thermodynamiquement stable de carbonate de calcium. Cette méthode examine l'effet des additifs biopolymères sur la morphologie et la structure des cristaux de carbonate de calcium. Ici, nous démontrons le protocole par l'étude d'une protéine bactérienne extracellulaire, TapA, sur la formation de cristaux de carbonate de calcium. Plus précisément, nous nous concentrons sur la mise en place expérimentale, et les méthodes de caractérisation, telles que la microscopie optique et électronique ainsi que la spectroscopie Raman.

Introduction

La biominéralisation est la formation de minéraux en présence de molécules organiques, souvent liées à des rôles fonctionnels et/ou structurels dans les organismes vivants. La biominéralisation peut être intracellulaire, comme dans la formation de magnétite à l'intérieur des bactéries magnétotaxiques1, ou extracellulaires, comme dans la formation de carbonate de calcium dans les pointes d'oursins2, d'hydroxyapatite qui est liée au collagène dans os3 et de l'émail qui est associé à l'amélogénine dans les dents4. La biominéralisation est un processus complexe qui dépend de nombreux paramètres dans l'organisme vivant. Par conséquent, afin de simplifier le système à l'étude, il est nécessaire d'évaluer l'effet des composants distincts sur le processus. Dans de nombreux cas, la biominéralisation est induite par la présence de biopolymères extracellulaires. Le but de la méthode présentée ici est le suivant: (1) Pour former des cristaux de carbonate de calcium en présence de biopolymères isolés in vitro, en utilisant une méthode de diffusion de vapeur. (2) Étudier l'effet des biopolymères sur la morphologie et la structure du carbonate de calcium.

Trois méthodes principales pour précipiter le carbonate de calcium in vitro en présence d'additifs organiques sont utilisées5,6. La première méthode, que nous appellerons la méthode de solution, est basée sur le mélange d'un sel soluble de calcium (par exemple, CaCl2) avec un sel soluble de carbonate (par exemple, carbonate de sodium). Le processus de mélange peut être effectué de plusieurs façons: à l'intérieur d'un réacteur avec trois cellules qui sont séparées par des membranes poreuses7. Ici, chacune des cellules extérieures contient un sel soluble et la cellule centrale contient une solution avec l'additif à tester. Calcium et carbonate diffusent de l'extérieur à la cellule moyenne, ce qui entraîne la précipitation du carbonate de calcium moins soluble lorsque les concentrations de calcium et de carbonate dépassent leur produit de solubilité, Ksp -[Ca2'][CO 3) 2-]. Une méthode de mélange supplémentaire est la procédure de double-jet8. Dans cette méthode, chaque sel soluble est injecté à partir d'une seringue séparée à une solution agitée contenant l'additif, où le carbonate de calcium se précipite. Ici, l'injection et donc le taux de mixage est bien contrôlé, contrairement à la méthode précédente où le mélange est contrôlé par diffusion.

La deuxième méthode utilisée pour cristalliser CaCO3 est la méthode Kitano9. Cette méthode est basée sur l'équilibre carbonate/hydrogène carbonate (2HCO3- (aq) ' Ca 2' (aq) Image 1 CaCO 3(s) ' CO 2(g) ' H2O (l)). Ici, le CO2 est regroupé dans une solution contenant CaCO3 sous une forme solide, déplaçant l'équilibre vers la gauche et dissolvant ainsi le carbonate de calcium. Le carbonate de calcium non dissous est filtré et les additifs désirés sont ajoutés à la solution riche en bicarbonate. Le CO2 est ensuite autorisé à s'évaporer, déplaçant ainsi la réaction vers la droite, formant du carbonate de calcium en présence des additifs.

La troisième méthode de cristallisation du carbonate de calcium, que nous décrirarons ici, est la méthode de diffusion de vapeur10. Dans cette configuration, l'additif organique, dissous dans une solution de chlorure de calcium, est placé dans une chambre fermée près du carbonate d'ammonium sous forme de poudre. Lorsque la poudre de carbonate d'ammonium se décompose en dioxyde de carbone et en ammoniac, elle se diffuse dans la solution contenant des ions de calcium (p. ex. CaCl2), et le carbonate de calcium est précipité (voir la figure 1 pour illustrer). Les cristaux de carbonate de calcium peuvent se développer par des précipitations lentes ou par des précipitations rapides. Pour les précipitations lentes, une solution contenant l'additif dans la solution CaCl2 est placée dans un dessiccateur à côté de la poudre de carbonate d'ammonium. Dans les précipitations rapides, décrites en longueur dans le protocole, la solution additive et le carbonate d'ammonium sont rapprochés dans une plaque multi-puits. La méthode des précipitations lentes produira moins de centres de nucléation et de cristaux plus gros, et les précipitations rapides se traduiront par plus de centres de nucléation et de cristaux plus petits.

Les méthodes décrites ci-dessus diffèrent dans leur complexité technique, dans le niveau de contrôle et dans le taux du processus de précipitation. La méthode de mélange nécessite une configuration spéciale6 pour le double jet et le système à trois cellules. Dans la méthode de mélange, la présence d'autres contre-ions solubles (p. ex., Na,Cl-) 6 est inévitable, alors que dans la méthode Kitano, le calcium et le carbonate (bi) sont les seuls ions en solution et il n'implique pas la présence de contre ions (p. ex., Na,Cl-). En outre, la méthode de mélange nécessite des volumes relativement importants et, par conséquent, il n'est pas approprié pour travailler avec des biopolymères coûteux. L'avantage du double jet est qu'il est possible de contrôler le taux d'injection de solution et qu'il s'agit d'un processus rapide par rapport à d'autres méthodes.

L'avantage de la méthode Kitano et de la méthode de diffusion de vapeur est que la formation de carbonate de calcium est contrôlée par la diffusion du CO2 dans/hors d'une solution CaCl2, permettant ainsi de sonder des processus de nucléation et de précipitation plus lents 11 Ans, états-unis ( , 12. En outre, la formation de carbonate de calcium par diffusion du CO2 peut ressembler à des processus de calcification in vivo13,14,15. Dans cette méthode, des cristaux bien définis et séparés sont formés16. Enfin, l'effet d'un ou plusieurs biopolymères sur la formation de carbonate de calcium peut être testé. Cela permet une étude systématique de l'effet d'une série de concentrations additives sur la formation de carbonate de calcium ainsi qu'une étude des mélanges de biopolymères - tous effectués de manière contrôlée. Cette méthode est adaptée à une utilisation avec une large gamme de concentrations et de volumes d'additifs. Le volume minimal utilisé est d'environ 50 l et donc cette méthode est avantageuse lorsqu'il y a une quantité limitée de biopolymères disponibles. Le volume maximal dépend de l'accessibilité d'une plus grande plaque de puits, ou du dessiccateur dans lequel la plaque ou le bécher contenant CaCl2 doivent être insérés. La méthode décrite ci-dessous a été optimisée pour travailler dans une plaque de 96 puits avec un biopolymère choisi pour être la protéine TapA17.

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Protocol

1. Cristallisation de carbonate de calcium

  1. Préparation et optimisation du contrôle
    1. Préparer des morceaux de verre propres. Utilisez la même procédure de nettoyage pour nettoyer la verrerie.
      1. Utilisez un stylo diamant pour couper des morceaux d'une lame de microscope en verre afin qu'ils s'adaptent dans un puits d'une plaque de 96 puits.
        REMARQUE : Les pièces de 5 mm x 5 mm doivent s'adapter en grande partie.
      2. Placez les morceaux de verre dans un bécher avec de l'eau distillée triple (TDW) de sorte que l'eau couvre les lames de verre et sonicate dans un sonicator de bain pendant 10 min.
      3. Décant l'eau, ajouter de l'éthanol pour couvrir les lames de verre, et sonicate dans un sonicator de bain pendant 10 min.
      4. Séchez les toboggans et la verrerie avec un jet de gaz azoté et placez-les dans un nettoyant à plasma d'air pendant 10 min à 130 W.
    2. Optimiser la concentration du CaCl2 utilisé dans les expériences de calcification effectuées dans les conditions expérimentales souhaitées pour obtenir un échantillon riche en cristaux de calcite à facettes lisses (sans ou du moins avec un nombre limité de vaterite cristaux).
      1. Remplir les puits aux coins d'une plaque de 96 puits avec de la poudre de carbonate d'ammonium et sceller la plaque à l'aide de papier d'aluminium; couvrir le papier d'aluminium avec du film de paraffine. Nettoyer tout carbonate résiduel d'ammonium à l'aide de gaz azoté.
        CAUTION : Le carbonate d'ammonium irrite le nez et les poumons ; utiliser uniquement à l'intérieur du capot de fumée.
      2. Préparer une solution d'actions de 0,5 M CaCl2. Cette solution de stock sera utilisée pour préparer un gradient de concentrations de solutions CaCl2 dans la plaque multi-puits.
        REMARQUE : Une solution de stock de 10 ml est suffisante pour toute l'expérience.
      3. Placez les morceaux de verre préalablement coupés et nettoyés dans cinq puits différents. Utilisez les puits les plus proches du centre.
      4. Remplir chaque puits portant un morceau de verre avec 100 l d'une solution CaCl2 16. Mélanger TDW et 0,5 M CaCl2 (stock) pour atteindre un gradient de concentration croissant de CaCl2 à travers les différents puits. Si une plaque de puits de taille différente est utilisée, ajuster la concentration de CaCl2 pour obtenir des cristaux de calcite séparés (étape 1.1.2.10, et voir la section Discussion).
        REMARQUE : Un gradient caCl2 croissant de 10, 20, 30, 40 ,50 mM de concentrations dans des puits séparés est utilisé dans ce protocole. Pour augmenter la plage de concentration ou le nombre de concentrations testées, utilisez d'autres puits.
      5. Perforer le couvercle de chacun des puits contenant du carbonate d'ammonium 3x avec une aiguille.
      6. Remettre le couvercle, sceller les bordures avec du film de paraffine et le garder à 18 oC dans un incubateur pendant 20 h.
      7. Après l'incubation, ouvrez soigneusement le couvercle à l'intérieur d'une hotte de fumée et retirez les cristaux formés à l'interface eau/air avec une boucle.
      8. Utilisez une pince à épiler pour transférer les morceaux de verre dans un bécher contenant de l'eau double distillée (DDW). Retirer les échantillons du bécher et utiliser un ruban à double face pour fixer les morceaux de verre sur le fond du plat Petri.
      9. Sécher l'eau excessive touchant les bordures de la glissière avec des lingettes de tissu. Couvrir le plat de pétri et le placer dans un dessiccateur pendant 24 h.
      10. Observez les cristaux formés sur les morceaux de verre avec un stéréoscope (grossissement de 3,5x) et/ou un microscope optique droit (grossissement 10x-40x). Si les solutions de contrôle sont propres, des cristaux rhombohédraux (probablement de la calcite) seront observés au microscope optique (Figure 2A).
      11. Si en plus des cristaux rhombohédraux, le contrôle contient des cristaux sphériques (probablement vaterite, Figure 2B), ou si les images du microscope électronique à balayage (SEM) montrent des cristaux rhombohédraux avec des visages rugueux plutôt que lisses ( Figure 3 A,B), répéter le protocole de cristallisation en s'assurant que l'étape de nettoyage (1.1.1) est effectuée correctement. En outre, faites mieux attention qu'il n'y a pas de carbonate d'ammonium dans les zones de la plaque autres que les puits dédiés. Sinon, passez à l'étape suivante.
  2. Cristallisation en présence des additifs
    1. Pour étudier l'effet des additifs sur la cristallisation de CaCO3, mettre en place une plaque multi-puits qui contient (dans différents puits), une solution de contrôle CaCl2 sans les additifs, et CaCl2 solutions avec les additifs. Utilisez la concentration optimale de CaCl2 trouvée dans la section 1.1.2 pour l'expérience.
      REMARQUE : Le protocole ci-dessous utilise des conditions optimales comme celles rapportées dans une étude précédente16.
    2. Répéter l'étape 1.1.2.2.
    3. Placer la poudre de carbonate d'ammonium dans les coins de la plaque tel que décrit à l'étape 1.1.2.1.
    4. Dans chaque puits où les précipitations se produiront, placez un morceau de verre qui a été coupé et nettoyé tel que décrit à la section 1.1.1.
    5. Pour préparer les puits de contrôle, pipette 90 'L de TDW dans les puits de commande. Préparer au moins une réplique de chaque puits, y compris le contrôle. Si l'additif utilisé se trouve dans une solution tampon, puis pipette 90 l de tampon au lieu de l'eau TDW.
    6. Préparer les puits contenant des additifs. Répétez l'étape 1.2.5 en ajoutant 90 L de la solution additive dans l'eau. Si l'additif est en mémoire tampon (au lieu de TDW), préajuster la concentration de l'additif avec un tampon pour répondre à la concentration finale désirée. Conserver un volume total de 90 l; pipette d'abord l'additif, puis le tampon.
      REMARQUE : Une concentration finale de 10 M de la protéine TapA dans 100 mM NaCl, 25 mM Tris pH 8.0 tampon16 est utilisée dans ce protocole.
    7. Ajouter 10 L de la solution de stock de 0,5 M CaCl2 (préparée à l'étape 1.2.2) aux puits de commande et contenant des additifs pour atteindre une concentration finale de 50 mM CaCl2.
    8. Répétez les étapes 1.1.2.5-1.1.2.9.

2. Caractérisation des cristaux de carbonate de calcium

  1. À l'aucun-chef, observez les cristaux de carbonate de calcium formés en présence des additifs à une résolution plus élevée que celle obtenue par microcopie optique (voir l'étape 1.1.2.10).
    1. Montez les morceaux de verre contenant les cristaux sur un talon d'aluminium avec du ruban de carbone recto-verso.
    2. Enrober d'une couche d'Au/Pd pour 40-50 s.
    3. Acquérir les images à 5 kV tension d'accélération.
      REMARQUE : La figure 3A montre une image SEM représentative des cristaux de carbonate de calcium formés dans une expérience de contrôle appropriée, tandis que la figure 4 montre des images représentatives de cristaux de carbonate de calcium formés en présence de la protéine TapA .
  2. Effectuez une spectroscopie micro-Raman pour déterminer les polymorphes de carbonate de calcium formés. Micro Raman permet la collecte d'un spectre Raman à partir de cristaux simples plutôt que d'une poudre entière.
    1. Utilisez un objectif 20x du microscope pour choisir le cristal d'intérêt.
    2. Recueillir le spectre Raman dans une gamme de 100 à 3200 cm-1 à l'aide d'un laser argon de 514 nm.
      REMARQUE : La figure 5 montre des spectres représentatifs de calcite (A) et de vaterite (B). Pour le spectre de l'aragonite, se référer à la référence18.
  3. Quantification du pourcentage de masse des additifs dans le CaCO3 précipite
    1. Vérifier/mesurer le coefficient d'extinction de l'additif utilisé. Le coefficient d'extinction d'une protéine peut être donné par les serveurs en ligne19. Si le coefficient d'extinction est inconnu, mesurez l'absorption de l'additif à différentes concentrations, tracez l'absorption par rapport à la concentration et calculez le coefficient d'extinction à partir de la pente de la courbe.
    2. Peser les morceaux de verre où les cristaux se sont formés, de préférence utiliser un microéquilibre.
    3. Mettre les cristaux hors du verre dans 1,2 ml de 0,1 M de solution d'acide acétique de 0,1 M, vortex et sonicate l'échantillon. Conserver l'échantillon à température ambiante pendant 24 h.
      CAUTION: L'acide acétique est très dangereux en cas de contact avec la peau ou les yeux; gérer avec prudence et disposer en suivant les règlements.
    4. Peser la glissière de verre après avoir gratté les cristaux.
    5. Mesurer le spectre UV/vis absorbance (A) de la solution. Si l'additif est une protéine, mesurez l'absorption à 280 nm et calculez sa concentration (C), en utilisant l'équation Beer-Lambert :
      Equation 1
      l est le chemin optique à l'intérieur de la cuvette.
    6. Utilisez la concentration (C) trouvée dans 2.3.5 et le volume utilisé(V à 1,2 ml) pour calculer la masse (m) des additifs dans/sur les cristaux. Si la concentration est en mg/mL, utilisez l'équation C et V m .
      1. Si la concentration est en mol/L, puis calculer les grains de beauté (n) en appliquant C ' V ' n. Ensuite, utilisez le poids moléculaire (Mw) pour calculer la masse (m) des additifs (m ' n ' Mw).
    7. Calculer le pourcentage de poids des additifs dans Equation 2 / sur les cristaux en utilisant l'équation: , où m est la masse des additifs, et ms est la masse des cristaux de carbonate de calcium qui ont été mis au rebut hors du verre morceau.

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Representative Results

Un schéma de la mise en place expérimentale est montré dans la figure 1. En bref, la méthode de diffusion est utilisée afin de former des cristaux de carbonate de calcium dans des plaques de 96 puits et de tester l'effet des biopolymères sur la morphologie et la structure des cristaux de carbonate de calcium. Dans ces expériences, le carbonate d'ammonium est décomposé en ammoniac et co2, qui se diffusent en solutions de carbonate de calcium, ce qui entraîne la formation de cristaux de carbonate de calcium (figure1 et figure 2).

L'effet des biopolymères est évalué par comparaison des cristaux de carbonate de calcium formés avec et sans (contrôle) les additifs. Avant l'ajout des additifs, la concentration optimisée de carbonate de calcium est choisie et la propreté des solutions et de la verrerie est testée. Figure 2 A montre une image représentative d'une expérience de contrôle, où des cristaux rhombohedral distincts de carbonate de calcium sont formés. Ces cristaux sont très probablement calcites (voir Figure 5). Si les solutions ou le plastique ou la verrerie n'ont pas été correctement nettoyés, des cristaux sphériques se formeront (Figure 2B, marquée de cercles rouges), en plus des cristaux de calcite rhombohédral. Les cristaux sphériques sont très probablement vatérite (voir Figure 5). Une indication supplémentaire pour l'utilisation de conditions appropriées, est la douceur des visages de calcite dans l'expérience de contrôle. Cela peut être observé avec SEM, comme le montre la figure 3. Figure 3 A montre un contrôle approprié avec des visages de calcite lisses, tandis que la figure 3B montre des cristaux de calcite avec des visages composés de marches. Les cristaux sphériques ici sont vaterite. Les cristaux de contrôle doivent être séparés et lisses de sorte que l'effet des additifs sur la morphologie cristalline soit clair.

Pour démontrer l'effet d'un biopolymère sur la morphologie du carbonate de calcium, nous avons utilisé ici la protéine TapA. La figure 4 montre les cristaux de carbonate de calcium formés en présence de TapA dans la solution. Les cristaux sont distincts des cristaux de contrôle. Ils forment un assemblage sphérique complexe de carbonate de calcium, composé de multiples microcristaux de calcite (voir le spectre Raman dans la figure 5). Une méthode pour caractériser la structure des cristaux est la spectroscopie Raman. La figure 5 montre les spectres typiques de la calcite (figure 5A) et de la vaterite (Figure 5B), tirées d'expériences de contrôle réussies (A) et infructueuses (B). Les pics d'absorption typiques20 sont de l'ordre de 100 à 400 cm-1 (modes de treillis), un pic de 710 cm-1 (flexion symétrique du CO32-) et de 1090 cm-1 (étirement symétrique du CO3 2-). Notez la scission du décalage Raman à 1080 cm-1 qui est la caractéristique la plus évidente de vaterite21. Référez-vous à la référence22 pour un spectre complet d'aragonite. Le spectre Raman des cristaux formés en présence de TapA est similaire au spectre de la calcite (Figure 5A). Dans les cas où des pics supplémentaires apparaissent qui ne correspondent pas à un seul spectre d'un polymorphe de carbonate de calcium unique, ou une combinaison de ceux-ci, ils peuvent être attribués à un excès de chlorure de calcium qui n'a pas été lavé à fond dans l'étape 1.1.2.8.

Dans la dernière section du protocole, nous avons mesuré le pourcentage (poids/poids) de la teneur organique à l'intérieur ou sur les cristaux de carbonate de calcium. Les cristaux ont été dissous dans l'acide acétique et le biopolymère a été libéré dans la solution. Dans les cas où le biopolymère a un spectre d'absorption caractéristique, sa concentration dans la solution peut être déterminée. Dans le cas des protéines contenant des groupes latéraux aromatiques, comme dans l'étude de cas ici de TapA, l'absorption à 280 nm est utilisée. Le spectre absorbant de TapA, mesuré après la dissolution des cristaux dans l'acide, est montré dans la figure 6 (verte) avec le spectre du contrôle (cristaux de carbonate de calcium dissous acide sans l'additif ; noir). En utilisant la loi de Beer-Lambert (voir l'étape 2.3.5) et en utilisant un coefficient d'extinction de 29.700 M-1 cm-1, nous avons constaté que le pourcentage de masse de TapA était de 1,8% - 0,2%. Il est possible de mesurer l'absorption de la solution après la dissolution du cristal dans l'acide lorsque les biopolymères ne s'agrégent pas à un faible pH. Un signal nul de l'absorption de la solution contenant l'additif est indicatif de son agrégation. Dans ce cas, différentes méthodes d'analyse, telles que l'analyse gravitationnelle thermique (TGA) peuvent être utilisées pour estimer la masse d'additifs présents à l'intérieur/sur les cristaux.

Figure 1
Figure 1 : Description schématique de la méthode de diffusion rapide de la vapeur pour la formation de cristaux de carbonate de calcium. Un sel soluble contenant du calcium (p. ex. chlorure de calcium) est placé près d'une poudre de carbonate d'ammonium. Ici, nous montrons deux puits dans une plaque de 96 puits. La plaque est ensuite scellée, et le carbonate d'ammonium se décompose en ammoniac et en dioxyde de carbone qui se diffusent dans le puits contenant du calcium, ce qui entraîne la précipitation de cristaux de carbonate de calcium (illustré ici par l'image SEM d'un cristal de calcite). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Images optiques au microscope des cristaux de carbonate de calcium. Un contrôle propre contient principalement de la calcite, qui se caractérise par des cristaux rhombohédraux (A). Lorsque l'échantillon témoin comprend des cristaux sphériques (tels queceux marqués par un cercle rouge) ( B), répétez le protocole de nettoyage tel que suggéré à la section 1.1.1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Micrographies électroniques de balayage des cristaux de carbonate de calcium formées dans deux expériences de contrôle. (A) Une image d'un échantillon qui contient principalement des cristaux rhombohédraux (calcite). (B) Une micrographie d'un échantillon avec des facettes de calcite cassées et des cristaux sphériques qui sont très probablement vaterite. Dans ce cas, les expériences de contrôle doivent être répétées. Ce chiffre a été modifié à partird'Azulay et d'al.16 . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Images SEM de cristaux de calcite formés en présence de la protéine TapA. Les barres d'échelle représentent respectivement 50 m (A) et 10 m (B). Ce chiffre a été modifié à partird'Azulay et d'al.16 . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Spectres raman de deux polymorphes de carbonate decalcium. (A) Calcite. (B) Vaterite. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : spectres d'absorption UV/vis de TapA (vert) et d'une solution tampon (100 mM NaCl, 25 mM Tris pH 8,0; noir). L'absorption a été utilisée pour calculer la concentration de TapA dans les cristaux de carbonate de calcium, après leur dissolution dans l'acide. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La méthode décrite ici vise à former des cristaux de carbonate de calcium en présence d'additifs organiques et à évaluer l'effet des biopolymères organiques sur la morphologie et la structure des cristaux de carbonate de calcium in vitro. La méthode est basée sur la comparaison des cristaux formés en présence des additifs organiques aux cristaux de calcite formés dans l'expérience de contrôle. Nous avons montré comment utiliser la méthode de diffusion pour former les cristaux de carbonate de calcium, comment caractériser leur morphologie à l'aide de la microscopie optique et électronique, comment caractériser leur structure à l'aide de la spectroscopie Raman, et comment déterminer la teneur organique (pourcentage de poids/poids) des cristaux.

Nous avons décrit le protocole que nous avons utilisé pour évaluer l'effet d'une protéine extracellulaire bactérienne, TapA, sur la morphologie et la structure du carbonate de calcium, mais le protocole peut être dépensé à tout autre polymère qui est biologiquement purifié ou synthétisé. En plus de l'effet d'un seul biopolymère, cette méthode peut être utilisée avec des mélanges de biopolymères afin d'évaluer toute mutualité entre les différents polymères dans leur effet sur les précipitations de carbonate de calcium. Nous avons limité la configuration expérimentale à une plaque de 96 puits; cependant, toute autre configuration où les solutions de carbonate de calcium sont positionnées et physiquement séparées de la source de carbonate d'ammonium (c.-à-d. les solutions et la poudre sont placées dans un récipient scellé), est possible. Les navires typiques utilisés sont des plaques multi-puits et une plage de concentration typique de 10-50 mM est utilisée pour une installation expérimentale avec 96 plaques de puits10,16,23. Un bécher scellé ou un dessiccateur peut également être utilisé.

Cette méthode est facile à utiliser et compatible avec de faibles concentrations et de faibles volumes d'additifs biopolymères. Travailler dans une plaque multi-puits permet le criblage de plusieurs paramètres en même temps dans une expérience multi-puits plaque. Cette méthode peut être sensible à la position relative des puits de carbonate de calcium par rapport à la position de la poudre de carbonate d'ammonium. Par conséquent, il faut prendre soin d'utiliser toujours les puits à la même position dans la plaque multi-puits et aussi de vérifier que le changement de l'emplacement des puits n'affecte pas les résultats. Normalement, l'utilisation d'une distance suffisamment grande entre les puits où les expériences ont lieu et la poudre de carbonate d'ammonium, assure que les résultats sont reproductibles. En outre, il est essentiel d'ajuster la concentration de la solution CaCl2 afin que des cristaux séparés soient formés dans l'expérience de contrôle, tel que décrit à la section 1.1.2. La concentration des additifs doit également être optimisée pour dépasser une concentration minimale en dessous de laquelle aucun effet n'est observé. Notez que la méthode est très sensible à la concentration des additifs; différentes concentrations additives peuvent induire un effet différent sur la morphologie et la structure des cristaux de carbonate de calcium24.

Une limitation majeure de cette méthode est que l'ammoniac et le CO2 diffusent tous deux dans les solutions d'essai de chlorure de calcium et donc il y a un mauvais contrôle du pH tout au long de l'expérience. En raison de la diffusion de l'ammoniac, le pH dans la solution augmente (lorsque l'ammoniac devient ammonium), comme le montrent les équations d'équilibre5,6 ((NH4)2CO3(s) ' 2NH3(g) ' CO2(g) 2 (en) O(l), NH3(aq) ' H2O(l) ' NH4'(aq) 'OH-(aq), Ca2'(aq) 'CO2(aq) '2OH-(aq) Image 1 CaCO3 (s) - H2O (l)) et il favorise la formation de carbonate de calcium. 

Par rapport aux méthodes supplémentaires décrites dans l'introduction, cette méthode est techniquement simple. En raison de la lenteur du processus de précipitation, la croissance des cristaux peut être suivie en temps réel, en utilisant des techniques d'absorption ou de diffusion de la technique transparente multi-puits. En outre, afin de suivre la cinétique de la croissance cristalline, on peut également sonder la morphologie et la structure du cristal à différents moments, plutôt qu'après 20 heures, comme effectué dans notre étude. Cette méthode peut être étendue pour étudier les précipitations d'autres sels de carbonate portant un Ksp assez petit, comme le magnésium, le baryum et les carbonates de cadmium.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs tient à remercier le professeur Lia Addadi, le professeur Jonathan Erez et le Dr Yael Politi pour leurs discussions fructueuses. Cette recherche a été soutenue par la Fondation israélienne pour la science (ISF), subvention 1150/14.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Gadot 64-19-7
Ammonium carbonate Sigma-Aldrich 506-87-6
Calcium chloride dihydrate Merck KGaA 10035-04-8
Ethanol Absolute Gadot 64-17-5
Micro-Raman Renishaw inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope
Microscope Nikon Eclipse 90i model
Nis elements Br software Nikon For microscope imaging
Scanning Electron Microscope ThermoFisher Scientific FEI Sirion microscope
Spectrophotometer JASCO V-670 model
Sputter coater Polaron SC7640 model

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