ADN Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

Chemistry
 

Summary

Ici, nous décrivons un protocole pour créer des nanostructures inorganiques discrètes et précises sur des substrats utilisant des formes d'origami d'ADN comme modèles de guidage. La méthode est démontrée par la création d'antennes en forme de noeud papillon en or plasmonique sur un substrat transparent (saphir).

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Piskunen, P., Shen, B., Julin, S., Ijäs, H., Toppari, J. J., Kostiainen, M. A., Linko, V. DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications. J. Vis. Exp. (151), e60313, doi:10.3791/60313 (2019).

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Abstract

La nanotechnologie de l'ADN structurel offre une voie viable pour la construction à partir du bas vers le haut en utilisant l'ADN comme matériau de construction. La technique de nanofabrication d'ADN la plus courante est appelée origami d'ADN, et elle permet la synthèse à haut débit de structures précises et très polyvalentes avec une précision de niveau nanomètre. Ici, il est montré comment l'information spatiale de l'origami d'ADN peut être transférée aux nanostructures métalliques en combinant l'origami d'ADN ascendant avec les approches de lithographie descendante utilisées conventionnellement. Cela permet la fabrication de milliards de nanostructures minuscules en une seule étape sur des substrats sélectionnés. La méthode est démontrée à l'aide de l'origami d'ADN noeud papillon pour créer des structures d'antenne métalliques en forme de noeud papillon sur des substrats de nitride de silicium ou de saphir. La méthode repose sur la croissance sélective d'une couche d'oxyde de silicium sur le substrat de dépôt d'origami, résultant ainsi en un masque de modelage pour suivre les étapes lithographiques. Ces surfaces équipées de nanostructures peuvent être utilisées comme capteurs moléculaires (p. ex., spectroscopie Raman améliorée en surface) et dans diverses autres applications optiques à la plage de longueur d'onde visible en raison de la petite taille des entités (moins de 10 nm). La technique peut être étendue à d'autres matériaux par des modifications méthodologiques; par conséquent, les surfaces optiquement actives qui en résultent peuvent être utilisées dans le développement de métamatériaux et de métasurfaces.

Introduction

La nanotechnologie structurale de l'ADN a rapidement évolué au cours de la dernière décennie1,2, et le développement le plus influent dans le domaine a sans doute été l'invention de l'ADN origami3,4. La technique de l'origami d'ADN permet la fabrication de pratiquement n'importe quelle nanoforme avec des caractéristiques structurales précises3,4. Cette méthode puissante peut être utilisée dans l'arrangement spatial (sous)nanomètre précis et l'ancrage d'autres nano-objets, tels que les nanotubes de carbone5, nanoparticules métalliques6,7,8, 9, enzymes/protéines10,11,12,13 et matériaux thérapeutiques14,15,16,17 . Fait important, ces structures ne sont pas seulement statiques, mais elles peuvent aussi être programmées pour agir de manière dynamique18,19. Les innombrables applications de l'ADN origami vont de la livraison de médicaments20,21,22 à l'électronique moléculaire / plasmoniques5,23,24, 25 et de la science des matériaux26,27 à de nouvelles techniques d'imagerie et d'étalonnage28.

Outre les applications mentionnées ci-dessus, la résolution spatiale extrême des formes d'origami d'ADN pourrait être exploitée dans le nanopatterning et la lithographie nanométrique délicate29,30. Ce protocole décrit une méthode de lithographie pour créer des nanostructures inorganiques discrètes et précises sur des substrats à l'aide de modèles d'origami d'ADN. Ces modèles peuvent être efficacement produits dans diverses formes et en grandes quantités31,et déposés sans effort sur les substrats choisis à de grandes échelles32. Ces propriétés permettent une fabrication très parallèle de milliards de nanostructures en une seule étape par opposition à la lithographie à faisceau d'électrons couramment utilisée mais plutôt lente ou à d'autres techniques de nanofabrication basées sur la numérisation.

Ici, le processus de fabrication est démontré en créant des structures en forme de noeud papillon d'or sur le nitride de silicium et les substrats de saphir ; en d'autres termes, l'information spatiale de l'origami d'ADN est transférée à des nanostructures entièrement métalliques. Comme nous l'avons vu ici, la technique ne se limite pas à la structure sélectionnée de l'origami d'ADN noeud papillon puisque la méthode permet l'utilisation de pratiquement n'importe quelle forme d'origami d'ADN. En outre, avec des modifications méthodiques, la technique peut être étendue à différents métaux et substrats ouvrant la voie à la fabrication de métasurfaces33.

Les surfaces modelées avec la fabrication origami-négociée d'ADN peuvent servir de capteurs polyvalents ; par exemple, ils peuvent être utilisés dans la spectroscopie Raman améliorée en surface (SERS). En raison des petites dimensions des nanoformes individuelles, les surfaces créées peuvent trouver des utilisations dans des applications optiques et plasmoniques à la plage de longueur d'onde visible.

Protocol

1. Conception de l'origami d'ADN

REMARQUE : Dans ce protocole, un processus de nanopatterning est décrit à l'aide d'une structure bidimensionnelle (2D) d'origami d'ADN de noeud papillon (figure 1)34. Pour concevoir une nouvelle forme d'origami d'ADN, suivez les lignes directrices ci-dessous :

  1. Concevoir la forme désirée et les séquences de brins de base requises de l'origami d'ADN en utilisant caDNAno35. Pour produire un origami plat à une seule couche, utilisez l'option de treillis carré de caDNAno et ajustez manuellement l'espacement des multilookings en sautant certaines bases dans la conception (voir la figure 1 et le fichier caDNAno supplémentaire) pour supprimer la torsion structurelle résultant du treillis carré d'emballage36,37.
  2. Étendre les extrémités de chaque hélice d'ADN avec des brins contenant des surplombs poly-T (8 nt) ; ceci empêchera la multimerization des objets par des interactions de base-empilement émoussés(figure 1 et fichier caDNAno supplémentaire).
  3. Exécuter une analyse de calcul de la conception. CanDo38,39 peut être utilisé pour prédire la forme tridimensionnelle (3D) et la rigidité structurelle de l'origami d'ADN. CanDo est également un outil utile pour itérer le nombre de sauts de base nécessaires pour la correction de torsion et d'ajuster la conception en conséquence.
  4. Dans caDNAno, choisissez la longueur d'échafaudage préférée et produisez les brins de base nécessaires pour plier la structure. Pour la structure noeud papillon, l'échafaudage M13mp18 long de 7249 nt et 205 brins de base uniques sont utilisés (voir le fichier caDNAno supplémentaire).
    REMARQUE: Il existe également d'autres outils de calcul disponibles pour la conception des structures d'origami D'ADN40,41,42,43. Selon l'outil/logiciel choisi, d'autres outils de simulation peuvent également être utilisés43,44.

2. Assemblage de l'origami d'ADN

  1. Faire le stock de brins de base en mélangeant des quantités égales de tous les oligonucléotides nécessaires pour la structure noeud papillon (au total 205 agrafes)34. Les oligonucléotides devraient tous avoir la même concentration initiale (p. ex., 100 M dans l'eau libre de RNase).
  2. Préparer le mélange de réaction de pliage de l'origami d'ADN en quantités de 100 l dans un tube PCR de 0,2 ml en mélangeant 20 l de brin d'échafaudage M13mp18 (type p7249, à 100 nM), 40 l de solution de stock de base, où chaque brin est à 500 nM (ce qui donne un excès molaire de 10x de agrafes par rapport à à l'échafaudage) et 40 l de 2,5 x tampon de pliage (FOB). FOB contient Tris - acide acétique - éthylènediaminetetratraacetic acid (EDTA) tampon (EDTA) complété avec MgCl2. Voir tableau 1 pour les concentrations de composants FOB.
  3. Anneal le mélange de réaction dans un thermocycler de 90 à 27 oC. Utilisez la rampe de pliage thermique présentée dans le tableau 2.

3. Purification de l'origami d'ADN

REMARQUE : La quantité excessive de brins de base peut être retirée de la solution d'origami d'ADN en utilisant une méthode non destructive de purification poly (éthylène glycol) (PEG). Le protocole est adapté de Stahl et coll.45.

  1. Diluer 200 l de structures d'origami d'ADN assemblées avec 600 oL de 1x FOB (voir tableau 1) pour obtenir un volume de départ de 800 l.
  2. Mélanger la solution d'origami d'ADN dilué 1:1 avec 800 'L de tampon de précipitation PEG (15% PEG 8000 (w/v), 1x TAE, 505 mM NaCl) et mélanger soigneusement en pipetting d'avant en arrière.
  3. Centrifuger le mélange pendant 30 min à 14 000 x g et température ambiante.
  4. Retirez soigneusement le supernatant à l'aide d'une pipette.
  5. Ajouter 200 oL de 1x FOB et mélanger délicatement par pipetting. Une quantité différente de 1x FOB peut également être ajoutée pour obtenir la concentration désirée d'origami d'ADN.
  6. Pour redissoudre les structures d'origami d'ADN (petite pastille transparente dans le fond du tube), incubez les structures d'origami d'ADN purifiés de PEG pendant la nuit à la température ambiante.
  7. Estimer la concentration d'origami d'ADN après la purification de PEG en mesurant l'absorption à une longueur d'onde de 260 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV/Vis. Utilisez la loi Beer-Lambert et un coefficient d'extinction de 1,1 108 M-1 cm-1 pour le calcul6. La concentration typique d'origami d'ADN après la purification de PEG est 15-20 nM.
  8. Entreposez les structures d'origami d'ADN purifiés PEG à 4 oC. Les structures d'origami d'ADN sont habituellement stables pendant des mois ainsi de grandes quantités de stock peuvent être préparées pour l'utilisation ultérieure.
    REMARQUE: La quantité excessive de brins de base peut également être enlevé en utilisant d'autres techniques de purification46, tels que spin-filtration47, le taux de centrifugation zonale48 et l'extraction de gel agarose49. Les structures d'origami d'ADN sont stables dans une série de solutions tampon s'il y a50, et si nécessaire, le support de stockage peut être changé après la purification de PEG par la filtration de spin51.

4. Électrophoresis gel Agarose

REMARQUE : La qualité du pliage et l'élimination de l'excès de brins de base peuvent être vérifiées à l'aide de l'électrophorèse de gel d'agarose.

  1. Préparer un gel agarose de 2 % (w/v) en ajoutant 1 g d'agarose et 45 ml de 1x TAE à un flacon Erlenmeyer. Chauffer le mélange au micro-ondes jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissoute et qu'une solution claire soit produite.
  2. Refroidir la solution sous l'eau courante jusqu'à ce que le flacon soit confortable au toucher (50 à 60 oC).
  3. Ajouter 5 ml de 110 mm MgCl2 et 40 l de solution de bromure d'éhidium (0,58 mg ml-1) à la solution et secouer le mélange doucement.
    CAUTION: Le bromure d'éhidium est un cancérogène potentiel et doit être manipulé avec soin.
  4. Installez le plateau de coulée de gel et versez l'agarose liquide dans le plateau de coulée. Laisser le gel se solidifier à température ambiante pendant au moins 30 min.
  5. Retirer le gel du plateau de coulée et le placer dans une chambre d'électrophorèse de gel. Remplir la chambre d'un tampon de fonctionnement (1x TAE avec 11 mM MgCl2).
  6. Ajouter 1 ll de colorant de chargement de gel 6x par 5 l de solution d'échantillon et bien mélanger. Chargez les échantillons en tapotage soigneusement la quantité désirée des solutions d'échantillon dans des poches de gel séparées.
  7. Faites fonctionner le gel d'agarose à une tension constante de 95 V pendant 45 min. Gardez la chambre d'électrophoresis de gel sur un bain de glace pour la course afin d'éviter des dommages causés par la chaleur au gel.
  8. Visualisez le gel sous la lumière ultraviolette à l'aide d'un système d'imagerie par gel (Figure 2A).

5. Préparation du substrat (Figure 3A)

REMARQUE : Les étapes suivantes sont toutes effectuées à l'intérieur d'une pièce propre, à l'exception de la croissance SiO2 (étape 9). Les étapes de nettoyage peuvent également être remplacées par un nettoyage standard à base de solution de piranha si ce processus n'est pas suffisant pour enlever tous les résidus du substrat.

  1. Couper les copeaux de 7 mm x 7 mm d'une plaquette qui serviront de substrat. Pour SiN, utilisez une scie à silicium, un stylo tailleur de diamants ou un instrument similaire. Le saphir de dégivrage (Al2O3) nécessitera un outil spécialisé ou une lame de scie. La taille des copeaux n'a pas besoin d'être exacte.
  2. Nettoyage des chips.
    1. Immerger les copeaux coupés en dés dans un verre avec de l'acétone chaude (acétone chauffée à 52 oC) et les garder chauffées pendant au moins 15 min. Selon la propreté de départ du substrat, un temps plus long pourrait être nécessaire.
    2. Pendant qu'ils sont encore dans le bain chaud d'acétone, frottez doucement les copeaux avec un coton-tige pour enlever mécaniquement tous les films de résidus.
    3. À l'aide d'une pince à épiler, soulevez les copeaux de l'acétone chaude et utilisez une bouteille de lavage pour les rincer à l'acétone à température ambiante.
    4. Immerger les copeaux dans un verre avec l'isopropanol et l'ultrasonate pendant 2 min.
    5. Soulevez les copeaux de l'isopropanol à l'aide d'une pince à épiler et séchez-les immédiatement et soigneusement à l'aide d'un flux d'azote. Ne touchez et maintenez que les côtés et les bords des copeaux, car les zones couvertes par la pince ne sèchent pas correctement, laissant potentiellement des résidus et d'autres contaminations sur les zones de contact. Pour les meilleurs résultats, utilisez le débit le plus élevé possible et maintenez les surfaces de copeaux parallèles à la direction du débit.
  3. Conservez les croustilles dans un contenant couvert à l'intérieur de la salle blanche pour une utilisation ultérieure.

6. Dépôt de vapeur chimique plasma-amélioré (PECVD) de la couche de silicium amorphe (a-Si) (Figure 3B)

  1. Placez les copeaux dans l'équipement PECVD.
  2. Configurez les paramètres de dépôt pour développer environ 50 nm de silicium amorphe (a-Si). Les réglages exacts varient selon le modèle d'équipement et l'étalonnage. Voir tableau 3 pour les paramètres utilisés ici. Exécutez le programme de dépôt a-Si pour augmenter la couche.
  3. Après le traitement, entreposez les copeaux dans un contenant couvert dans des conditions de pièce propre standard.

7. Traitement plasmatique à l'oxygène de la couche a-Si (Figure 3B)

REMARQUE : Cette étape rendra la surface du substrat légèrement chargée négativement et hydrophile, de sorte que les structures d'origami d'ADN puissent être plus tard effectivement adsorbées à la surface avec l'aide des ions de magnésium additionnels.

  1. Placez les copeaux dans l'équipement réactif de gravure aux ions (RIE).
  2. Configurez les paramètres de gravure pour générer du plasma d'oxygène. Encore une fois, les paramètres exacts varient selon le modèle d'équipement et l'étalonnage. Voir tableau 3 pour les paramètres utilisés ici. Exécuter le programme de traitement plasmadieux à l'oxygène.
  3. Continuer à l'étape suivante immédiatement que les effets du traitement se détériorerrapidement rapidement. Typiquement, les substrats doivent être utilisés dans les 30 minutes suivantes après le traitement plasmatique.

8. Dépôt d'origami d'ADN (figure 3C)

  1. Préparer un mélange d'origami d'ADN pour le dépôt en mélangeant 5 L de solution d'origami d'ADN plié/purifié (20 nM) avec 4 l de 1x FOB et 1 l de 1 M MgCl2. La solution qui en résulte contient 10 nM d'origami d'ADN et environ 100 mm de Mg2.
  2. Déposer 10 l l du mélange d'origami d'ADN sur une puce traitée au plasma d'oxygène et couver à couvert pendant 5 min à température ambiante. Le revêtement empêche le séchage involontaire et aide à enlever les structures de sel et d'origami d'ADN extra-terrestres plus tard.
  3. Après l'incubation, laver la surface en tafilant d'abord 100 l d'eau distillée (p. ex., MilliQ) sur la puce. Rincer l'eau d'avant en arrière à quelques reprises avec la pipette, tout en évitant de toucher le centre de la puce. Retirer la majeure partie de l'eau de la surface avec la pipette. Cela provoque seulement l'origami correctement adsorbed de rester sur la surface.
  4. Répétez ce cycle de lavage (étapes 8.3) 3 à 4 fois.
  5. Après le lavage, sécher l'échantillon immédiatement avec un flux d'azote. Faites-le de la même façon que le séchage dans la préparation du substrat (étape 5). Il est important de sécher l'échantillon aussi soigneusement que possible.
    REMARQUE : La densité des structures déposées et donc la densité des nanostructures métalliques peuvent être modifiées en ajustant la concentration d'origami d'ADN et de Mg2 dans la solution de dépôt. Une concentration plus élevée de Mg 2 améliore l'adhérence à l'origami d'ADN et augmente ainsi la densité, mais elle finira par provoquer également l'agglomération des structures d'origami d'ADN. Ainsi, principalement la concentration d'origami d'ADN devrait être ajustée d'abord.

9. Croissance du masque SiO2 (Figure 3D)

REMARQUE : Cette étape peut être effectuée à l'extérieur de la salle blanche. La version suivante donnera un modèle de ton négatif, mais il est possible de modifier le processus pour donner un modèle de ton positif à la place. Le processus de croissance SiO2 est adapté de Surwade et coll.52, développé par les auteurs53, et finalement optimisé pour ce protocole.

  1. Prenez un dessiccateur scellable (1,5 L), un plat Petri qui s'insère à l'intérieur du dessiccateur (facultatif) et une plaque perforée qui peut fonctionner comme une plate-forme à l'intérieur du dessiccateur.
  2. Prenez 100 g de gel de silice et mélangez-le avec 30 g d'eau distillée dans le plat Petri ou directement dans le dessiccateur. Faites cette étape de préférence au moins 24 h à l'avance pour permettre au gel de silice de se stabiliser.
    REMARQUE: Ceci est utilisé pour contrôler l'humidité à l'intérieur du dessiccateur et donc aussi le taux de croissance et la morphologie du film SiO2. Une humidité plus élevée se traduit par un taux plus élevé et une structure plus grossière. Alternativement, le gel de silice peut être durci dans une chambre d'essai climatique.
  3. Placer le gel de silice dans le dessiccateur et le séparer de la plaque perforée.
  4. Placez les copeaux avec de l'origami d'ADN adsorbed ainsi qu'une fiole ouverte de (frais) 10 ml d'orthosilicate tetraethyl (TEOS) et une autre fiole de 10 ml d'hydroxyde d'ammonium de 25 % (NH4OH) dans le dessiccateur, sur la plate-forme perforée. Définir les flacons près et sur les côtés opposés des échantillons. De préférence, utilisez un bouchon de flacon ou un piédestal plat similaire pour soulever légèrement les copeaux de la plate-forme.
    CAUTION: NH4OH et TEOS sont nocifs en cas de contact avec la peau et leurs vapeurs peuvent causer une irritation des yeux et des organes respiratoires. Utilisez-le dans un endroit bien aéré et portez des gants de protection, une protection oculaire et des vêtements de protection.
  5. Sceller la chambre et couver pendant 20 heures à température ambiante. Cela permettra de développer un film SiO2 sur les zones où les structures d'origami d'ADN ne sont pas situés, la création d'un masque à motifs de 10-20 nm avec des trous en forme d'origami d'ADN (Figure 4).
  6. Retirer les échantillons de la chambre après l'incubation. Conserver dans un contenant couvert. Le traitement peut être mis en pause ici. Disposer du TEOS et du NH4OH usagés. Le lot de gel de silice peut être utilisé 2-3 fois s'il est maintenu scellé à l'intérieur du dessiccateur entre les utilisations et utilisé dans les 2-3 semaines.

10. Gravure d'ion réactif (RIE) de SiO2 et a-Si (Figure 3E)

  1. Placez les copeaux dans l'équipement réactif de gravure aux ions (RIE).
  2. Configurez les paramètres de gravure pour ne gravure que 2-5 nm de SiO2 afin de révéler la couche a-Si sous les trous dans le masque SiO2. Les réglages exacts doivent être déterminés expérimentalement pour l'équipement individuel. Les paramètres utilisés ici sont présentés dans le tableau 3. Exécutez le programme de gravure au plasma anisotrope SiO2.
  3. Configurez les paramètres de gravure pour percer la couche de 50 nm a-Si. Les paramètres utilisés ici sont à nouveau présentés dans le tableau 3. Exécutez le programme de gravure au plasma isotropique a-Si.
  4. Retirez les échantillons de l'équipement RIE et conservez-les couverts. Le traitement peut être à nouveau suspendu ici.

11. Dépôt physique de vapeur (PVD) de métaux (Figure 3F)

  1. Chargez les copeaux dans la chambre d'évaporation de l'instrument PVD.
  2. Choisissez un métal cible. Tout d'abord, choisissez un métal adhésif. Ici, 2 nm de chrome (Cr) est utilisé.
  3. Configurez le programme de contrôle de l'épaisseur pour le matériau cible et l'épaisseur. La méthode de contrôle dépend de l'instrument. Ici, un microbalance de cristal de quartz (QCM) est employé. L'épaisseur mesurée est ajustée par densité de matériau cible et facteur Z et doit être corrigée par un facteur d'outillage déterminé expérimentalement qui est spécifique pour l'appareil et chaque matériau cible.
  4. Démarrez le faisceau d'électrons, alignez le faisceau à la cible et augmentez le courant du faisceau jusqu'à ce qu'un taux de dépôt de 0,05 nm/s soit atteint. Évaporer jusqu'à ce qu'une épaisseur finale de 2 nm soit atteinte.
  5. Choisissez un deuxième métal cible (p. ex. or) sans évacuer la chambre ou interrompre le processus. Les interruptions ou l'évent permettent au métal adhésif de commencer à s'oxyder et de diminuer sa facilité d'utilisation en tant qu'adhésif.
  6. Répétez les étapes 11.3 à 11.4. Évaporer jusqu'à ce que 20 nm soit atteint. Cela créera une structure métallique en forme d'origami d'ADN à travers les trous de masque SiO2 d'une hauteur totale de 22 nm.
  7. Ventiler la chambre et retirer les échantillons.
  8. Le traitement peut être interrompu ici si les échantillons sont stockés couverts.

12. Décollage avec de l'acide fluorhydrique (HF) (Figure 3G)

  1. Verser la solution d'étchant à base de HF à 50 % dans un contenant en plastique approprié. Aucun HCl ne devrait être utilisé pour le mélange, puisque HCl serait gravé le Cr dans l'échantillon.
    CAUTION: HF est extrêmement corrosif, provoque une irritation grave et des brûlures et peut être fatale sur le contact cutané ou si inhalé. Utilisez HF uniquement dans une hotte de fumée dédiée ou un banc humide ventilé avec un tablier protecteur, des gants résistants aux produits chimiques et une visière pour le visage, ou autrement une protection chimique complète.
  2. Immerger les échantillons dans l'étchanter à base de HF et remuer délicatement avec des pinces en plastique.
  3. Attendez que la couche SiO2 se détache complètement et que la couche métallique se détache. Le temps varie sensiblement en fonction de la densité des trous de masque. Un plus grand nombre de trous se traduira par une gravure plus rapide. Si la couche métallique est difficile à décoller, une brève ultrasonation de 5 à 10 s peut être utilisée.
  4. Une fois le film métallique se détache, rincer les échantillons avec de l'eau à double distillation et de l'isopropanol.
  5. Après le rinçant, sécher les échantillons avec un flux d'azote de la même manière que indiqué pour la préparation du substrat (étape 5). Évitez le contact des pinces avec le centre de la puce, car cela peut détruire les nanostructures formées.
    REMARQUE : Les échantillons peuvent être stockés et suspendus ici.

13. RIE de rester a-Si (Figure 3H)

  1. Placez les copeaux dans l'équipement réactif de gravure aux ions (RIE).
  2. Configurez les paramètres de gravure pour l'élimination complète des 50 nm d'un-Si. Les paramètres peuvent être les mêmes que dans l'étape 10, mais un temps de gravure légèrement plus long (40 s) peut être utilisé pour assurer la suppression de tous les a-Si. Voir tableau 3 pour les paramètres utilisés ici.  Exécutez le programme de gravure au plasma isotropique a-Si pour supprimer le reste a-Si.
  3. Retirez les échantillons de l'équipement RIE et conservez-les couverts. Ceci conclura le traitement d'échantillon.

14. Microscopie de force atomique (AFM)

REMARQUE : La microscopie par force atomique et la microscopie électronique à balayage peuvent être utilisées pour surveiller le succès de la croissance et du modelage du film ainsi que pour l'image des structures d'origami d'ADN pliées(figure 2B,C). L'étape de préparation de l'échantillon suivante peut être ignorée si des échantillons traités des étapes 5-13 sont représentés.

  1. Préparation de l'échantillon pour l'AFM
    1. Pour imager l'origami d'ADN plié, prenez une puce de substrat de mica.
    2. Fixez la puce mica à une lame de microscope en verre à l'aide d'un adhésif.
    3. Préparer une solution d'origami d'ADN de 10 L en diluant le stock d'origami d'ADN de 20 nM 50 fois dans 1x FOB à une concentration d'environ 0,4 nM. La dilution est effectuée afin d'éviter la surpopulation du substrat.
    4. Peler la couche supérieure de la feuille de mica avec du ruban adhésif faible pour obtenir une surface fraîchement fendée et chargée.
    5. Déposer la solution diluée d'origami d'ADN sur le mica fraîchement clivé et couver l'échantillon couvert pendant 1 min à température ambiante.
    6. Après l'incubation, laver la surface 3-4 fois avec 100 l d'eau distillée à l'aide d'une pipette. Cela provoque seulement l'origami correctement adsorbed de rester sur la surface.
    7. Déposer 100 l'eau distillée sur la surface du mica.
    8. Inclinez et appuyez fortement sur la lame du microscope sur la table pour détacher la majeure partie de l'eau.
    9. Répétez ce cycle de lavage 3-4 fois.
    10. Séchez soigneusement l'échantillon à l'effet d'un écoulement d'azote immédiatement après le lavage. L'échantillon est alors prêt pour l'imagerie AFM.
  2. Placez les échantillons d'origami d'ADN ou les puces traitées dans un AFM et effectuez des scans. Une taille d'analyse de 1-10 m est appropriée pour résoudre correctement les structures.

15. Microscopie électronique à balayage (SEM)

  1. Placez les échantillons dans un SEM. Les puces traitées peuvent être utilisées telles qu'elles sont (une préparation supplémentaire de l'échantillon n'est pas nécessaire).
  2. Choisissez la tension d'accélération. Utilisez des basses tensions (5-10 kV) pour réduire les effets de charge puisque le substrat de l'échantillon (Al2O3 ou SiN) est un isolant.
  3. Scannez tous les domaines d'intérêt. Réduire au minimum les temps de balayage afin de réduire le chargement et d'éviter le dépôt de contamination.

Representative Results

Une figure schématique de la conception d'origami d'ADN de noeud papillon et de ses détails structurels sont montrées dans la figure 1. L'électrophorèse de gel d'Agarose et l'AFM sont utilisées pour analyser le pliage de l'origami d'ADN et la qualité de la purification du PEG (Figure 2). Le flux de processus des étapes de nanolithographie est affiché dans la figure 3. Les images représentatives de l'AFM après la croissance du masque SiO2 sont montrées à la figure 4 (cette étape est représentée dans la figure 3D), tandis que les images SEM des nanostructures métalliques finales peuvent être vues dans la figure 5 (cette étape est représentée dans Figure 3H). La figure 6 démontre la fonctionnalité optique des nanostructures métalliques modélisées par l'origami d'ADN noeud papillon.

Concentrations de composants de tampon de pliage (FOB) [mM]
Tris acide Edta Chlorure de magnésium Ph
2.5x FOB 100 47.5 2.5 31.25 8,3 euros
1x FOB 40 19 1 12.5 8,3 euros

Tableau 1 : Composition du tampon pliant (FOB).

Gamme de température [oC] Taux de refroidissement
90-70 -0.2 C / 8 s
70-60 -0.1 C / 8 s
60-27 -0.1 C / 2 s
12 Tenir jusqu'à ce qu'il soit arrêté

Tableau 2 : Rampe thermique pour le pliage origami noeud papillon. Après l'annexion, l'origami sera stocké à 12 oC jusqu'à ce que le programme soit arrêté manuellement.

Paramètres PECVD et RIE
essence Flux de gaz [sccm] Pression de chambre [mTorr] Puissance RF [W] Température [oC] Durée [s]
PECVD de a-Si 5% SiH4 en N2 500 1000 15 250 90
O2 traitement plasmatique O2 50 40 200 30 1200
RIE de SiO2 CHF3 25
Ar 25 30 100 25 10-22
RIE de a-Si O2 8
SF6 Annonces 100 90 50 30 35
RIE de rester a-Si O2 8
SF6 Annonces 100 90 50 30 35-40

Tableau 3 : Paramètres de traitement pour le dépôt de vapeur chimique plasma-amélioré (PECVD) et la gravure réactive d'ion (RIE). Les paramètres de processus de ces dispositifs sont spécifiques à des instruments individuels et peuvent devoir être adaptés lorsqu'ils sont utilisés.

Figure 1
Figure 1: Conception de l'origami d'ADN de noeud papillon. (A) Représentation schématique de la conception origami noeud papillon dans lequel la structure de base est montré comme double hélice et les polyT-surplombs sont représentés comme des lignes ondulées. (B) Capture d'écran d'une partie de la conception origami noeud papillon dans le logiciel caDNAno. Les croix rouges dénotent la paire de base ensautant pour la correction de torsion, et les t 8-surplombs sont ajoutés pour empêcher l'empilement de base émoussé-extrémité. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Caractérisation de la structure origami d'ADN de noeud papillon. (A) Électrophoresis de gel d'agarose de la structure de noeud papillon avant et après la purification de poly (éthylène glycol) (PEG). Le long échafaudage de 7249 nucléotides est utilisé comme référence. (B) Image de microscopie de force atomique (AFM) des structures de noeud papillon avant la purification. (C) Image AFM des structures de noeud papillon après la purification de PEG. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3: Schéma de flux de processus de fabrication (les dimensions ne sont pas à l'échelle). (A) Dés et nettoyer le substrat. (B) Déposer une couche a-Si par dépôt de vapeur chimique amélioré par plasma (PECVD). Il est possible d'employer une couche sacrificielle supplémentaire sous l'a-Si pour permettre le décollage avec l'étchant autre que HF. (C) Traiter la surface de l'échantillon avec du plasma O2 et déposer de l'origami d'ADN sur elle. (D) Cultivez le masque SiO2 en dessiccateur. (E) Etch une fine couche de SiO2 et à travers l'a-Si en dessous par gravure à l'ion réactif (RIE). (F) Déposer le métal à travers le masque par dépôt de vapeur physique (PVD). (G) Décollage avec HF. (H) supprimer le reste a-Si par RIE. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4

Figure 4: Images représentatives de l'AFM du film SiO2 avec le motif en forme d'origami d'ADN. (A) 10 m x 10 m de surface de balayage démontre le rendement élevé de la formation du motif. (B) Un balayage plus proche de 3 m x 3 m montre les motifs individuels précis du film SiO2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5: Images représentatives demicroscopie électronique à balayage(SEM) de nanostructures métalliques modélisées avec de l'origami d'ADN structurellement différent. (A) Origami d'ADN en forme de croix, c'est-à-à-d., soi-disant origami de tuile seeman54. (B) Antennes Bowtie. (C) Structures chirales à double L (CDL). Les ensembles montrent des structures individuelles avec des tailles de boîte de 150 nm x 150 nm. Le rendement de fabrication des structures exactes est jusqu'à 76% pour le noeud papillon origami et - 50% pour les autres structures affichées ici34. Ce chiffre a été adapté et modifié à partir de Shen et coll.34. Le chiffre est reproduit avec la permission des auteurs et publié par the American Association for the Advancement of Science, 2018. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6: Propriétés optiques/fonctionnelles représentatives des nanostructures résultantes. (A) Mesures localisées de résonance plasmon de surface (LSPR) d'une structure individuelle de noeud papillon d'or avec la polarisation différente (couleur codée comme orange et bleu). Les lignes solides sont mesurées spectrales et les lignes pointillées sont des résultats de simulation. Les insets montrent l'image SEM de la particule mesurée (à gauche) et le modèle utilisé pour la simulation (à droite). (B) Spectroscopie Raman améliorée de surface (SERS) de rhodamine 6G et 2,2-bipyridine mesurée sur une surface couverte de nanostructures noeud papillon. La ligne de base de chaque échantillon indique le niveau de signal lorsque les nanostructures étaient absentes. Ce chiffre a été adapté et modifié à partir de Shen et coll.34. Le chiffre est reproduit avec la permission des auteurs et publié par the American Association for the Advancement of Science, 2018. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplemental File 1
Fichier supplémentaire 1: Fichier CaDNAno S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplemental File 2
Fichier supplémentaire 2: séquence m13mp18 S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplemental File 3
Fichier supplémentaire 3: Séquence brin Destaple S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le protocole offre une grande liberté et précision sous la forme de nanostructures produites. En modifiant la conception de l'origami d'ADN, la forme des nanostructures métalliques peut être contrôlée. La forme finale et exacte des structures métalliques est en outre déterminée par l'étape de croissance du masque (étape 9) et, dans une moindre mesure, par la gravure du masque (étape 10) si elle n'est pas anisotropique. Si le temps de croissance du masque est suffisamment prolongé, les trous dans le masque commenceront à se refermer. Cela peut être utilisé pour omettre les caractéristiques les plus minces de certaines structures et la taille des écarts de contrôle, comme démontré dans Shen et al.34 avec des triangles séparés de l'origami noeud papillon (Figures 5B). Inversement, les formes plus minces peuvent être mieux préservées en raccourcissant le temps de croissance de l'oxyde. Cela signifie qu'il est possible de régler les propriétés optiques affichées dans la figure 6, non seulement en changeant la conception d'origami utilisé, mais aussi en accordant la croissance du film SiO2.

Si l'épaisseur du masque est modifiée de manière significative, ce changement doit également être reflété dans l'étape SiO2 RIE. Seule une très mince couche de SiO2 doit être gravée (2-5 nm) pour percer à peine les trous du masque. C'est la partie la plus sensible et cruciale de tout le processus. Étant donné que le temps de gravure est extrêmement court, seulement 10-20 s, les paramètres exacts doivent être déterminés expérimentalement lors de la première tentative avec de nouveaux équipements. Cela est également vrai pour l'étape 10.4 que certains SiO2 est également gravé au cours de la gravure a-Si. L'étendue du SiO2 gravé est déterminée par la sélectivité des paramètres de etch a-Si utilisés, de l'équipement et même des étalonnages individuels de l'équipement. Il faut prendre soin de ne pas défoncirer toute la couche SiO2 au cours de ces deux processus.

Une autre étape sensible est la croissance SiO2. Le processus de croissance dépend à la fois de l'humidité de la chambre et de l'activité actuelle du TEOS utilisé. TEOS se dégrade à mesure qu'il adsobe l'eau de l'air, ce qui la rend moins efficace avec l'âge. Cela peut se manifester comme un taux de croissance beaucoup plus lent et moins contrôlable en quelques mois, même avec un stockage approprié du produit chimique. 34 Si la couche SiO2 qui en résulte est plus mince que prévu, cela peut indiquer un problème avec TEOS plutôt que l'humidité de la chambre. Bien qu'une humidité plus faible puisse également entraîner un taux de croissance plus faible et un film plus mince, le film qui en résulte devrait également être plus lisse que la normale. Pendant ce temps, une couche grossière granulée et rugueuse indiquerait à l'inverse un problème d'humidité élevée.

Il est également possible d'effectuer ce protocole sur tout autre substrat librement choisi avec deux exigences : il doit tolérer à la fois la gravure HF (étape 12) et les températures de 200-300 oC du PECVD (étape 6). La température peut être abaissée en toute sécurité à 100 oC pour le PECVD d'un-Si si un substrat plus sensible est utilisé, mais HF ne peut pas être évitée si le protocole est suivi exactement comme décrit. Pour contourner HF, l'application d'une couche sacrificielle supplémentaire serait nécessaire. Si l'exigence de la gravure HF est supprimée, ce protocole deviendrait compatible avec une plus grande sélection de matériaux et de métaux de substrat.

Comme ce protocole se compose de processus de micro- et nanofabrication couramment utilisés et robustes, il pourrait être combiné avec un certain nombre d'autres protocoles de microfabrication où de petites tailles d'entités et des formes métalliques complexes sont souhaitées. Dans un proche avenir, en particulier avec l'arrivée de l'ADN à faible coût origami production de masse31, il est possible pour cette méthode de faciliter à la fois l'utilisation générale et le nanopatterning à haut débit pour la nanophotonique basée sur l'interface et la plasmonique55 .

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par l'Académie de Finlande (projets 286845, 308578, 303804, 267497), la Fondation Jane et Aatos Erkko, et la Fondation Sigrid Jusélius. Ce travail a été réalisé dans le cadre du programme des Centres d'excellence de l'Académie de Finlande (2014-2019). Nous reconnaissons la fourniture d'installations et de soutien technique par les installations de bioéconomie de l'Université d'Aalto et le Centre de nanomicroscopie D'OtaNano (Aalto-NMC) et le Centre de nanofabrication Micronova.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Honeywell 40289H Semiconductor grade ULSI, ≥ 99.5 %
Agarose Fisher Bioreagents 1036603 Low-EEO, multi-purpose and molecular biology grade
Ammonium hydroxide Fisher Chemical 10652251 25 % ammonia solution, Certified AR for Analysis, d = 0.91
BRANSON 5510 Branson Ultrasonic bath
Dimension Icon Bruker Atomic force microscope
Electron-beam evaporator IM-9912 Instrumentti Mattila Evaporator for PVD
Ethidium bromide Sigma Aldrich E8751 Fluorescent dye for DNA staining
Eon Microplate spectrophotometer BioTek UV/Vis spectrophotometer used for DNA origami concentration measurements
Gel Doc XR+ Documentation System BioRad Gel imaging system
Gel Loading Dye, Blue (6×) New England Biolabs B7021S Bromophenol blue-based loading dye for agarose gel electrophoresis
G-storm GS1 Thermal cycler Gene Technologies
HBR 4 IKA Heating bath
Hydrofluoric acid Honeywell 40213H Semiconductor grade, 49.5-50.5 %
Isopropanol Honeywell 40301H Semiconductor grade VLSI, ≥ 99.8 %
Magnesium chloride Sigma Aldrich M8266 Anhydrous, ≥ 98 %
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System BioRad
Plasmalab 80+ PECVD Oxford Instruments PECVD system
Plasmalab 80+ RIE Oxford Instruments RIE system
Poly(ethylene glycol) Sigma Aldrich 89510 BioUltra, 8,000
PowerPac HC High-Current Power Supply BioRad
Sapphire substrate (Al2O3) University Wafer Thickness: 430 μm, Polish: DSP, Size: 50.8 mm
Sigma VP Zeiss Scanning electron microscope
Silica gel Merck 1019691000 With indicator (orange gel), granulate ~1-3 mm
Single-stranded Scaffold DNA, type p7249 Tilibit Nanosystems At 100 nM concentration
Sodium chloride Sigma Aldrich S9888 ACS reagent, ≥ 99.0 %
Staple strands (oligonucleotides) Integrated DNA Technologies Sequences can be ordered e.g. at 100 micromolar in Rnase-free water
TAE buffer (50×) pH 8.0 VWR Chemicals 444125D Electran Electrophoresis grade
Take3 micro-volume plate BioTek Used for DNA origami concentration measurements
Tetraethyl orthosilicate Sigma Aldrich 86578 ≥ 99.0 % (GC)

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