Vorming van calcium carbonaat in aanwezigheid van Bioolymeer additieven

Ons protocol beschrijft een eenvoudig in vitro systeem, om het effect van geïsoleerde moleculen op de morfologie en structuur van calciumcarbonaat te bestuderen. Deze techniek is voordelig in gevallen waarin de biomoleculen die ik test duur zijn, of beschikbaar in kleine hoeveelheden, evenals wanneer langzame calciumcarbonaat neerslag nodig is. Bovendien maakt het mogelijk om meerdere neerslag-experimenten onder dezelfde omstandigheden tegelijk te onderzoeken.

Bereid eerst het controle-experiment voor. Gebruik drievoudig gedestilleerd water en ethanol om glasstukken en glaswerk schoon te maken. Gebruik een diamantpen om stukken van een glazen microscoop dia te snijden, zodat ze passen in een put van een 96-put plaat.

Plaats de glazen plaatsen in een beker met drievoudig gedestilleerd water, zodat het water de glazen glijbanen bedekt. Sonicate in een bad sonicator voor 10 minuten. Decanteer het water.

Voeg ethanol toe om de glazen platen te bedekken en sonicate opnieuw in een bad sonicator voor 10 minuten. Droog vervolgens de glijbanen en het glaswerk met een stroom stikstofgas en plaats ze 10 minuten lang in een luchtplasmareiniger bij 130 watt. Vul in een rookkap de putten op de hoeken van een 96-putplaat met ammoniumcarbonaatpoeder en verzegel de plaat met aluminiumfolie.

Bedek de folie met paraffinefilm. Reinig eventueel restcaracariumcarbonaat met stikstofgas. Plaats de eerder gesneden en gereinigde glazen stukken in vijf verschillende putten het dichtst bij het centrum.

Vul elk goed met een glazen stuk met 100 microliter calciumchlorideoplossing bereid met drievoudig gedestilleerd water bij een toenemend gradiënt van 10, 20, 30, 40 en 50 millimolar concentraties. Vervolgens, punctie de cover van elk van de putten met ammonium carbonaat drie keer met een naald. Zet het deksel terug, verzegel de grenzen met paraffinefilm en houd het 20 uur op 18 graden Celsius in een couveuse.

Tijdens de incubatie wordt ammoniumcarbonaat afgebroken tot ammoniak en kooldioxide, die zich verspreiden in calciumchlorideoplossingen, wat resulteert in de vorming van calciumcarbonaatkristallen. Na de incubatie opent u het deksel voorzichtig in een rookkap en gebruikt u een lus om de kristallen te verwijderen die bij de waterluchtinterface zijn gevormd. Gebruik een pincet om de glazen stukken over te brengen in een beker met dubbel gedestilleerd water voor een korte duik.

Verwijder vervolgens de monsters uit het bekerglas en gebruik dubbelzijdige tape om de glazen stukken op de bodem van de petrischaal te bevestigen. Droog overmatig water dat de randen van de glijbaan raakt, met weefseldoekjes. Bedek de petrischaal en plaats deze 24 uur in een desiccator.

Observeer de kristallen gevormd op de glazen stukken met een rechtopstaande optische microscoop op 10 tot 40 keer vergroting. De waargenomen rhombohedral kristallen zijn waarschijnlijk calciet. Als in aanvulling op de rhombohedral kristallen, de oplossing bevat bolvormige kristallen die waarschijnlijk vateriet, herhaal het kristallisatie protocol, ervoor te zorgen dat de reinigingsstap correct wordt uitgevoerd.

Zorg er bovendien voor dat er geen ammoniumcarbonaat is in andere gebieden van de plaat dan de speciale putten. De optimale concentratie voor calciumchloride wordt bepaald volgens het monster rijk met gladde gefaceteerde calciet kristallen zonder vateriet kristallen. Om te beginnen, schone glazen platen en glaswerk zoals eerder gedaan.

In een rookkap, plaats ammonium carbonaat poeder in de hoeken van een 96-put plaat. In elke put waar neerslag zal optreden, plaats een glazen stuk dat werd gesneden en gereinigd. Bereid de controleputten voor.

In twee controleputten, pipet 90 microliters van 25 millimolar Tris buffer bij pH 8, aangevuld met 100 millimolar natriumchloride. Voeg vervolgens 10 microliter van 0,5 molaire calciumchloridevoorraadoplossing toe. Pas vervolgens de concentratie additief eiwit TapA aan op 10 micromolar TapA, 100 millimolar natriumchloride en 25 millimolar Tris-buffer bij pH 8.

Bereid het additief met putten door 90 microliters van de additieve oplossing toe te voegen. Voeg 10 microliter calciumchloridebestandsoplossing van 0,5 moler calciumchloride toe aan het eerder vastgestelde additief dat putten bevat om de optimale concentratie bij 50 millimolar calciumchloride te bereiken. Bereid de plaat met gaten op de cover over putten met ammoniumcarbonaat, en uitbroeden op 18 graden Celsius zoals eerder gedaan.

Na incubatie, bereid de glazen stukken in een petrischaal zoals eerder gedaan, en plaats de schotel in een desiccator voor 24 uur. Om het massapercentage van de additieven in de calciumcarbonaat neerslaan te kwantificeren, controleert u eerst de uitstervingscoëfficiënt van het gebruikte toevoegingsmiddel. Gebruik vervolgens een microbalans om de glazen stukken te wegen waar de kristallen zich hebben gevormd.

Schraap daarna de kristallen van het glas in een eppebuis met 1,2 milliliter 0,1 molaire azijnzuuroplossing. Vortex kort, en plaats de buis in een sonicator om het monster sonicate totdat de kristallen verdwijnen. Bewaar het monster 24 uur op kamertemperatuur.

Weeg de glazen glijbaan na het afschrapen van de kristallen. Meet de UV-absorptie A van de 1,2 milliliter gesononiceerde oplossing op 280 nanometer voor het eiwitadditief. Gebruik de Beer-Lambert vergelijking om de concentratie c te berekenen.

L is het optische pad in de cuvette. Om de massa van de additieven in het kristal te berekenen, gebruik de vergelijking, c keer v is gelijk aan m, als de concentratie in milligram per milliliter is. Als de concentratie is in moedervlekken per liter, bereken dan de moedervlekken van toepassing c keer v gelijk aan n.

Gebruik vervolgens het molecuulgewicht om de massa van de additieven te berekenen. Bereken het gewichtspercentage van de additieven in de kristallen. M is de massa van de additieven, en delta m s, is de massa van de calciumcarbonaat kristallen die werden geschraapt uit het glas stuk.

SEM-afbeeldingen tonen de vergelijking tussen een goede controle met gladde calcietvlakken en kalkkristallen met vlakken die uit stappen bestaan. De bolvormige kristallen zijn vateriet. De succesvolle en mislukte controle-experimenten resulteerden in Raman spectroscopie, met de typische spectra van calciet en vateriet respectievelijk.

De splitsing van de Raman-ploeg rond 1080 per centimeter is het meest voor de hand liggende kenmerk van vateriet. De kristallen van calciumcarbonaat gevormd in aanwezigheid van TapA, onderscheiden zich van de controlekristallen. Een complexe bolvormige calciumcarbonaat assemblage, samengesteld uit meerdere calciet microkristallen werd gevormd.

Het Raman-spectrum van de kristallen gevormd in aanwezigheid van TapA, is vergelijkbaar met het spectrum van calciet. De absorberende spectrums van TapA, en de controle zonder het additief, werden gemeten na ontbinding van de kristallen in zuur. Het massapercentage van TapA werd vastgesteld op 1,8 plus of min 0,2%Het is van cruciaal belang om de reinigingsstappen zorgvuldig te volgen, en om ervoor te zorgen dat de controlenormen worden voldaan voordat het testen van het effect van de additieven op de vorming van calciumcarbonaat.

Daarnaast is het belangrijk om een teveel aan ammoniumcarbonaat in poedervorm uit de putten te verwijderen. Ammoniumcarbonaat ontleedt in ammoniak en kooldioxide. Ammoniak is giftig bij inademing, en daarom mag ammoniumcarbonaat alleen in een rookkap worden behandeld.

Om de interne morfologie en structuur van de kristallen te evalueren, u ze doorsneden met behulp van een gerichte ionenstraal, de secties met een transmissieelektronmicroscoop in beeld brengen en de patronen van de elektronendiffractie van specifieke locaties langs de secties meten. Deze techniek is eerder gebruikt om het effect van verschillende moleculen op de morfologie en structuur van calciumcarbonaat te bestuderen. We hebben deze methode uitgewerkt om biopolymeren die worden geproduceerd door bacteriële cellen in biofilms.

Het zal interessant zijn om aanvullende studies uit te voeren met andere biopolymeren geproduceerd door verschillende bacteriële stammen.