Een co-cultuur methode om Neurite Outgrowth studie in reactie op tandheelkundige pulp paracrine signalen

Dit protocol biedt gedetailleerde overzicht van hoe co-cultuur tandheelkundige pulp stamcellen met trigeminusneuronen. Hiermee kunnen we meerdere reacties onderzoeken die gedreven zijn door hun crosstalk. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om een of beide celpopulaties te bestuderen en te manipuleren en de resultaten nauwkeurig te meten.

Deze methode heeft directe relevantie voor neuraal onderzoek en kan inzicht geven in onderzoek naar hoe tandheelkundige pulpstamcellen zenuwweefsel herstellen dat beschadigd is door traumatische gebeurtenissen of neurodegeneratieve ziekten. Er zijn verschillende stadia van deze techniek om te leren en het kan moeilijk zijn om het traktaat van hen allemaal te houden. Dit protocol beschrijft elke fase om te helpen met dat.

De tandheelkundige pulp en ganglia zijn moeilijk te verspreiden en vereisen verschillende vortexen en pipetting. Zelfs dan krijg je niet volledige spreiding, zodat optimalisatie en repliceert nodig zal zijn. Na euthanasie van de muis, plaats het hoofd op de wegwerp onderpad, zodat de mond naar het plafond en de basis van de nek is plat op het werkoppervlak.

Gebruik een scheermesje en een zaagbeweging om de onderkaak van de maxilla te scheiden. Verwijder de tong met een schaar of tang om gemakkelijker toegang tot de kiezen mogelijk te maken. Plaats de open kop in de schotel bovenop een steriel gaasje en plaats het monster onder de ontledenmicroscoop.

Verwijder het alveolaire botweefsel rond de eerste kiezen. Steek tangen in de alveolaire opening en plagen het weefsel uit de buurt van de tand in de richting van de buccle of linguale kant van de mond. Verzamel alle maxillaire eerste kiezen en breng de subdoandibulaire en maxillaire eerste kiezen voorzichtig over naar een aparte celkweekschotel met 1X PBS op ijs.

Verwijder het emaille buitenste orgaan rond de buitenkant van elke maxillaire eerste kies. Met een set tangen draaien de kies, zodat cusps naar beneden zijn en de open wortel wordt blootgesteld. Er is een ovale opening op de bodem van de tand en ondoorzichtig tandpulpweefsel ingekapseld door een dunne laag dentine en glazuur.

Met behulp van de punt van de tangen, voorzichtig los de tandheelkundige pulp door het uitvoeren van een arm van de tangen rond de interne omtrek van het gemineraliseerde weefsel. Verwijder het tandpulpweefsel uit de gemineraliseerde structuur en breng over op een derde schaal met 1X PBS. Verwijder het glazuur buitenste orgaan als het niet al gescheiden was.

Breng alle tandpulp weefsel tot 0,25% trypsine EDTA in een 50 milliliter conische buis. Vortex het mengsel en plaats het in een 37 graden Celsius warm water bad gedurende 10 minuten. Voeg onder een steriele kap opgewarmde co-cultuurmedia toe aan een uiteindelijke verhouding van ten minste één-op-één media om trypsine toe te voegen om het enzym te activeren.

Pipet de media op en neer meerdere malen met een 10 milliliter pipet om verder te verspreiden de tandheelkundige pulp in de media, grote bubbels te voorkomen. Breng een milliliter van de verspreide tandpulp naar elke put van 24-well weefsel kweekplaat. Plaats de plaat in een couveuse op 37 graden Celsius.

En laat de cellen te hechten en migreren uit het ongedispereerde weefsel voor 48 uur voor het veranderen van media. Na euthanasie en verwijdering van de huid, steek het puntje van een paar micro ontleden schaar in de basis van de schedel. Snijd langs de sagittale hechting van de schedel.

Maak vier kleine horizontale sneden langs de coronale hechtingen door de oren tot langs de lambdoïde hechtingen van de basis van de schedel. Dit creëert twee flappen van bot. Gebruik de tangen om de twee flappen van bot terug te pellen om de hersenen te onthullen.

Zoek de trigeminus ganglia gehuisvest in de dura mater tussen de hersenen en het bot van maxillaire proces. Snijd de drie takken die reizen naar de ogen, maxillae, en onderkaak. En gebruik rechte rand fijne tangen om de ganglia over te brengen naar koude 1X PBS in een schotel op ijs.

Zodra alle trigeminusbundels zijn geoogst gebruik bestand forceps om ganglia over te dragen tot 50 milliliter conische buis met vijf milligram per milliliter steriele gefilterde collagenase type II.Vortex het mengsel en plaats de buis in de 37 graden Celsius waterbad voor 25 tot 30 minuten. Elke vijf tot tien minuten, neem de buis uit het water bad, vortex, en terug te keren naar het bad. Centrifuge de collagenase trigeminusoplossing gedurende twee minuten bij 643xg.

Onder een weefselkweekkap, zachtjes aspirate de collagenase met een micropipet en voeg vijf milliliter van 1%steriele gefilterde trypsine type II.Plaats de buis in een 37 graden Celsius water bad voor 25 tot 30 minuten en binnen deze tijd vortex de buis kort om de vijf minuten. Voeg media toe met een één-op-één verhouding van trypsine aan media om de resterende trypsine te deactiveren. Tel het aantal cellen en verdun het mengsel tot 200.000 cellen per milliliter in de media.

Plaats gecoate transwell filters in putten met tandpulp. Pipet 250 microliters op de transwell filter en cultuur de cellen op 37 graden Celsius 's nachts. De volgende dag, vervang de media met een milliliter van co-cultuur media aangevuld met een micromolar uridine en 15 micromolar 5-Fluoro-2'deoxyuridine om de overproliferatie van mesenchymale cellen die kunnen voorkomen dat neurite uitgroei te stoppen.

U moet mitotische remmers toevoegen op dag twee of neurietgroei zal niet optreden. In deze studie werd trigeminusneurite uitgroei verhoogd in aanwezigheid van primaire tandpulpcellen in de onderliggende put in vergelijking met de controle van trigeminusneurite monocultuur. Primaire cellen geïsoleerd van de TGF-bèta receptor 2 flox /flox muis waren gelijkwaardig in aantal na injecties van ade-Cre-GFP of ade-eGFP.

Semi-kwantitatieve PCR toont aan dat het adenovirus-Cre-GFP het geflankeerde gen transformeerde dat de bètareceptor 2 van de groeifactor transformeert met adenovirus-eGFP als controle virale vector. In de culturen met transformerende groeifactor bètareceptor 2 verwijdering, werd de uitgroei van de neuriet verminderd. Bright-field beeldvorming van transwell filters na kristal violet kleuring van celpopulaties blijkt dat grote poriën heersen.

De grote pijl wijst op een cel met mesenchymale morfologie, terwijl de kleine pijl wijst naar een cel van neuronale morfologie. Kristal violet gekleurd beide cellen zonder vooringenomenheid. Bovendien toont immunofluorescentie kleuring van bèta-III tubuline met een alexa 488 secundair antilichaam niet-specifieke kleuring van meerdere cellen waardoor beeldvorming van afferent structuren moeilijk is.

Omdat noch tandheelkundige pulpcellen, noch trigeminusneuronen zich gemakkelijk verspreiden, zal elke onderzoeker hun beplatingsprocedures moeten optimaliseren. Als u cultuur tandheelkundige pulp cellen alleen in afzonderlijke putten u gebruik maken van immunofluorescentie of u kwantificeren RNA of eiwitniveaus om te bepalen hoe de tandheelkundige pulp cellen reageren op de neuronen. Vergeet niet om containers of tips die in contact komen met adenovirus bleek.

Zorg ervoor dat u de scheermessen goed in een scherpe bak gooit.