DNA origami-medieret substrat Nanopatterning af uorganiske strukturer til sensing applikationer

Chemistry
 

Summary

Her beskriver vi en protokol til at skabe diskrete og nøjagtige uorganiske nanostrukturer på substrater ved hjælp af DNA origami figurer som vejledende skabeloner. Metoden er demonstreret ved at skabe plasmoniske guld Bowtie-formede antenner på et gennemsigtigt substrat (Sapphire).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Piskunen, P., Shen, B., Julin, S., Ijäs, H., Toppari, J. J., Kostiainen, M. A., Linko, V. DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications. J. Vis. Exp. (151), e60313, doi:10.3791/60313 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Strukturel DNA-nanoteknologi giver en bæredygtig vej til at bygge fra bunden med DNA som byggemateriale. Den mest almindelige DNA nanofabrication teknik kaldes DNA origami, og det giver høj gennemløb syntese af præcise og meget alsidige strukturer med nanometer-niveau præcision. Her er det vist, hvordan den rumlige information af DNA origami kan overføres til metalliske nanostrukturer ved at kombinere bottom-up DNA origami med konventionelt anvendte top-down litografi tilgange. Dette gør det muligt at fremstilling af milliarder af små nanostrukturer i ét trin på udvalgte substrater. Metoden er demonstreret ved hjælp af Bowtie DNA origami til at skabe metalliske Bowtie-formede antenne strukturer på silicium nitrid eller safir substrater. Metoden er afhængig af den selektive vækst af et siliciumoxid lag på toppen af origami deposition substrat, hvilket resulterer i en mønstmaskning for følgende litografiske trin. Disse nanostruktur udstyrede overflader kan anvendes yderligere som molekylære sensorer (f. eks. overflade forstærket Raman-spektroskopi (SERS)) og i forskellige andre optiske applikationer ved det synlige bølgelængde område på grund af de små funktions størrelser (sub-10 nm). Teknikken kan udvides til andre materialer gennem metodologiske ændringer; Derfor kan de resulterende optisk aktive overflader finde anvendelse i udviklingen af metamaterialer og metasurfaces.

Introduction

Strukturel DNA nanoteknologi har hurtigt udviklet sig i løbet af det seneste årti1,2, og den mest indflydelsesrige udvikling på området har velsagtens været opfindelsen af DNA origami3,4. DNA origami teknikken tillader fabrikation af stort set enhver nanoform med nøjagtige strukturelle funktioner3,4. Denne kraftfulde metode kan anvendes i (sub) nanometer-præcise rumlige arrangement og forankring af andre Nano-objekter, såsom Carbon Nanorør5, metal nanopartikler6,7,8, 9, enzymer/proteiner10,11,12,13 og terapeutiske materialer14,15,16,17 . Vigtigere er, at disse strukturer ikke blot statiske, men de kan også programmeres til at handle på en dynamisk måde18,19. De utallige anvendelser af DNA-origami spænder fra levering af lægemidler20,21,22 til molekylær elektronik/plasmonics5,23,24, 25 og fra materialevidenskab26,27 til nye billeddannelses-og kalibrerings teknikker28.

Ud over de ovennævnte anvendelser kunne den ekstreme rumlige opløsning af DNA-origami figurerne udnyttes i nanopatterning og delikat nanoskala litografi29,30. Denne protokol beskriver en litografi metode til at skabe diskrete og præcise uorganiske nanostrukturer på substrater ved hjælp af DNA origami skabeloner. Disse skabeloner kan produceres effektivt i forskellige former og i store mængder31og deponeres ubesværet på udvalgte substrater i store skalaer32. Disse egenskaber giver mulighed for en meget parallel fabrikation af milliarder af nanostrukturer i et trin i modsætning til almindeligt anvendte, men snarere langsom elektronstråle litografi eller andre scannings baserede nanofabrikation teknikker.

Heri er fabrikationsprocessen demonstreret ved at skabe guld Bowtie-formede strukturer på silicium nitrid og safir substrater; med andre ord, den rumlige information af DNA origami er overført til helt metalliske nanostrukturer. Som diskuteret her, teknikken er ikke begrænset til den valgte Bowtie DNA origami struktur, da metoden gør det muligt at bruge næsten enhver DNA origami form. Desuden kan teknikken med metodiske modifikationer udvides til at omfatte forskellige metaller og substrater, der baner vejen mod fabrikation af metasurfaces33.

Overfladerne mønstrede med DNA origami-medieret fabrikation kan tjene som alsidige sensorer; for eksempel kan de anvendes i overflade forstærket Raman spektroskopi (SERS). Som et resultat af de små dimensioner af de enkelte nanoformer, kan de skabte overflader finde anvendelser i optiske og plasmoniske applikationer på det synlige bølgelængde område.

Protocol

1. design af DNA origami

Bemærk: i denne protokol beskrives en nanopatterproces ved hjælp af en todimensional (2D) Bowtie DNA origami-struktur (figur 1)34. Følg nedenstående retningslinjer for at designe en ny DNA-origami-form:

  1. Design den ønskede form og de påkrævede hæfte streng sekvenser af DNA-origami ved hjælp af caDNAno35. For at producere en flad, enkeltlags origami, ansætte Square gitter mulighed for caDNAno og manuelt justere crossover afstanden ved at springe nogle baser i designet (Se figur 1 og den supplerende cadnano fil) for at fjerne den strukturelle twist resulterer fra den firkantede gitter pakning36,37.
  2. Udvid enderne af hver DNA-Helix med tråde, der indeholder poly-T (8 NT) udhæng; Dette vil forhindre multimerization af objekterne gennem stump-ende base-stabling interaktioner (figur 1 og supplerende cadnano fil).
  3. Kør en beregningsmæssige analyse af designet. Cando38,39 kan bruges til at forudsige den tredimensionelle (3D) form og strukturel stivhed af DNA origami. Cando er også et nyttigt værktøj til at gentage antallet af base springer behov for twist korrektion og til at justere designet i overensstemmelse hermed.
  4. I caDNAno skal du vælge den foretrukne stilladser længde og generere de korte tråde, der er nødvendige for at folde strukturen. For Bowtie-strukturen anvendes 7249 NT Long M13mp18 stillads og 205 unikke hæfte tråde (se den supplerende cadnano-fil).
    Bemærk: der er også andre beregningsmæssige værktøjer til rådighed til at designe DNA origami strukturer40,41,42,43. Afhængigt af det valgte værktøj/software kan andre simuleringsværktøjer også anvendes43,44.

2. samling af DNA origami

  1. Lav bestanden af hæfte tråde ved at blande lige store mængder af alle de oligonukleotider, der er nødvendige for Bowtie-strukturen (i alt 205 hæfteklammer)34. Oligonukleotider skal alle have samme initialkoncentration (f. eks. 100 μM i RNase-frit vand).
  2. Den DNA-origami folde reaktionsblanding forberedes i 100 μL mængder i et 0,2 mL PCR-rør ved at blande 20 μL M13mp18 stillads-streng (type p7249, ved 100 nM), 40 μL hæfte stamopløsning, hvor hver streng er på 500 nM (hvilket giver ~ 10x molær overskydende hæfteklammer sammenlignet til stilladset) og 40 μL 2,5 x folde buffer (FOB). FOB indeholder Tris-eddikesyre-ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) buffer (TAE) suppleret med MgCl2. Se tabel 1 for koncentrationen af fob-komponenterne.
  3. Udglødet reaktionsblandingen i en termo cycler fra 90 °C til 27 °C. Brug den termiske folde rampe, der er præsenteret i tabel 2.

3. rensning af DNA-origami

Bemærk: den overskydende mængde af hæfte tråde kan fjernes fra DNA-origami-opløsningen ved hjælp af en ikke-destruktiv poly (ethylenglykol) (PEG) oprensnings metode. Protokollen er tilpasset fra Stahl et al.45.

  1. 200 μL samlede DNA-origami-strukturer fortyndes med 600 μL 1x FOB (Se tabel 1) for at opnå en startvolumen på 800 μl.
  2. Bland den fortyndede DNA-origami opløsning 1:1 med 800 μL PEG-udfældnings buffer (15% PEG 8000 (w/v), 1x TAE, 505 mM NaCl) og bland grundigt ved pipettering frem og tilbage.
  3. Blandingen centrifugeres i 30 minutter ved 14.000 x g og stuetemperatur.
  4. Fjern forsigtigt supernatanten med en pipette.
  5. Tilsæt 200 μL 1x FOB og bland forsigtigt ved pipettering. En anden mængde 1x FOB kan også tilsættes for at opnå den ønskede DNA origami koncentration.
  6. At opløse DNA origami strukturer (lille transparent pellet i bunden af røret), inkubere den PIND renset DNA origami strukturer natten over ved stuetemperatur.
  7. Beregn DNA-origami-koncentrationen efter PEG-rensning ved at måle absorbansen ved en bølgelængde på 260 nm ved hjælp af et UV/Vis-Spektrofotometer. Brug Beer-Lambert-loven og en ekstinktionskoefficient på 1,1 ∙ 108 M-1 cm-1 til beregning6. Typisk DNA origami koncentration efter PEG rensning er 15-20 nM.
  8. Opbevar den PIND renset DNA origami strukturer ved 4 °C. DNA origami strukturer er normalt stabile i månedsvis så store mængder af bestanden kan forberedes til senere brug.
    Bemærk: den overskydende mængde af hæfte tråde kan også fjernes ved hjælp af andre rensningsteknikker46, såsom spin-filtrering47, sats zone centrifugering48 og agrose gel ekstraktion49. DNA origami strukturer er stabile i en række buffer løsninger50, og hvis det er nødvendigt, kan lagringsmediet ændres efter pind rensning gennem spin filtrering51.

4. agrose gel elektroforese

Bemærk: kvaliteten af foldningen og fjernelsen af overskydende hæfte tråde kan verificeres ved hjælp af agrose gel elektroforese.

  1. Forbered en ~ 2% (w/v) agopstået gel ved tilsætning af 1 g agopstået og 45 mL 1x TAE til en Erlenmeyer kolbe. Opvarm blandingen i en mikrobølgeovn, indtil agopden er helt opløst, og der produceres en klar opløsning.
  2. Afkøl opløsningen under rindende vand, indtil kolben er behagelig at røre ved (50 – 60 °C).
  3. Tilsæt 5 mL 110 mM MgCl2 og 40 μl ethidium bromid opløsning (0,58 mg ml-1) til opløsningen, og ryst blandingen forsigtigt.
    Forsigtig: ethidium bromid er et potentielt kræftfremkaldende og bør håndteres med forsigtighed.
  4. Sæt geludstøvnings bakken på, og hæld væsken i støbe bakken. Lad gelen størkne ved stuetemperatur i mindst 30 minutter.
  5. Tag gelen ud af støbe bakken, og anbring den i et gelelektroforese kammer. Fyld kammeret med løbe buffer (1x TAE med 11 mM MgCl2).
  6. Tilsæt 1 μL 6x gel-indlæsnings farve pr. 5 μL prøveopløsning, og bland grundigt. Læg prøverne ved omhyggeligt at pipettere den ønskede mængde prøveopløsninger i separate gel lommer.
  7. Kør agrose gel ved en konstant spænding på 95 V for 45 min. Opbevar gelelektroforese kammeret på et isbad til kørslen for at undgå varme skader på gelen.
  8. Visualiser gelen under ultraviolet lys ved hjælp af et gelbilledbehandlings system (figur 2a).

5. substrat tilberedning (figur 3A)

Bemærk: de følgende trin udføres alle i et rent rum, bortset fra SiO2 -væksten (trin 9). Rengørings trinnene kan også erstattes med en standardløsning baseret på Piranha-opløsning, hvis denne proces ikke er nok til at fjerne alle rester fra substratet.

  1. Skær 7 mm x 7 mm chips fra en wafer, der skal anvendes som substrat. For synd, brug en silicium sav, en diamant cutter pen eller et lignende redskab. Dicing Sapphire (al2O3) vil kræve et specialiseret værktøj eller savklinge. Chip størrelse behøver ikke at være præcis.
  2. Rengøring af chips.
    1. Nedsænk de tern-chips i et glas med varm acetone (acetone opvarmet til 52 °c), og hold dem opvarmet i mindst 15 min. afhængigt af start rengøringen af substratet kan det være nødvendigt med længere tid.
    2. Mens de stadig er i det varme acetone bad, Gnid forsigtigt chips med en vatpind til mekanisk at fjerne eventuelle rester film.
    3. Brug pincet, løft chips fra den varme acetone og brug en vaskeflaske til at skylle dem med stuetemperatur acetone.
    4. Sænk chips i et glas med isopropanol og ultrasonicate i 2 min.
    5. Løft spånerne ud fra isopropanol med pincet og tør dem straks og grundigt ved hjælp af en nitrogenstrøm. Kun røre og holde siderne og kanterne af chips, som områder, som er dækket af pincet vil ikke tørre ordentligt, efterlader potentielt rester og anden forurening på kontaktområder. For de bedste resultater skal du bruge så højt flow som muligt og holde spån fladerne parallelt med strømningsretningen.
  3. Opbevar chips i en overdækket beholder inde i renrummet til senere brug.

6. plasma forstærket kemisk damp aflejring (PECVD) af det Amorfe silicium (a-Si)-lag (figur 3B)

  1. Placer chips i PECVD-udstyret.
  2. Sæt aflejrings parametrene op til at vokse groft 50 nm af Amorfe silicium (a-Si). De nøjagtige indstillinger varierer efter udstyrsmodel og kalibrering. Se tabel 3 for de parametre, der anvendes her. Kør a-Si deposition program til at dyrke laget.
  3. Efter forarbejdning opbevares chips i en overdækket beholder i standard Clean Room betingelser.

7. iltplasma behandling af a-Si-laget (figur 3B)

Bemærk: dette trin vil gøre substrat overfladen lidt negativt opladet og hydrofile, således at DNA origami strukturer kan senere effektivt adsorbe til overfladen ved hjælp af yderligere magnesium ioner.

  1. Placer flisene i det reaktive ionetching (RIE)-udstyr.
  2. Indstil ætsning parametre til at generere ilt plasma. Igen, nøjagtige indstillinger varierer efter udstyrsmodel og kalibrering. Se tabel 3 for de parametre, der anvendes her. Kør oxygen plasma behandlingsprogrammet.
  3. Fortsæt til næste trin straks, da virkningerne af behandlingen vil forværres hurtigt. Typisk skal substrater anvendes inden for de næste 30 minutter efter plasma behandlingen.

8. deposition af DNA-origami (figur 3C)

  1. Forbered en DNA-origami blanding til deposition ved at blande 5 μL foldet/renset DNA-origami opløsning (~ 20 nM) med 4 μL 1x FOB og 1 μL 1 M MgCl2. Den resulterende opløsning indeholder ~ 10 nM DNA origami og groft 100 mM af mg2 +.
  2. Indbetal 10 μL DNA-origami-blandingen på en oxygen plasma behandlet chip, og Inkuber dækket i 5 minutter ved stuetemperatur. Belægning forhindrer utilsigtet tørring og aids i at fjerne fremmede salt og DNA origami strukturer senere.
  3. Efter inkubation vaskes overfladen ved først at pipettere 100 μL destilleret vand (f. eks. MilliQ) på chippen. Skyl vandet frem og tilbage et par gange med pipetten, og undgå at røre midten af chippen. Fjern det meste af vandet fra overfladen med pipetten. Dette medfører, at kun den korrekt adsorbede origami til at forblive på overfladen.
  4. Gentag denne vaskecyklus (trin 8,3) 3 til 4 gange.
  5. Efter vask tørres prøven straks med en nitrogenstrøm. Gør dette på samme måde som tørring i substrat forberedelse (trin 5). Det er vigtigt at tørre prøven så grundigt som muligt.
    Bemærk: tætheden af de deponerede strukturer og dermed tætheden af metal nanostrukturerne kan ændres ved at justere koncentrationen af DNA-origami og mg2 + i aflejrings opløsningen. Højere mg2 + koncentration forbedrer DNA origami vedhæftning og dermed øger tæthed, men det vil i sidste ende også forårsage AGGLOMERERING af DNA origami strukturer. Således, primært DNA origami koncentration bør justeres først.

9. vækst af SiO2 maske (figur 3D)

Bemærk: dette trin kan udføres uden for renrummet. Følgende version vil give et negativt tone mønster, men det er muligt at ændre processen for at give et positivt tone mønster i stedet. SiO2 vækstprocessen er tilpasset fra surwade et al.52, udviklet yderligere af forfatterne53, og endelig optimeret til denne protokol.

  1. Tag en forseglbar ekssikkator (1,5 L), en Petri skål, der passer ind i ekssikkator (valgfrit) og en perforeret plade, der kan fungere som en platform inde i ekssikkator.
  2. Tag 100 g silicagel og bland det med 30 g destilleret vand i Petri skålen eller direkte i desiccator. Gør dette trin helst mindst 24 h i forvejen for at tillade silicagel til at stabilisere.
    Bemærk: dette bruges til at styre fugtigheden inde i ekssikkator og derfor også vækstraten og morfologien af SIO2 -filmen. Højere luftfugtighed resulterer i højere hastighed og grovere struktur. Alternativt kan silicagelen helbredes i et klima test kammer.
  3. Placer silicagelen i ekssikkator, og Adskil den med den perforerede plade.
  4. Anbring chips med adsorberede DNA-origami samt et åbent hætteglas med (friske) 10 mL Tetraethylorthosilicat (TEOS) og et andet hætteglas med 10 mL 25% ammoniumhydroxid (NH4Oh) i desiccator på den perforerede platform. Sæt hætteglassene i nærheden af og på modsatte sider af prøverne. Brug helst en kolbe kork eller en lignende flad piedestal til lidt hæve chips fra platformen.
    Forsigtig: både NH4Oh og Teos er skadelige i tilfælde af hudkontakt, og deres dampe kan forårsage irritation af både øjne og åndedrætsorganer. Brug i et godt ventileret område og bær beskyttelseshandsker, Øjenværn og beskyttende beklædning.
  5. Forsegl kammeret og Inkuber i 20 timer ved stuetemperatur. Dette vil vokse en SiO2 film på de områder, hvor DNA origami strukturer ikke er placeret, skabe en 10-20 Nm mønstrede MASKE med DNA origami formede huller (figur 4).
  6. Fjern prøverne fra kammeret efter inkubation. Opbevares i en dækket beholder. Behandlingen kan afbrydes her. Bortskaf den brugte TEOS og NH4Oh. Partiet af silicagel kan anvendes 2-3 gange, hvis det holdes forseglet inde i ekssikkator mellem anvendelser og anvendes inden for 2-3 uger.

10. reaktiv ion-ætsning (RIE) af SiO2 og a-si (figur 3E)

  1. Placer flisene i det reaktive ionetching (RIE)-udstyr.
  2. Opsætning af ætsning parametre til kun etch 2-5 nm af SiO2 for at afsløre a-Si lag under hullerne i SIO2 maske. De nøjagtige indstillinger skal bestemmes eksperimentelt for det enkelte udstyr. De parametre, der anvendes her, er vist i tabel 3. Kør Anisotropisk SIO2 plasma ætsning program.
  3. Opsætning af ætsning parametre til Pierce gennem 50 nm a-Si lag. De parametre, der anvendes her, er igen præsenteret i tabel 3. Kør isotropisk a-Si plasma ætsning program.
  4. Fjern prøver fra RIE-udstyr og opbevar dækket. Behandlingen kan igen suspenderes her.

11. fysisk dampudfældning (PVD) af metaller (figur 3F)

  1. Læg chips i fordampnings kammeret på PVD-instrumentet.
  2. Vælg et mål metal. Først vælge en selvklæbende metal. Her anvendes 2 nm chrom (CR).
  3. Indstil tykkelses kontrolprogrammet for målmaterialet og tykkelsen. Kontrolmetoden er instrument afhængig. Her anvendes en kvarts krystal mikrobalance (QCM). Den målte tykkelse justeres efter målmaterialets tæthed og Z-faktor og skal korrigeres med en eksperimentelt bestemt værktøjs faktor, der er specifik for enheden og hvert målmateriale.
  4. Start elektronstrålen, Juster strålen til målet og øg stråle strømmen, indtil der opnås en aflejrings hastighed på 0,05 nm/s. Fordampe, indtil der opnås en endelig tykkelse på 2 nm.
  5. Vælg et andet målmetal (f. eks. guld) uden at ventilere kammeret eller afbryde processen. Afbrydelser eller udluftning vil gøre det muligt for det selvklæbende metal at starte oxiderende og mindske dets anvendelighed som et klæbemiddel.
  6. Gentag trin 11,3 til 11,4. Fordampe, indtil 20 Nm er nået. Dette vil skabe en DNA origami formet metal struktur gennem SiO2 maske huller med en total højde på 22 nm.
  7. Afvent kammeret, og fjern prøverne.
  8. Behandlingen kan afbrydes her, hvis prøverne opbevares dækket.

12. løft med flussyre (HF) (figur 3G)

  1. Hæld 50% HF-baseret ætsemiddel opløsning i en egnet plastikbeholder. Der må ikke anvendes HCl til blandingen, da HCl vil etch CR i prøven.
    Forsigtig: HF er ekstremt ætsende, forårsager alvorlig irritation og forbrændinger og kan være dødelig på hudkontakt eller ved indånding. Brug kun HF i en dedikeret Røghætte eller en ventileret våd bænk med et beskyttende forklæde, kemikalieresistente handsker og ansigts visir, eller på anden måde fuld kemisk beskyttelse.
  2. Nedsænk prøverne i den HF-baserede ætsemiddel og rør forsigtigt med plastik pincet.
  3. Vent til SiO2 lag til etch helt og metal lag til at løsne. Tiden vil variere mærkbart afhængigt af tætheden af maske hullerne. Et højere antal huller vil oversætte til hurtigere ætsning. Hvis metal laget er svært at skrælle, kan der anvendes kort ultralydbehandling for 5 til 10 s.
  4. Når metal filmen løsnes, skylles prøverne med dobbeltdestilleret vand og isopropanol.
  5. Efter skylning tørres prøverne med en nitrogenstrøm på samme måde som foreskrevet for substrat præparatet (trin 5). Undgå pincet kontakt med chip Center, som kan ødelægge de dannede nanostrukturer.
    Bemærk: prøverne kan lagres og behandles suspenderet her.

13. RIE af resterende a-si (figur 3H)

  1. Placer flisene i det reaktive ionetching (RIE)-udstyr.
  2. Opsætning af ætsning parametre for grundig fjernelse af alle 50 nm af a-si. Parametrene kan være de samme som i trin 10, men en lidt længere ætsning tid (40 s) kan bruges til at sikre fjernelse af alle a-si. Se tabel 3 for de parametre, der anvendes her.  Kør isotropisk a-Si plasma ætsning program for at fjerne resterende a-si.
  3. Fjern prøver fra RIE-udstyr og opbevar dækket. Dette vil afslutte prøve behandling.

14. atomkraften mikroskopi (AFM)

Bemærk: Atomic Force mikroskopi og scanning elektronmikroskopi kan bruges til at overvåge succesen af film vækst og mønster samt til billede foldet DNA origami strukturer (figur 2B, C). Følgende prøve forberedelsestrin kan springes over, hvis forarbejdede prøver fra trin 5-13 er inddelt.

  1. Prøveforberedelse til AFM
    1. At billede den foldede DNA origami, tage en chip af glimmer substrat.
    2. Fastgør glimmer chippen til et glas mikroskop slide ved hjælp af et klæbemiddel.
    3. Forbered 10 μL DNA-origami-opløsning ved at fortynde ~ 20 nM DNA origami-bestanden 50 gange i 1x FOB til en koncentration på ca. 0,4 nM. Fortyndingen udføres for at undgå overbelægning af substratet.
    4. Skræl det øverste lag af glimmer pladen af med svagt tape for at få en frisk kløvet, opladet overflade.
    5. Indbetal den fortyndede DNA-origami opløsning på den frisk kløvede glimmer og Inkuber prøven, som er dækket i 1 minut ved stuetemperatur.
    6. Efter inkubation vaskes overfladen 3-4 gange med 100 μL destilleret vand ved hjælp af en pipette. Dette medfører, at kun den korrekt adsorbede origami til at forblive på overfladen.
    7. Indbetal 100 μL destilleret vand på glimmer overfladen.
    8. VIP og tryk skarpt på mikroskopet på bordet for at frigøre det meste af vandet.
    9. Gentag denne vaskecyklus 3-4 gange.
    10. Prøven tørres grundigt med en nitrogenstrøm umiddelbart efter vask. Prøven er derefter klar til AFM-billeddannelse.
  2. Placer DNA-origami prøverne eller de forarbejdede chips i en AFM og Udfør scanninger. En scanningsstørrelse på 1-10 μm er velegnet til korrekt løsning af strukturerne.

15. scanning af elektronmikroskopi (SEM)

  1. Placer prøverne i en SEM. De forarbejdede chips kan bruges som de er (yderligere prøveforberedelse er ikke nødvendig).
  2. Vælg accelerations spændingen. Brug lav spænding (5-10 kV) for at reducere opladnings effekten, da prøve substratet (al2O3 eller sin) er en isolator.
  3. Scan alle områder af interesse. Minimer scannings tiderne for at reducere opladningen og undgå aflejring af kontaminering.

Representative Results

En skematisk figur af Bowtie DNA origami design og dens strukturelle detaljer er vist i figur 1. Agrose gel elektroforese og AFM bruges til at analysere DNA origami foldning og kvaliteten af PEG rensning (figur 2). Processtrømmen af nanolithography-trinnene vises i figur 3. Repræsentative AFM billeder efter SiO2 maske vækst er vist i figur 4 (dette trin er afbildet i figur 3D), mens SEM billeder af de endelige metal nanostrukturer kan ses i figur 5 (dette trin er afbildet i Figur 3H). Figur 6 demonstrerer den optiske funktionalitet af de metalliske nanostrukturer, som er skabelon af Bowtie DNA origami.

Koncentrationer af folde buffer (FOB)-komponenter [mM]
Tris Eddikesyre Edta Magnesium klorid Ph
2.5 x FOB 100 47,5 2,5 31,25 ~ 8, 3
1x FOB 40 19 1 12,5 ~ 8, 3

Tabel 1: sammensætningen af folde bufferen (FOB).

Temperaturområde [oC] Kølehastighed
90-70 -0,2 °C/8 s
70-60 -0,1 °C/8 s
60-27 -0,1 °C/2 s
12 Hold indtil stoppet

Tabel 2: termisk rampe til Bowtie origami foldning. Efter annealing, vil origami blive opbevaret ved 12 oC, indtil programmet er manuelt stoppet.

PECVD-og RIE-parametre
Gas Gasstrøm [SCCM] Kammer tryk [mTorr] RF-effekt [W] Temperatur [oC] Varighed [s]
PECVD af a-Si 5% SiH4 i N2 500 1000 15 250 90
O2 plasma behandling O2 50 40 200 30 1200
RIE af SiO2 CHF3 25
Ar 25 30 100 25 10-22
RIE af a-Si O2 8
SF6 100 90 50 30 35
RIE af resterende a-Si O2 8
SF6 100 90 50 30 35-40

Tabel 3: procesparametre for plasma forstærket kemisk damp aflejring (PECVD) og reaktiv ionetching (Rie). Procesparametrene for disse anordninger er specifikke for de enkelte instrumenter, og de skal muligvis tilpasses, når de anvendes.

Figure 1
Figur 1: design af Bowtie DNA origami. (A) skematisk gengivelse af Bowtie origami design, hvor kernen struktur er vist som dobbeltspiral og polyt-udhæng er afbildet som bølgede linjer. (B) skærmbillede af en del af Bowtie origami-designet i cadnano-softwaren. De Røde Kors betegner bund parret, der springer for twist korrektionen, og T8-udhæng tilføjes for at forhindre stump-ende base-stabling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: karakterisering af Bowtie DNA origami struktur. A) agrose gel elektroforese af Bowtie struktur før og efter poly (ethylenglykol) (peg) rensning. 7249 nukleotider Long stillads anvendes som reference. (B) atomkraften mikroskopi (AFM) billede af Bowtie strukturer før rensning. (C) AFM billede af Bowtie strukturer efter peg rensning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: skema for fabrikations procesflowet (dimensionerne er ikke i skala). A) terninger og rengørsubstratet. B) deponere et a-Si-lag ved plasma forstærket kemisk damp AFLEJRING (pecvd). * Det er muligt at ansætte et ekstra offer lag under a-Si for at muliggøre løft med ætsemiddel, bortset fra HF.C) Behandl prøveoverfladen med O2 plasma, og Indbetal DNA-origami på den. (D) dyrke SIO2 masken i desiccator. (E) etch et tyndt lag af SIO2 og gennem a-Si under det ved reaktiv ion ætsning (Rie). F) indskyde metal gennem masken ved fysisk dampudfældning (PVD). (G) løft med HF. (H) Fjern den resterende a-Si af Rie. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4

Figur 4: repræsentative AFM billeder af SIO2 film med DNA origami formet mønster. A) etscanningsområde på 10 μm x 10 μm viser det høje udbytte af mønster dannelsen. (B) en tættere 3 μm x 3 μm-scanning viser de nøjagtige individuelle mønstre i SIO2 -filmen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: repræsentative scanning elektronmikroskopi (SEM) billeder af metalliske nanostrukturer skabelon med strukturelt forskellige DNA origami. (A) KORSformet DNA-origami, dvs, såkaldt Seeman flise origami54. B) Bowtie antenner. (C) chiral dobbelt-L (CDL) strukturer. Indsættene viser individuelle konstruktioner med boks størrelser på 150 nm x 150 nm. Fabrikation udbyttet af nøjagtige strukturer er op til 76% for Bowtie origami og ~ 50% for de andre strukturer, der vises her34. Dette tal er blevet tilpasset og modificeret fra Shen et al.34. Figuren er gengivet med tilladelse fra forfatterne og udgivet af American Association for fremme af videnskab, 2018. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: repræsentative optiske/funktionelle egenskaber for resulterende nanostrukturer. (A) lokaliserede overflade Plasmon resonans (lspr) målinger af en individuel guld Bowtie struktur med forskellig polarisering (farvekodet som orange og blå). De faste linjer måles spektre, og de stiplede linjer er simuleringsresultater. Indsættene viser SEM-billedet af den målte partikel (venstre) og den model, der anvendes til simulering (højre). B) overflade forstærket Raman SPEKTROSKOPI (Sers) af rhodamin 6G og 2, 2-bipyridin målt på en overflade dækket med Bowtie nanostrukturer. Udgangspunktet for hver prøve viser signalniveauet, når nanostrukturerne var fraværende. Dette tal er blevet tilpasset og modificeret fra Shen et al.34. Figuren er gengivet med tilladelse fra forfatterne og udgivet af American Association for fremme af videnskab, 2018. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplemental File 1
Supplerende fil 1: CaDNAno fil skal du klikke her for at downloade denne fil.

Supplemental File 2
Supplerende fil 2: m13mp18 sekvens venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplemental File 3
Supplerende fil 3: hæfte streng sekvens venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Protokollen giver stor frihed og nøjagtighed i form af producerede nanostrukturer. Ved at ændre designet af DNA-origami, kan formen af metal nanostrukturerne styres. Den endelige, nøjagtige form af metalstrukturer er desuden bestemt af masken vækst trin (trin 9) og i mindre grad ved masken ætsning (trin 10) bør det ikke være Anisotropic. Hvis masken vækst tiden er udvidet nok, vil hullerne i masken begynde at vokse lukket. Dette kan bruges til at udelade de tyndeste funktioner i nogle strukturer og kontrol Gap størrelser, som påvist i Shen et al.34 med adskilte trekanter af Bowtie origami (figur 5b). Omvendt kan tyndere former bedre bevares ved at forkorte oxidvæksttiden. Det betyder, at det er muligt at tune de optiske egenskaber, der vises i figur 6, ikke blot ved at ændre det anvendte origami-design, men også ved at indstille SIO2 -filmens vækst.

Hvis maskens tykkelse ændres markant, skal denne ændring også afspejles i SiO2 Rie-trinnet. Kun et meget tyndt lag af SiO2 skal ætses (2-5 nm) for næppe at gennembore maske hullerne. Dette er den mest følsomme og afgørende del af hele processen. Da ætsning tid er ekstremt kort, kun 10-20 s, nøjagtige indstillinger skal eksperimentelt bestemmes, når først forsøgt med nyt udstyr. Dette gælder også for trin 10,4 som nogle SiO2 er også ætset under a-Si ætsning. Omfanget af ætset SiO2 bestemmes af selektiviteten af de anvendte a-Si-etch-parametre, udstyr og endda individuelle kalibreringer af udstyr. Der bør udvises forsigtighed for ikke at etch væk hele SiO2 lag under disse to processer.

Et andet følsomt skridt er SiO2 vækst. Vækstprocessen er afhængig af både kammer fugtigheden og den aktuelle aktivitet af de anvendte TEOER. TEOS nedbrydes, da det Adsorber vand fra luften, hvilket får det til at blive mindre effektiv med alderen. Dette kan manifestere sig som en betydeligt langsommere, mindre kontrollerbar vækstrate inden for måneder selv med korrekt opbevaring af kemikaliet. 34 hvis den resulterende SIO2 lag er tyndere end beregnet, dette kan indikere et problem med Teos snarere end kammer fugtighed. Mens en lavere luftfugtighed også kan resultere i lavere vækstrate og tyndere film, bør den resulterende film også være glattere end normalt. I mellemtiden vil et groft kornet og groft lag omvendt indikere et problem med høj luftfugtighed.

Det er også muligt at udføre denne protokol på enhver anden frit valgt substrat med to krav: det skal tolerere både HF ætsning (trin 12) og 200-300 °C temperaturer af PECVD (trin 6). Temperaturen kan sænkes sikkert til 100 °C for PECVD af a-si, hvis der anvendes et mere følsomt substrat, men HF kan ikke undgås, hvis protokollen følges nøjagtigt som beskrevet. For at omgå HF ville det være nødvendigt at anvende et yderligere offer lag. Hvis kravet om HF-ætsning fjernes, vil denne protokol blive kompatibel med et bredere udvalg af substrat materialer og metaller.

Da denne protokol består af almindeligt anvendte og robuste mikro-og nanofabrikering processer, det kunne kombineres med en række andre mikrofabrikation protokoller, hvor små funktioner størrelser og komplekse metal former ønskes. I den nærmeste fremtid, især med de kommende billige DNA origami masseproduktion31, der er potentiale for denne metode til at lette både generel brug og høj gennemløb nanopatterning for grænseflade-baserede nanoftonik og plasmonics55 .

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Finlands Akademi (projekter 286845, 308578, 303804, 267497), Jane og Aatos Erkko Foundation og Sigrid Jusélius Foundation. Dette arbejde blev udført under Academy of Finland Centers of Excellence program (2014 – 2019). Vi anerkender levering af faciliteter og teknisk support fra Aalto University Bioeconomy faciliteter og OtaNano-Nanomicroscopy Center (Aalto-NMC) og Micronova Nanofabrication Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Honeywell 40289H Semiconductor grade ULSI, ≥ 99.5 %
Agarose Fisher Bioreagents 1036603 Low-EEO, multi-purpose and molecular biology grade
Ammonium hydroxide Fisher Chemical 10652251 25 % ammonia solution, Certified AR for Analysis, d = 0.91
BRANSON 5510 Branson Ultrasonic bath
Dimension Icon Bruker Atomic force microscope
Electron-beam evaporator IM-9912 Instrumentti Mattila Evaporator for PVD
Ethidium bromide Sigma Aldrich E8751 Fluorescent dye for DNA staining
Eon Microplate spectrophotometer BioTek UV/Vis spectrophotometer used for DNA origami concentration measurements
Gel Doc XR+ Documentation System BioRad Gel imaging system
Gel Loading Dye, Blue (6×) New England Biolabs B7021S Bromophenol blue-based loading dye for agarose gel electrophoresis
G-storm GS1 Thermal cycler Gene Technologies
HBR 4 IKA Heating bath
Hydrofluoric acid Honeywell 40213H Semiconductor grade, 49.5-50.5 %
Isopropanol Honeywell 40301H Semiconductor grade VLSI, ≥ 99.8 %
Magnesium chloride Sigma Aldrich M8266 Anhydrous, ≥ 98 %
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System BioRad
Plasmalab 80+ PECVD Oxford Instruments PECVD system
Plasmalab 80+ RIE Oxford Instruments RIE system
Poly(ethylene glycol) Sigma Aldrich 89510 BioUltra, 8,000
PowerPac HC High-Current Power Supply BioRad
Sapphire substrate (Al2O3) University Wafer Thickness: 430 μm, Polish: DSP, Size: 50.8 mm
Sigma VP Zeiss Scanning electron microscope
Silica gel Merck 1019691000 With indicator (orange gel), granulate ~1-3 mm
Single-stranded Scaffold DNA, type p7249 Tilibit Nanosystems At 100 nM concentration
Sodium chloride Sigma Aldrich S9888 ACS reagent, ≥ 99.0 %
Staple strands (oligonucleotides) Integrated DNA Technologies Sequences can be ordered e.g. at 100 micromolar in Rnase-free water
TAE buffer (50×) pH 8.0 VWR Chemicals 444125D Electran Electrophoresis grade
Take3 micro-volume plate BioTek Used for DNA origami concentration measurements
Tetraethyl orthosilicate Sigma Aldrich 86578 ≥ 99.0 % (GC)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seeman, N. C., Sleiman, H. F. DNA nanotechnology. Nature Reviews Materials. 3, (1), 17068 (2017).
  2. Linko, V., Dietz, H. The enabled state of DNA nanotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 24, (4), 555-561 (2013).
  3. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, (7082), 297-302 (2006).
  4. Hong, F., Zhang, F., Liu, Y., Yan, H. DNA Origami: Scaffolds for Creating Higher Order Structures. Chemical Reviews. 117, (20), 12584-12640 (2017).
  5. Maune, H. T., et al. Self-assembly of carbon nanotubes into two-dimensional geometries using DNA origami templates. Nature Nanotechnology. 5, (1), 61-66 (2010).
  6. Hung, A. M., et al. Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed by lithographically confined DNA origami. Nature Nanotechnology. 5, (2), 121-126 (2010).
  7. Kuzyk, A., et al. DNA-based self-assembly of chiral plasmonic nanostructures with tailored optical response. Nature. 483, (7389), 311-314 (2012).
  8. Zhang, T., et al. 3D DNA Origami Crystals. Advanced Materials. 30, (28), 1800273 (2018).
  9. Julin, S., et al. DNA origami directed 3D nanoparticle superlattice via electrostatic assembly. Nanoscale. 11, (10), 4546-4551 (2019).
  10. Fu, J., Liu, M., Liu, Y., Yan, H. Spatially-Interactive Biomolecular Networks Organized by Nucleic Acid Nanostructures. Accounts of Chemical Research. 45, (8), 1215-1226 (2012).
  11. Linko, V., et al. DNA-based enzyme reactors and systems. Nanomaterials. 6, (8), 139 (2015).
  12. Ramakrishnan, S., Subramaniam, S., Stewart, A. F., Grundmeier, G., Keller, A. Regular Nanoscale Protein Patterns via Directed Adsorption through Self-Assembled DNA Origami Masks. ACS Applied Materials & Interfaces. 8, (45), 31239-31247 (2016).
  13. Grossi, G., Jaekel, A., Andersen, E. S., Saccà, B. Enzyme-functionalized DNA nanostructures as tools for organizing and controlling enzymatic reactions. MRS Bulletin. 42, (12), 920-924 (2017).
  14. Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335, (6070), 831-834 (2012).
  15. Li, S., et al. A DNA nanorobot functions as a cancer therapeutic in response to a molecular trigger in vivo. Nature Biotechnology. 36, (3), 258-264 (2018).
  16. Zhao, Y. -X., et al. DNA origami delivery system for cancer therapy with tunable release properties. ACS Nano. 6, (10), 8684-8691 (2014).
  17. Kollmann, F., et al. Superstructure-Dependent Loading of DNA Origami Nanostructures with a Groove-Binding Drug. ACS Omega. 3, (8), 9441-9448 (2018).
  18. Zhang, D. Y., Seelig, G. Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions. Nature Chemistry. 3, (2), 103-113 (2011).
  19. Ijäs, H., Nummelin, S., Shen, B., Kostiainen, M. A., Linko, V. Dynamic DNA Origami Devices: from Strand-Displacement Reactions to External-Stimuli Responsive Systems. International Journal of Molecular Sciences. 19, (7), 2114 (2018).
  20. Li, J., Fan, C., Pei, H., Shi, J., Huang, Q. Smart Drug Delivery Nanocarriers with Self-Assembled DNA Nanostructures. Advanced Materials. 25, (32), 4386-4396 (2013).
  21. Linko, V., Ora, A., Kostiainen, M. A. DNA Nanostructures as Smart Drug-Delivery Vehicles and Molecular Devices. Trends in Biotechnology. 33, (10), 586-594 (2015).
  22. Jiang, Q., Liu, S., Liu, J., Wang, Z. G., Ding, B. Rationally Designed DNA-Origami Nanomaterials for Drug Delivery In Vivo. Advanced Materials. (2018).
  23. Shen, B., Linko, V., Dietz, H., Toppari, J. J. Dielectrophoretic trapping of multilayer DNA origami nanostructures and DNA origami-induced local destruction of silicon dioxide. Electrophoresis. 36, (2), 255-262 (2015).
  24. Kuzyk, A., Jungmann, R., Acuna, G. P., Liu, N. DNA Origami Route for Nanophotonics. ACS Photonics. 5, (4), 1151-1163 (2018).
  25. Liu, N., Liedl, T. DNA-Assembled Advanced Plasmonic Architectures. Chemical Reviews. 118, (6), 3032-3053 (2018).
  26. Bathe, M., Rothemund, M. DNA Nanotechnology: A Foundation for Programmable Nanoscale Materials. MRS Bulletin. 42, (12), 882-888 (2017).
  27. Pilo-Pais, M., Acuna, G. P., Tinnefeld, P., Liedl, T. Sculpting light by arranging optical components with DNA nanostructures. MRS Bulletin. 42, (12), 936-942 (2017).
  28. Graugnard, E., Hughes, W. L., Jungmann, R., Kostiainen, M. A., Linko, V. Nanometrology and super-resolution imaging with DNA. MRS Bulletin. 42, (12), 951-959 (2017).
  29. Zhong, J., et al. Metallized DNA nanolithography for encoding and transferring spatial information for graphene patterning. Nature Communications. 4, 1663 (2013).
  30. Zhang, G., Surwade, S. P., Zhou, F., Liu, H. DNA nanostructure meets nanofabrication. Chemical Society Reviews. 42, (7), 2488-2496 (2013).
  31. Praetorius, F., Kick, B., Behler, K. L., Honemann, M. N., Weuster-Botz, D., Dietz, H. Biotechnological mass production of DNA origami. Nature. 552, (7683), 84-87 (2017).
  32. Linko, V., et al. One-step large-scale deposition of salt-free DNA origami nanostructures. Scientific Reports. 5, 15634 (2015).
  33. Arbabi, A., Horie, Y., Bagheri, M., Faraon, A. Dielectric metasurfaces for complete control of phase and polarization with subwavelength spatial resolution and high transmission. Nature Nanotechnology. 10, (11), 937-943 (2015).
  34. Shen, B., et al. Plasmonic nanostructures through DNA-assisted lithography. Science Advances. 4, (2), (2018).
  35. Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37, (26), 5001-5006 (2009).
  36. Ke, Y., et al. Multilayer DNA Origami Packed on a Square Lattice. Journal of the American Chemical Society. 131, (43), 15903-15908 (2009).
  37. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325, (5941), 725-730 (2009).
  38. Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8, (3), 221-229 (2011).
  39. Kim, D. -N., Kilchherr, F., Dietz, H., Bathe, M. Quantitative prediction of 3D solution shape and flexibility of nucleic acid nanostructures. Nucleic Acids Research. 40, (7), 2862-2868 (2011).
  40. Benson, E., et al. DNA rendering of polyhedral meshes at the nanoscale. Nature. 523, (7561), 441-444 (2015).
  41. Veneziano, R., et al. Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down. Science. 352, (6923), 1534 (2016).
  42. Linko, V., Kostiainen, M. A. Automated design of DNA origami. Nature Biotechnology. 34, (8), 826-827 (2016).
  43. Nummelin, S., Kommeri, J., Kostiainen, M. A., Linko, V. Evolution of Structural DNA Nanotechnology. Advanced Materials. 30, (24), 1703721 (2018).
  44. Maffeo, C., Yoo, J., Aksimentiev, A. De novo reconstruction of DNA origami structures through atomistic molecular dynamics simulation. Nucleic Acids Research. 44, (7), 3013-3019 (2016).
  45. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and Scalable Preparation of Pure and Dense DNA Origami Solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53, (47), 12735-12740 (2014).
  46. Shaw, A., Benson, E., Högberg, B. Purification of Functionalized DNA Origami Nanostructures. ACS Nano. 9, (5), 4968-4975 (2015).
  47. Kuzyk, A., Yurke, B., Toppari, J. J., Linko, V., Törmä, P. Dielectrophoretic Trapping of DNA Origami. Small. 4, (4), 447-450 (2008).
  48. Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Research. 41, (2), 40 (2013).
  49. Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459, (7245), 414-418 (2009).
  50. Ramakrishnan, S., Ijäs, H., Linko, V., Keller, A. Structural stability of DNA origami nanostructures under application-specific conditions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 342-349 (2018).
  51. Kielar, C., et al. On the Stability of DNA Origami Nanostructures in Low-Magnesium Buffers. Angewandte Chemie International Edition. 57, (30), 9470-9474 (2018).
  52. Surwade, S. P., et al. Nanoscale growth and patterning of inorganic oxides using DNA nanostructure templates. Journal of the American Chemical Society. 135, (18), 6778-6781 (2013).
  53. Shen, B., Linko, V., Tapio, K., Kostiainen, M. A., Toppari, J. J. Custom-shaped metal nanostructures based on DNA origami silhouettes. Nanoscale. 7, (26), 11267-11272 (2015).
  54. Liu, W., Zhong, H., Wang, R., Seeman, N. C. Crystalline Two-Dimensional DNA-Origami Arrays. Angewandte Chemie International Edition. 50, (1), 264-267 (2011).
  55. Shen, B., Kostiainen, M. A., Linko, V. DNA Origami Nanophotonics and Plasmonics at Interfaces. Langmuir. 34, (49), 14911-14920 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics