Name: Vorming van calcium carbonaat in aanwezigheid van Bioolymeer additieven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Leer een eenvoudig in vitro systeem om de vorming van calcium carbonaat kristallen te bestuderen met biopolymeer additieven. Deze methode maakt meerdere precipitatie-experimenten onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Prof. Lia Addadi, Prof. Jonathan Erez en Dr. Yael Politi bedanken voor de vruchtbare besprekingen. Dit onderzoek werd gesteund door de Israëlische Science Foundation (ISF), Grant 1150/14.

1. kristallisatie van calcium carbonaat
<ol><li>Controle voorbereiding en optimalisatie
	<ol><li>Maak schone glazen stukken. Gebruik dezelfde reinigingsprocedure om het glaswerk te reinigen.<ol>
<li>Gebruik een diamant pen om stukjes van een glazen Microscoop Slide te knippen zodat ze in een put van een 96-well plaat passen. Opmerking: 5 mm x 5 mm stukken moeten grotendeels passen.</li>
			<li>Plaats de glazen stukken in een bekerglas met drievoudig gedestilleerd water (TDW) zodat water de glaasjes en soniceren in een badsonicator gedurende 10 minuten bedekt.</li>
			<li>Decanteren het water, voeg ethanol toe om de glaasjes te bedekken en soniceren in een badsonicator gedurende 10 minuten.</li>
			<li>Droog de glaasjes en het glaswerk met een stroom stikstofgas en plaats ze gedurende 10 minuten in een lucht plasma reiniger bij 130 W.</li>
		</ol></li>
		<li>Optimaliseer de concentratie van de CaCl2 die wordt gebruikt in de calcificatie-experimenten die worden uitgevoerd onder de gewenste experimentele omstandigheden om een monster rijk aan gladde calciet kristallen te bereiken (zonder of ten minste met een schaars aantal vateriet kristallen).<ol>
<li>Vul de putjes in de hoeken van een 96-boorput met ammoniumcarbonaat poeder en verzegel de plaat met behulp van aluminiumfolie; Bedek de folie met paraffine folie. Reinig alle residuele ammoniumcarbonaat met behulp van stikstofgas. Let op: ammonium carbonaat irriteert neus en longen; Gebruik alleen binnen de rook afzuigkap.</li>
			<li>Maak een stamoplossing van 0,5 M CaCl2. Deze voorraadoplossing wordt gebruikt om een gradiënt van concentraties CaCl2 oplossingen in de multi-well plaat te bereiden. Opmerking: een 10 mL stockoplossing is voldoende voor het hele experiment.</li>
			<li>Plaats de eerder gesneden en gereinigde glas stukken in vijf verschillende putjes. Gebruik de dichtstbijzijnde putjes naar het midden.</li>
			<li>Vul elke put met een glas stuk met 100 μL van een CaCl2 -oplossing16. Meng TDW en 0,5 M CaCl2 (Stock) om een toenemende concentratie gradiënt van CACL2 over de verschillende putjes te bereiken. Als een andere grootte goed plaat wordt gebruikt, pas de concentratie van CaCl2 om afzonderlijke calciet kristallen (stap 1.1.2.10, en zie discussie sectie). Opmerking: in dit protocol wordt een toenemende CaCl2 gradiënt van 10, 20, 30, 40, 50 mm concentraties in afzonderlijke putten gebruikt. Gebruik extra putten om het concentratiebereik of het aantal geteste concentraties te verhogen.</li>
			<li>Prik de afdekking van elk van de putjes met ammoniumcarbonaat 3x met een naald.</li>
			<li>Zet het deksel terug, sluit de randen af met paraffine folie en houd het op 18 °C in een incubator voor 20 uur.</li>
			<li>Na de incubatie, open het deksel voorzichtig in een rook afzuigkap en verwijder de kristallen gevormd aan de water/lucht-interface met een lus.</li>
			<li>Gebruik een pincet om de glazen stukken over te brengen in een bekerglas met dubbel distilleerd water (DDW). Verwijder de monsters uit het bekerglas en gebruik een dubbelzijdige tape om de glazen stukjes op de bodem van de Petri schaal te bevestigen.</li>
			<li>Droog overmatig water aanraken van de grenzen van de glijbaan met weefsel doekjes. Bedek de petrischaal en plaats hem in een exsiccator voor 24 uur.</li>
			<li>Let op de kristallen gevormd op de glazen stukken met een stereoscoop (3.5 x vergroting) en/of een rechtopstaande optische Microscoop (10x-40x vergroting). Als de controleoplossingen schoon zijn, zullen rombohedrale kristallen (hoogstwaarschijnlijk calciet) worden waargenomen met een optische Microscoop (Figuur 2A).</li>
			<li>Als naast de rhombohedral kristallen, de controle bevat sferische kristallen (hoogstwaarschijnlijk vaterite, Figuur 2B), of als scanning elektronen microscoop (SEM) beelden tonen rhombohedral kristallen met ruwe in plaats van gladde gezichten ( Figuur 3 A, B), herhaalt u het kristallisatie protocol om ervoor te zorgen dat de reinigingsstap (1.1.1) correct wordt uitgevoerd. Zorg er bovendien voor dat er geen ammoniumcarbonaat is in andere gebieden op de plaat dan de speciale putten. Ga anders verder met de volgende stap.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Kristallisatie in aanwezigheid van additieven
	<ol>
<li>Om het effect van de additieven op de kristallisatie van CaCO3te bestuderen, stelt u een multi-well plaat in die (in verschillende putjes), een Control CACL2 -oplossing zonder de additieven en CACL2 -oplossingen met de additieven bevat. Gebruik de optimale concentratie van CaCl2 , gevonden in punt 1.1.2 voor het experiment. Opmerking: het onderstaande protocol maakt gebruik van optimale omstandigheden zoals gerapporteerd in een eerdere studie16.</li>
		<li>Herhaal stap 1.1.2.2.</li>
		<li>Plaats ammoniumcarbonaat poeder in de hoeken van de plaat zoals beschreven in stap 1.1.2.1.</li>
		<li>In elke put waar de neerslag zal voorkomen, plaats een glas stuk dat werd gesneden en gereinigd zoals beschreven in punt 1.1.1.</li>
		<li>Pipetteer 90 μL TDW in de controle putten om de controle putten voor te bereiden. Bereid ten minste één repliceren van elk goed met inbegrip van het besturingselement. Als het gebruikte additief in een bufferoplossing zit, pipetteer dan 90 μL buffer in plaats van TDW water.</li>
		<li>Bereid de additieve bevattende putten. Herhaal stap 1.2.5 door 90 μL van de additieve oplossing in water toe te voegen. Als het toevoegingsmiddel in buffer is (in plaats van TDW), moet de concentratie van het toevoegingsmiddel vooraf worden aangepast met buffer om te voldoen aan de gewenste eindconcentratie. Een totaal volume van 90 μL bewaren; Pipetteer eerst het additief, dan de buffer. NB: een eindconcentratie van 10 μM eiwit TapA in 100 mM NaCl, 25 mM tris pH 8,0 buffer16 wordt in dit protocol gebruikt.</li>
		<li>Voeg 10 μL van de 0,5 M CaCl2 -stamoplossing (in stap 1.2.2) toe aan zowel de bedieningsorganen als de toevoegingsmiddelen die een eindconcentratie van 50 mm CACL2bereiken.</li>
		<li>Herhaal de stappen 1.1.2.5-1.1.2.9.</li>
	</ol></li>
</ol>2. karakterisering van calciumcarbonaat kristallen
<ol><li>Met een scanning elektronen microscoop, observeren de calciumcarbonaat kristallen gevormd in de aanwezigheid van de additieven met een hogere resolutie dan die verkregen door optische micro kopie (zie stap 1.1.2.10).<ol>
<li>Monteer de glazen stukken met kristallen op een aluminium stub met dubbelzijdige Carbon tape.</li>
		<li>Jas met een laag au/pd voor 40-50 s.</li>
		<li>Verkrijg de beelden op 5 kV acceleratie spanning. Opmerking: Figuur 3a toont een representatief SEM-beeld van calciumcarbonaat kristallen gevormd in een goed controle-experiment, terwijl Figuur 4 representatieve beelden toont van calciumcarbonaat kristallen gevormd in de aanwezigheid van de proteïne TapA .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer micro Raman-spectroscopie uit om de gevormde calciumcarbonaat polymorfen te bepalen. Micro Raman laat de verzameling van een Raman spectrum van enkele kristallen in plaats van een hele poeder.<ol>
<li>Gebruik een 20x doelstelling van de Microscoop om het kristal van belang te kiezen.</li>
		<li>Verzamel het Raman-spectrum in een bereik van 100 − 3200 cm-1 met behulp van een 514 nm argon-laser. Opmerking: Figuur 5 toont representatieve spectra van calciet (a) en vaterite (B). Voor het spectrum van aragoniet, zie referentie18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kwantificering van het massapercentage van de toevoegingsmiddelen in de CaCO3 precipitaten
	<ol>
<li>Controleer/meet de extinctiecoëfficiënt (ε) van het gebruikte toevoegingsmiddel. De extinctiecoëfficiënt van een eiwit kan worden gegeven door online servers19. Als de extinctiecoëfficiënt niet bekend is, meet de absorptie van het toevoegingsmiddel bij verschillende concentraties, plot de absorptie versus concentratie en bereken de extinctiecoëfficiënt vanaf de helling van de curve.</li>
		<li>Weeg de glazen stukken af waar de kristallen gevormd zijn, gebruik bij voorkeur een microbalans.</li>
		<li>Schroot de kristallen van het glas in 1,2 ml van 0,1 M azijnzuur oplossing, Vortex en sonificeren het monster. Bewaar het monster op kamertemperatuur gedurende 24 uur. Let op: azijnzuur is zeer gevaarlijk in geval van huid-of oogcontact; voorzichtig omgaan en de voorschriften afvoeren.</li>
		<li>Weeg de glazen schuif na het afschrapen van de kristallen.</li>
		<li>Meet het spectrum van de UV/VIS-extinctie (A) van de oplossing. Als het toevoegingsmiddel een eiwit is, meet dan de extinctie op 280 nm en bereken de concentratie (C), met behulp van de bier-Lambert vergelijking: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59638/59638eq1.jpg"> waarbij l het optische pad in de Cuvette is.</li>
		<li>Gebruik de concentratie (C) gevonden in 2.3.5 en het gebruikte volume (V = 1,2 ml) om de massa (m) van de additieven in/op de kristallen te berekenen. Als de concentratie in mg/ml is, gebruik dan de vergelijking C ● V = m.<ol>
<li>Als de concentratie in mol/L ligt, bereken dan de mollen (n) die C ● V = ntoepassen. Gebruik vervolgens het molecuulgewicht (MW) om de massa (m) van de additieven (m = n ● MW) te berekenen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereken het gewichtspercentage van de additieven in/op de kristallen met behulp van <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59638/59638eq2.jpg"> </img>de vergelijking:, waarbij m de massa van de additieven is en δms de massa van de calciumcarbonaat kristallen die van het glas zijn gesloopt Stuk.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Blakemore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Magnetotactic bacteria.</a> Science. 190 (4212), 377-379 (1975).</li>
<li>Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+Urchin+Spine+Calcite+Forms+via+a+Transient+Amorphous+Calcium+Carbonate+Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase.</a> Science. 306 (5699), 1161-1164 (2004).</li>
<li>Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+collagen+biomineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro models of collagen biomineralization.</a> Journal of Structural Biology. 183 (2), 258-269 (2013).</li>
<li>Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSigel%2C+A+%22Biomineralization%3A+from+nature+to+application%22">Biomineralization: from nature to application</a>. 12, John Wiley & Sons. (2008).</li>
<li>Nielsen, M. H., Lee, J. R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNielsen%2C+MH+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. De Yoreo, J. J. 532, Academic Press. 209-224 (2013).</li>
<li>Page, M. G., Cölfen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Control+of+CaCO3+Precipitation+by+Direct+Carbon+Dioxide+Diffusion%3A+Application+in+Mesocrystal+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+%26+Design%22%5BJournal%5D)">Improved Control of CaCO3 Precipitation by Direct Carbon Dioxide Diffusion: Application in Mesocrystal Assembly.</a> Crystal Growth & Design. 6 (8), 1915-1920 (2006).</li>
<li>Wang, H., Huang, W., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion-reaction+compromise+the+polymorphs+of+precipitated+calcium+carbonate%5BTitle%5D)+AND+%22Particuology%22%5BJournal%5D)">Diffusion-reaction compromise the polymorphs of precipitated calcium carbonate.</a> Particuology. 11 (3), 301-308 (2013).</li>
<li>Sedlák, M., Antonietti, M., Cölfen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+new+class+of+double-hydrophilic+block+copolymers+with+calcium+binding+capacity+as+builders+and+for+biomimetic+structure+control+of+minerals%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Chemistry+and+Physics%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a new class of double-hydrophilic block copolymers with calcium binding capacity as builders and for biomimetic structure control of minerals.</a> Macromolecular Chemistry and Physics. 199 (2), 247-254 (1998).</li>
<li>Kitano, Y., Park, K., Hood, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pure+aragonite+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Geophysical+Research%22%5BJournal%5D)">Pure aragonite synthesis.</a> Journal of Geophysical Research. 67 (12), 4873-4874 (1962).</li>
<li>Politi, Y., Mahamid, J., Goldberg, H., Weiner, S., Addadi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asprich+mollusk+shell+protein%3A+in+vitro+experiments+aimed+at+elucidating+function+in+CaCO3+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22CrystEngComm%22%5BJournal%5D)">Asprich mollusk shell protein: in vitro experiments aimed at elucidating function in CaCO3 crystallization.</a> CrystEngComm. 9 (12), 1171-1177 (2007).</li>
<li>Gehrke, N., Cölfen, H., Pinna, N., Antonietti, M., Nassif, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superstructures+of+Calcium+Carbonate+Crystals+by+Oriented+Attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+%26+Design%22%5BJournal%5D)">Superstructures of Calcium Carbonate Crystals by Oriented Attachment.</a> Crystal Growth & Design. 5 (4), 1317-1319 (2005).</li>
<li>Rudloff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-Hydrophilic+Block+Copolymers+with+Monophosphate+Ester+Moieties+as+Crystal+Growth+Modifiers+of+CaCO3%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Chemistry+and+Physics%22%5BJournal%5D)">Double-Hydrophilic Block Copolymers with Monophosphate Ester Moieties as Crystal Growth Modifiers of CaCO3.</a> Macromolecular Chemistry and Physics. 203 (4), 627-635 (2002).</li>
<li>Boquet, E., Boronat, A., Ramos-Cormenzana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Calcite+%28Calcium+Carbonate%29+Crystals+by+Soil+Bacteria+is+a+General+Phenomenon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of Calcite (Calcium Carbonate) Crystals by Soil Bacteria is a General Phenomenon.</a> Nature. 246, 527(1973).</li>
<li>Cohen, A. L., McConnaughey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geochemical+Perspectives+on+Coral+Mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Mineralogy+and+Geochemistry%22%5BJournal%5D)">Geochemical Perspectives on Coral Mineralization.</a> Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54 (1), 151-187 (2003).</li>
<li>Erez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+effect+on+stable-isotope+composition+seen+in+foraminifera+and+coral+skeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons.</a> Nature. 273, 199(1978).</li>
<li>Azulay, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopolymers+from+a+Bacterial+Extracellular+Matrix+Affect+the+Morphology+and+Structure+of+Calcium+Carbonate+Crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+%26+Design%22%5BJournal%5D)">Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals.</a> Crystal Growth & Design. 18 (9), 5582-5591 (2018).</li>
<li>Abbasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacterial+Extracellular+Matrix+Protein+TapA+Is+a+Two-Domain+Partially+Disordered+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein.</a> ChemBioChem. , (2018).</li>
<li>Gauldie, R. W., Sharma, S. K., Volk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-raman+spectral+study+of+vaterite+and+aragonite+otoliths+of+the+coho+salmon%2C+Oncorhynchus+kisutch%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+A%3A+Physiology%22%5BJournal%5D)">Micro-raman spectral study of vaterite and aragonite otoliths of the coho salmon, Oncorhynchus kisutch.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 118 (3), 753-757 (1997).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. , Springer. 571-607 (2005).</li>
<li>Gunasekaran, S., Anbalagan, G., Pandi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+and+infrared+spectra+of+carbonates+of+calcite+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Raman and infrared spectra of carbonates of calcite structure.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 37 (9), 892-899 (2006).</li>
<li>Trushina, D. B., Bukreeva, T. V., Kovalchuk, M. V., Antipina, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaCO3+vaterite+microparticles+for+biomedical+and+personal+care+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C%22%5BJournal%5D)">CaCO3 vaterite microparticles for biomedical and personal care applications.</a> Materials Science and Engineering: C. 45, 644-658 (2014).</li>
<li>Weiss, I. M., Tuross, N., Addadi, L., Weiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mollusc+larval+shell+formation%3A+amorphous+calcium+carbonate+is+a+precursor+phase+for+aragonite%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite.</a> Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 478-491 (2002).</li>
<li>Yamamoto, Y., Nishimura, T., Saito, T., Kato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaCO3%2Fchitin-whisker+hybrids%3A+formation+of+CaCO3+crystals+in+chitin-based+liquid-crystalline+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Journal%22%5BJournal%5D)">CaCO3/chitin-whisker hybrids: formation of CaCO3 crystals in chitin-based liquid-crystalline suspension.</a> Polymer Journal. 42, 583(2010).</li>
<li>Magnabosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+on+the+interaction+of+calcein+with+calcium+carbonate+and+its+implications+in+biomineralization+studies%5BTitle%5D)+AND+%22CrystEngComm%22%5BJournal%5D)">Insights on the interaction of calcein with calcium carbonate and its implications in biomineralization studies.</a> CrystEngComm. 20 (30), 4221-4224 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven methode is gericht op het vormen van calciumcarbonaat kristallen in de aanwezigheid van organische additieven en het evalueren van het effect van organische biopolymeren op de morfologie en structuur van calciumcarbonaat kristallen in vitro. De methode is gebaseerd op de vergelijking van de kristallen gevormd in de aanwezigheid van de organische additieven aan de calciet kristallen gevormd in de controle-experiment. We hebben laten zien hoe we de diffusie methode gebruiken om de calciumcarbonaat krista...

Biomineralisatie is de vorming van mineralen in de aanwezigheid van organische moleculen, vaak gerelateerd aan functionele en/of structurele rollen in levende organismen. Biomineralisatie kan intracellulaire, zoals in de vorming van magnetiet binnen magnetotactische bacteriën1, of extracellulaire, zoals in de vorming van calciumcarbonaat in zee--egels spikes2, van hydroxyapatiet die is gerelateerd met collageen in botten3 en glazuur die wordt geassocieerd met amelogenin in tanden4. Biomineralisatie is een complex proces dat afhangt van vele parameters in het levende organisme. Daarom is het, om het onderzochte systeem te vereenvoudigen, noodzakelijk om het effect van afzonderlijke componenten op het proces te evalueren. In veel gevallen wordt biomineralisatie geïnduceerd door de aanwezigheid van extracellulaire biopolymeren. Het doel van de hier gepresenteerde methode is als volgt: (1) het vormen van calciumcarbonaat kristallen in aanwezigheid van geïsoleerde biopolymeren in vitro, met behulp van een damp diffusie methode. (2) om het effect van de biopolymeren op de morfologie en structuur van calciumcarbonaat te bestuderen.
In de aanwezigheid van organische additieven worden in vitro drie methoden gebruikt voor het neerslaan van calciumcarbonaat in de nabijheid van5,6. De eerste methode, die wij als oplossingsmethode noemen, is gebaseerd op het mengen van een oplosbaar zout calcium (bv. CaCl2) met een oplosbaar zout van carbonaat (bv. natriumcarbonaat). Het mengproces kan op verschillende manieren worden uitgevoerd: binnen een reactor met drie cellen die worden gescheiden door poreuze membranen7. Hier bevat elk van de buitenste cellen een oplosbaar zout en de centrale cel bevat een oplossing met het te testen toevoegingsmiddel. Calcium en carbonaat diffuus van de buitenste naar de middelste cel, resulterend in het neerslaan van het minder oplosbare calciumcarbonaat wanneer de concentraties van calcium en carbonaat hun oplosbaarheids product overschrijden, KSP = [CA2 +] [co3 2-]. Een extra Meng methode is de double-Jet procedure8. Bij deze methode wordt elk oplosbaar zout van een afzonderlijke injectiespuit geïnjecteerd in een geroerd oplossing die het toevoegingsmiddel bevat, waarbij calciumcarbonaat neervalt. Hier, de injectie en dus de mengsnelheid is goed gecontroleerd, in tegenstelling tot de vorige methode waarbij menging wordt geregeld door diffusie.
De tweede methode die gebruikt wordt om CaCO3 te kristalliseren is de Kitano methode9. Deze methode is gebaseerd op het carbonaat/waterstof carbonaat-evenwicht (2hco3- (AQ) + CA2 +(AQ) <img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59638/59638img01.jpg"> </img> CaCO3 (s) + co2 (g) + H2O (l)). Hier wordt CO2 in een vaste vorm in een oplossing met CaCO3 gebubbeld, waardoor het evenwicht naar links verschuift en het calciumcarbonaat daardoor oplost. Het onopgeloste calciumcarbonaat wordt gefilterd en de gewenste additieven worden toegevoegd aan de bicarbonaat-rijke oplossing. CO2 mag dan verdampen, waardoor de reactie naar rechts verschuift en calciumcarbonaat ontstaat in aanwezigheid van de additieven.
De derde methode van kristallisatie van calciumcarbonaat, die we hier zullen beschrijven, is de damp diffusiemethode10. In deze opstelling wordt het organische toevoegingsmiddel, opgelost in een oplossing van calciumchloride, in een gesloten kamer in de buurt van ammoniumcarbonaat in een poedervorm geplaatst. Wanneer ammoniumcarbonaat poeder in kooldioxide en ammoniak ontbindt, worden ze diffuus in de oplossing die calciumionen bevat (bv. CaCl2), en wordt calciumcarbonaat neergeprecipiteerd (Zie afbeelding 1 voor illustratie). De calciumcarbonaat kristallen kunnen groeien door langzame neerslag of door snelle neerslag. Voor de langzame neerslag wordt een oplossing die het toevoegingsmiddel in CaCl2 -oplossing bevat, in een exsiccator naast het ammoniumcarbonaat-poeder geplaatst. Bij de snelle neerslag, beschreven in de lengte van het Protocol, worden zowel de additieve oplossing als het ammoniumcarbonaat dichter bij elkaar geplaatst in een multi-well plaat. De langzame neerslag methode zal minder nucleatie centra en grotere kristallen produceren, en de snelle neerslag zal resulteren in meer nucleatie centra en kleinere kristallen.
De hierboven beschreven methoden verschillen in hun technische complexiteit, in het niveau van controle en in de snelheid van het neerslag proces. De Meng methode vereist een speciale set-up6 voor zowel de dubbele straal als het driecellige systeem. In de Meng methode is de aanwezigheid van andere oplosbare contra-ionen (bijv. na+, cl-)6 onvermijdelijk, terwijl in de Kitano-methode calcium en (BI) carbonaat de enige ionen in oplossing zijn en de aanwezigheid van extra tegen ionen (bijv. na+, cl-). Bovendien, de Meng methode vereist relatief grote volumes en daarom is het niet geschikt voor het werken met dure biopolymeren. Het voordeel van de dubbele straal is dat het mogelijk is om de snelheid van de oplossing injectie te regelen en dat het een snel proces is in vergelijking met andere methoden.
Het voordeel van de Kitano-methode en de damp diffusiemethode is dat de vorming van calciumcarbonaat wordt geregeld door diffusie van CO2 in/uit een CACL2 -oplossing, waardoor tragere nucleatie-en neerslag processen kunnen worden sonde 11 , 12. Bovendien kan de vorming van calciumcarbonaat door diffusie van co2 lijken op calcificatie processen in vivo13,14,15. In deze methode worden goed gedefinieerde en gescheiden kristallen gevormd16. Ten slotte kan het effect van enkelvoudige of meervoudige biopolymeren op de vorming van calciumcarbonaat worden getest. Dit maakt een systematische studie mogelijk van het effect van een reeks additieve concentraties op de vorming van calciumcarbonaat, evenals een studie van mengsels van biopolymeren-allemaal uitgevoerd op een gecontroleerde manier. Deze methode is geschikt voor gebruik met een groot aantal concentraties en volumes additieven. Het minimale gebruikte volume is ongeveer 50 μL en daarom is deze methode voordelig wanneer er een beperkte hoeveelheid beschikbare biopolymeren is. Het maximale volume is afhankelijk van de toegankelijkheid van een grotere goed plaat, of de exsiccator waarin de plaat of beker die CaCl2 bevat, moet worden ingebracht. De hieronder beschreven methode is geoptimaliseerd voor het werken in een 96-put plaat met een biopolymeer gekozen als de proteïne TapA17.

<table><tbody><tr><td>Azijnzuur</td><td>Gadot</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumcarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>506-87-6</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride dihydraat</td><td>Merck KGaA</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>Absoluut ethanol</td><td>Gadot</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Raman</td><td>Renishaw</td><td></td><td>inVia Reflex spectrometer gekoppeld aan een rechtopstaande Leica optische microscoop</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Eclipse 90i model</td></tr><tr><td>Nis-elementen Br-software</td><td>Nikon</td><td></td><td>Voor microscoopbeeldvorming</td></tr><tr><td>Scanning Electron Microscope</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>FEI Sirion microscoop</td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>JASCO</td><td></td><td>V-670 model</td></tr><tr><td>Sputtered coater</td><td>Polaron</td><td></td><td>SC7640 model</td></tr></tbody></table>

vorming van calcium carbonaat in aanwezigheid van bioolymeer additieven

Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives

Biomineralisatie is de vorming van mineralen in de aanwezigheid van organische moleculen, vaak gerelateerd aan functionele en/of structurele rollen in levende organismen. Het is een complex proces en daarom is een eenvoudig, in vitro systeem nodig om het effect van geïsoleerde moleculen op het biomineralisatie proces te begrijpen. In veel gevallen wordt biomineralisatie geregisseerd door biopolymeren in de extracellulaire matrix. Om het effect van geïsoleerde biopolymeren op de morfologie en de structuur van calciet in vitro te evalueren, hebben we de damp diffusiemethode gebruikt voor het neerslaan van calciumcarbonaat, het scannen van elektronenmicroscopie en micro Raman voor de karakterisering, en ultraviolette-zichtbare (UV/VIS) extinctie voor het meten van de hoeveelheid biopolymeer in de kristallen. Bij deze methode worden de geïsoleerde biopolymeren, opgelost in een calciumchloride oplossing, blootgesteld aan gasvormige ammoniak en koolstofdioxide die afkomstig zijn van de afbraak van massief ammoniumcarbonaat. Onder de omstandigheden waarin het oplosmiddel van calciumcarbonaat wordt bereikt, worden precipiteert calciumcarbonaat en kristallen gevormd. Calciumcarbonaat heeft verschillende polymorfen die verschillen in hun thermodynamische stabiliteit: amorfe calciumcarbonaat, vaterite, aragoniet, en calciet. Bij afwezigheid van biopolymeren, onder schone omstandigheden, is calciumcarbonaat meestal aanwezig in de calciet vorm, wat de meest thermodynamisch stabiele polymorf van calciumcarbonaat is. Deze methode onderzoekt het effect van de biopolymere additieven op de morfologie en structuur van calciumcarbonaat kristallen. Hier demonstreren we het protocol door de studie van een extracellulair bacterieel eiwit, TapA, op de vorming van calciumcarbonaat kristallen. Specifiek richten we ons op de experimentele opstelling, en karakterisatie methoden, zoals optische en elektronenmicroscopie evenals Raman-spectroscopie.

Een schematische weergave van de experimentele opstelling is afgebeeld in Figuur 1. In het kort wordt de diffusie methode gebruikt om calciumcarbonaat kristallen in 96-well Plates te vormen en het effect van biopolymeren op de morfologie en structuur van de calciumcarbonaat kristallen te testen. Bij deze experimenten wordt ammoniumcarbonaat ontleed in ammoniak en CO2, die zich verspreiden in oplossingen van calciumcarbonaat, wat resulteert in de vorming van calciumcarbonaat krista...

We beschrijven een protocol voor de precipitatie en karakterisering van calciumcarbonaat kristallen die vormen in de aanwezigheid van biopolymeren.

Vorming van calcium carbonaat in aanwezigheid van Bioolymeer additieven

Biomineralization is the formation of minerals in the presence of organic molecules, often related with functional and/or structural roles in living ...

Ons protocol beschrijft een eenvoudig in vitro systeem, om het effect van geïsoleerde moleculen op de morfologie en structuur van calciumcarbonaat te bestuderen. Deze techniek is voordelig in gevallen waarin de biomoleculen die ik test duur zijn, of beschikbaar in kleine hoeveelheden, evenals wanneer langzame calciumcarbonaat neerslag nodig is. Bovendien maakt het mogelijk om meerdere neerslag-experimenten onder dezelfde omstandigheden tegelijk te onderzoeken.Bereid eerst het controle-experiment voor. Gebruik drievoudig gedestilleerd water en ethanol om glasstukken en glaswerk schoon te maken. Gebruik een diamantpen om stukken van een glazen microscoop dia te snijden, zodat ze passen in een put van een 96-put plaat.Plaats de glazen plaatsen in een beker met drievoudig gedestilleerd water, zodat het water de glazen glijbanen bedekt. Sonicate in een bad sonicator voor 10 minuten. Decanteer het water.Voeg ethanol toe om de glazen platen te bedekken en sonicate opnieuw in een bad sonicator voor 10 minuten. Droog vervolgens de glijbanen en het glaswerk met een stroom stikstofgas en plaats ze 10 minuten lang in een luchtplasmareiniger bij 130 watt. Vul in een rookkap de putten op de hoek

calcium-carbonate-formation-in-the-presence-of-biopolymeric-additives

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Scaffolds die passen in cranio-maxillofaciale (CMF) botdefecten terwijl ze osteoconductiviteit en bioactiviteit vertonen, zijn interessant. Dit protocol beschrijft de bereiding van een shape memory scaffold op basis van polycaprolacton diacyraat (PCL-DA) met behulp van een solvent-casting particulate-leaching (SCPL) methode, waarbij een gefuseerd zout template wordt gebruikt en toepassing van een bioactieve polydopamine coating.

Fabricage van een biologisch actief, PCL-based &quot;Self-fitting&quot; Shape Memory Polymer Steiger

Twee- en driedimensionale superhydrofobe polymere materialen worden bereid door middel van elektrospinnen of elektrosprayen van biologisch afbreekbare polymeren vermengd met een polymeer met een lagere oppervlakte-energie van vergelijkbare samenstelling.

Fabriceren superhydrophobic polymere materialen voor biomedische toepassingen

Protocollen voor microbiologisch geïnduceerde calcietprecipitatie (MICP) met behulp van de bacterie Sporosarcina pasteurii worden hier gepresenteerd. Het geprecipiteerde calciumcarbonaat werd gekarakteriseerd door middel van optische microscopie en rasterelektronenmicroscopie (SEM). Er wordt ook aangetoond dat blootstelling aan MICP de druksterkte van spons verhoogt.

Microbiologisch Induced calciet Neerslag gemedieerd door<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

Weergegeven is het protocol voor co-immobiliserende hele cellen biokatalysatoren voor cofactorregeneratiesysteem en betere herbruikbaarheid, via de productie van L-xylulose als voorbeeld. De cofactor regeneratie wordt bereikt door het koppelen van twee Escherichia coli-stammen die functionele complementariteit enzymen; de hele cellen biokatalysator immobilisatie wordt bereikt door celinkapselende in calciumalginaat parels.

Immobilisatie van Multi-biokatalysatoren in Alginaat Kralen voor cofactorregeneratiesysteem en verbeterde Herbruikbaarheid

Een nieuwe manier voor de productie van biopolymeer-gebaseerde aerogels door middel van kooldioxide (CO2) geïnduceerde gelering wordt getoond. De techniek maakt gebruik van geperst kooldioxide (5 MPa) voor de productie van biopolymeer hydrogels en superkritisch CO2 (12 MPa) om gels om te zetten in aerogels. De enige oplosmiddelen die naast CO2 nodig zijn, zijn water en ethanol.

Bereiding van Biopolymer Aerogels die Groene Oplosmiddelen

Een protocol voor de parallelle productie van geprecipiteerd calciumcarbonaat en zeolitisch materiaal uit hoogovenslakken via respectievelijk minerale carboratie en alkalische hydrothermische conversie wordt gepresenteerd. De prestaties van het zeolitische materiaal ten aanzien van nikkeladsorptie worden getest.

Twee-weg Valorisatie van hoogovenslakken: Synthese van neergeslagen calciumcarbonaat en Zeolitische Heavy Metal Adsorbent

Dit document beschrijft een nieuwe methode voor de snelle productie van hoge kwaliteit bioinspired nanoschaal hydroxyapatiet. Dit biomateriaal is van groot belang bij de vervaardiging van een groot aantal innovatieve medische inrichtingen voor klinische toepassingen voor orthopedie, craniofaciale chirurgie en tandheelkunde.

Rapid Mix Bereiding van Bioinspired Nanoscale hydroxyapatiet voor biomedische toepassingen

Dit manuscript wordt de verwerking van één multifunctionele keramische onderdelen (bv, combinaties van dichte-poreuze structuren) addiditief vervaardigd door stereolithography beschreven.

Additieve vervaardiging van functioneel Graded keramische materialen door Stereolithografie

Hier, microbieel geïnduceerde calciet neerslag (micp) technologie wordt gepresenteerd ter verbetering van de bodemeigenschappen door onderdompeling.

Zandgrond verbetering door microben geïnduceerde calciet precipitatie (MICP) door onderdompeling

We introduceren drie methoden van directe kweek, directe blootstellingscultuur en blootstellingscultuur voor het evalueren van de in vitro cytocompatibiliteit van biologisch afbreekbare implantaatmaterialen. Deze in vitro methoden bootsen verschillende in vivo cel-implantaat interacties na en kunnen worden toegepast om verschillende biologisch afbreekbare materialen te bestuderen.

Directe en indirecte kweekmethoden voor het bestuderen van biologisch afbreekbare implantaatmaterialen in vitro

Dit protocol beschrijft een 3D-printtechniek om botachtige structuren te fabriceren door een calciumfosfaatinkt af te zetten in een op gelatine gebaseerde korrelige ondersteuning. Geprinte botanalogen worden in vrije vorm afgezet, met flexibiliteit voor het direct oogsten van de afdruk of crosslinking binnen een levende celmatrix voor multifasische constructies.

Keramische omnidirectionele bioprinting in celbeladen suspensies voor het genereren van botanalogen

Leer een eenvoudig in vitro systeem om de vorming van calcium carbonaat kristallen te bestuderen met biopolymeer additieven. Deze methode maakt meerdere precipitatie-experimenten onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk.

Vorming van calcium carbonaat in aanwezigheid van Bioolymeer additieven

Meer video's verkennen