Inhibición Del Cytohesins Por SecinH3 Conduce a La Resistencia a La Insulina Hepática

Nature. Dec, 2006  |  Pubmed ID: 17167487

Las proteínas G son una clase importante de reguladores interruptores en todos los sistemas vivos. Son activados por guanina nucleótido factores de intercambio (GEFs), que facilitan el intercambio de PIB de GTP. Esta actividad hace GEFs objetivos atractivos para modulación redes señalización G proteína-controlado enfermedades relevantes. Inhibidores del FMAM son por lo tanto de interés como herramientas para dilucidar la función de estas proteínas y para la intervención terapéutica; sin embargo, solamente una molécula pequeña FMAM inhibidor, Brefeldino A (BFA), está actualmente disponible. Aquí utilizamos una pantalla de desplazamiento de aptámeros para identificar SecinH3, un antagonista de molécula pequeña de cytohesins. Los cytohesins son una clase de GEFs pequeños BFA-resistente para ribosilacion-factores (ARFs), que regulan la organización del citoesqueleto, activación de la integrina o señalización de la integrina. La aplicación de SecinH3 en células del hígado humanas demostró que insulina-complejo-asociado a receptor cytohesins se requieren para la señalización de la insulina. Los ratones tratados con SecinH3 muestran aumento de la expresión de genes gluconeogénicos, expresión reducida de glucolisis, genes de metabolismo de ácidos grasos y el cuerpo de cetona en el hígado, reducción de glucógeno hepático y un aumento compensatorio en la insulina del plasma. Así, cytohesin inhibición resulta en resistencia a la insulina hepática. Porque la resistencia a la insulina es uno de los primeros cambios patológicos en la diabetes tipo 2, nuestros resultados muestran el potencial de Biología química para disecar la patogenia molecular de esta enfermedad.

Identificación De Los MicroARNs Y Otros ARNs Pequeños Servicios De Reglamentación Mediante La Secuenciación De CDNA Biblioteca

Methods (San Diego, Calif.). Jan, 2008  |  Pubmed ID: 18158127

Distintas clases de ARN pequeños, 20-32 nucleótidos de longitud, desempeñan papeles reguladores de diversos procesos celulares. Por consiguiente, es importante identificar y cuantificar los pequeños RNAs como una función del tipo de desarrollo, de células y tejidos, en estados normales y la enfermedad. Aquí se describen los métodos para preparar bibliotecas de cDNA a partir de grupos de pequeños RNAs aislados de organismos, tejidos o células. Estos métodos permiten la identificación de nuevos miembros o nuevas clases de ARN pequeños, y también son adecuadas para obtener los perfiles de expresión basados ​​en miARN frecuencias recuento de clones. Este protocolo incluye el uso de nuevos métodos de secuenciación de profundidad (454/Roche y Solexa) para facilitar la caracterización de los diversos grupos de la secuencia de ARN pequeños.

Desplazamiento De Aptámeros Protein-bound Con Moléculas Pequeñas Mediante La Polarización De La Fluorescencia

Nature Protocols. 2008  |  Pubmed ID: 18388939

Inhibidores de la molécula pequeña de proteínas son herramientas muy valiosas en la investigación y como puntos de partida para el desarrollo de fármacos. Sin embargo, su proyección puede ser tedioso, como métodos de cribado más tienen que adaptar a la meta de drogas correspondiente. Aquí, describimos un protocolo detallado para un análisis modular y de aplicación general para la identificación de compuestos orgánicos pequeños que desplazar un aptámeros complejado a su proteína diana. El método se basa en aptámeros marcados con fluorescencia y el aumento de la polarización de la fluorescencia en su unión a la proteína diana. El ensayo tiene alta Z'-factores, lo que es compatible con la proyección de alto rendimiento. Permite la automatización fácil, haciendo lectura de fluorescencia el paso de limitación de tiempo. Como pueden generarse aptámeros para prácticamente cualquier destino de la proteína, el ensayo permite la identificación de inhibidores de la molécula pequeña para objetivos o dominios de proteínas individuales para que no funcional pantalla está disponible. Proporcionamos el protocolo paso a paso a la pantalla para los antagonistas de la clase cytohesin de factores de intercambio de guanosina pequeño.

Caracterización Molecular De Los Humanos Ribonucleoprotein Complejos Argonaute Que Contienen Y Sus MRNAs Diana Enlazados

RNA (New York, N.Y.). Dec, 2008  |  Pubmed ID: 18978028

microARN (miRNA) regulan la expresión de ARNm de los animales y las plantas a través de miRNA que contienen partículas de ribonucleoproteína (RNP). En el núcleo de estos miARN complejos efectores de silenciamiento son el Argonauta (AGO) proteínas que se unen los miRNAs y mediar en el reconocimiento objetivo de ARNm. Hemos generado HEK293 líneas celulares que expresan establemente epítopo de etiquetado humana HACE proteínas y otras proteínas relacionadas con el silenciamiento de ARN-y se utiliza para purificar estas células que contienen RNPs miARN. Análisis de espectrometría de masa de las proteínas asociadas con diferentes proteínas atrás reveló un conjunto común de helicasas y proteínas de unión a ARNm, entre ellas la repetición de trinucleótidos tres proteínas que contienen 6 (TNRC6A,-B,-C). ARNm análisis de microarrays de estas RNPs asociados miRNA-reveló que HACE y TNRC6 proteínas se unen conjuntos muy similares de las transcripciones enriquecido en los sitios de unión para la altamente expresado miRNAs endógenos, lo que indica que los TNRC6 proteínas son un componente del complejo de miARN ARNm de metas de silenciar. Junto con la composición muy similar proteómico de cada HACE complejo, este resultado sugiere redundancia funcional sustancial dentro de las familias de los humanos y las proteínas TNRC6 AGO. Nuestros resultados demuestran que hemos desarrollado un enfoque eficaz bioquímicas para identificar blancos humanos fisiológicamente relevantes miARN.

DGCR8 Dependiente De La Biogénesis MicroARN Es Esencial Para El Desarrollo De La Piel

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Jan, 2009  |  Pubmed ID: 19114655

Los microARNs desempeñan un papel importante en el desarrollo animal. Numerosos knockout condicionales (OJC) estudios de Dicer se han realizado para interrogar a las funciones de los microARN en el desarrollo de mamíferos. Sin embargo, debido Dicer estuvo implicado recientemente en la biogénesis de siRNAs endógenos en los mamíferos, se plantea la cuestión de si los defectos Dicer CKO puede ser atribuible a la pérdida de los microRNAs. Previamente, y otros con condiciones dirigidas Dicer e identificado sus papeles críticos en la morfogénesis de la piel embrionaria. Aquí, nos centramos explícitamente en los microRNAs mediante la adopción de una estrategia paralela a DGCR8, que codifica un componente esencial del complejo microprocesador que es exclusivamente necesario para la biogénesis de microARN. Con este análisis comparativo, se demuestra definitivamente que los defectos de la piel Dicer y DGCR8 nulo son a la vez sorprendente e indistinguibles. Mediante el análisis de secuenciación profunda del agotamiento de microARN tanto en la piel Dicer y DGCR8 nulo, nos demuestran que los microARNs piel más abundantemente expresado dependen tanto de Dicer y DGCR8. Nuestros resultados ponen de relieve un peso específico de microARN para controlar el desarrollo de la piel del mamífero.

MIRNA Hibridación in Situ En Formaldehído Y Los Tejidos Fijados Con EDC

Nature Methods. Feb, 2009  |  Pubmed ID: 19137005

Los microARNs son pequeños ARNs reguladores con muchas funciones biológicas y las asociaciones de la enfermedad. Hemos demostrado que en la hibridación in situ (ISH) utilizando convencionales resultados fijación de formaldehído en la pérdida de microARN sustancial de las secciones de tejido de ratón, lo que puede prevenirse mediante la fijación con carbodiimida 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) que irreversiblemente inmoviliza el microARN en su 5 'fosfato. Se determinó los parámetros óptimos de hibridación para 130 sondas de ácidos nucleicos bloqueados mediante el registro de la temperatura de fusión nucleico ácido durante la ISH.

Cuantificación Absoluta De MicroARNs Mediante Una Referencia Universal

RNA (New York, N.Y.). Dec, 2009  |  Pubmed ID: 19861428

Los microARN (miRNA) son una especie de pequeños ARN de aproximadamente 21-23-nucleótidos de longitud que se ha demostrado jugar un papel importante en diversos procesos celulares, de desarrollo, y fisiológicas. En consecuencia, numerosos métodos de PCR, secuenciación, o basadas en la hibridación, se han establecido para identificar y cuantificar los miRNAs. Los resultados de longitud corta en un alto rango dinámico de temperaturas de fusión, lo que impide una adecuada selección de sondas de detección o cebadores de PCR optimizado. Mientras que los microarrays miARN permitir la medición relativa masiva en paralelo y precisa de todos los miRNAs conocidos, que hasta ahora han sido menos útil como un ensayo para la cuantificación absoluta. A continuación, presentamos un enfoque basado en microarrays para la cuantificación global y absoluta de miRNAs. El método se basa en la hibridación en paralelo de la muestra de interés marcado con Cy5 y una referencia universal de 954 miRNAs sintéticos en concentraciones equimolares que están etiquetados con Cy3 sobre un portaobjetos de microarray que contiene sondas para todos los humanos, de ratón, rata, y miRNAs virales (miRBase 12,0). Cada miARN solo se cuantifica con respecto a la cancelación de los prejuicios universales de referencia relacionados con la secuencia, el etiquetado, o la hibridación. Se demuestra la exactitud del método por varios picos-en los experimentos. Además, se cuantificó el número de copias miARN en muestras de hígado y CD34 (+) / CD133 (-) las células progenitoras hematopoyéticas.

Transcriptoma En Toda La Identificación De La Proteína De Unión Al ARN Y Los Sitios De Destino MicroARN Por PAR-CLIP

Cell. Apr, 2010  |  Pubmed ID: 20371350

Las transcripciones de ARN están sujetos a la regulación de genes postranscripcional que participaron cientos de ARN-proteínas de unión a las prácticas comerciales restrictivas () y que contienen complejos de microARN-ribonucleoproteína (miRNPs) expresados ​​en forma de células de tipo dependiente. Hemos desarrollado un enfoque reticulación a base de células para determinar en alta resolución y en todo el transcriptoma de los sitios de unión de las prácticas comerciales restrictivas y miRNPs celulares. Los sitios reticuladas son reveladas por timidina a las transiciones de citidina en los ADNc preparadas a partir de immunopurified RNPs de 4-tiouridina células tratadas. Se determinaron los sitios de unión y las consecuencias reglamentarias para varias prácticas comerciales restrictivas intensamente estudiados y miRNPs, incluyendo PUM2, QKI, IGF2BP1 3, AGO/EIF2C1-4 y TNRC6A-C. Nuestro estudio reveló que estos factores se unen miles de sitios que contengan la secuencia de motivos definidos y tienen distintas preferencias de exonic contra intrónica o codificación en comparación con las regiones no traducidas de transcripción. La asignación exacta de los sitios de unión de todo el transcriptoma será fundamental para la interpretación de los datos que emergen rápidamente sobre la variación genética entre los individuos y cómo estas variaciones contribuyen a enfermedades genéticas complejas.

Los MicroARN MiR-17, MiR-20a Y MiR-106b Actúan En Concierto Para Modular La Actividad De E2F En La Detención Del Ciclo Celular Durante La Diferenciación Neuronal De Lineage USSC

PloS One. 2011  |  Pubmed ID: 21283765

Los microARNs son cortos (~ 22 nt) no codificante RNAs reguladores que controlan la expresión génica a nivel post-transcripcional. Aquí el impacto funcional de microRNAs en la detención del ciclo celular durante la diferenciación neuronal del linaje de células madre somáticas sin restricciones de la sangre del cordón umbilical humano (USSC), se analizó.

Caracterización Combinado De MicroARN Y Los Perfiles De MRNA De Delinea Vías De Diferenciación Temprana De CD133 + CD34 + Madre Hematopoyéticas Y Células Progenitoras

Stem Cells (Dayton, Ohio). May, 2011  |  Pubmed ID: 21394831

MicroRNAs (miRNAs) se ha demostrado que juegan un papel importante en la hematopoyesis. Para dilucidar el papel de los miRNAs en las primeras etapas de la hematopoyesis, que comparó directamente por los donantes corresponde CD133 (+) las células más diferenciadas con el CD34 (+) CD133 (-) y CD34 (-) CD133 (-) las células de la médula ósea en el nivel de miRNA y del mRNA. Usando cuantitativa de microarrays toda miARN perfiles de secuenciación del genoma y la base, se encontró que entre los 109 (CD133 (+)) y 216 (CD34 (-) CD133 (-)) miRNAs se expresaron. La cuantificación reveló que los 25 miRNAs expresados ​​más alto el 73% de la cartera total de miRNA. MIR-142-3P fue el más alto miARN expresado con un máximo de 2.000 copias por célula de CD34 (+) CD133 (-) las células. Dieciocho fueron significativamente miRNAs expresados ​​diferencialmente entre CD133 (+) y CD34 (+) CD133 (-) de las células. Se analizó su función biológica mediante el examen de la co-expresión de miRNAs y sus metas previstos bioinformatically mRNA de luciferasa y basados ​​en ensayos de reportero. Nos proporcionan la primera evidencia de una regulación directa de CD133 por el MIR-142-3p, así como la tropomiosina 1 y 5 homólogo rizado por el MIR-29a. La sobre-expresión de miRNAs en CD133 (+) células demostrado que el miR-142-3P tiene una influencia negativa en el total de la capacidad de formación de colonias. En conclusión, los miRNAs expresados ​​diferencialmente entre el CD133 (+) y CD34 (+) CD133 (-) las células están involucradas en la inhibición de la diferenciación, la prevención de la apoptosis, y la remodelación del citoesqueleto. Estos resultados son de gran relevancia para madre terapias basadas en células con CD133 (+) las células y delinear por primera vez cómo el personaje de células madre de CD133 (+) las células se define por la expresión de miRNAs específicos.

La Secuenciación Profunda De Pequeños ARNs Asociados Específicamente Con Arabidopsis Destapa AGO1 Y AGO4 Nueva HACE Funciones

The Plant Journal : for Cell and Molecular Biology. Jul, 2011  |  Pubmed ID: 21457371

Como componentes importantes de pequeños ARN (smRNA) las vías, Argonaute (AGO) proteínas mediar en la interacción de smRNAs incorporados con sus objetivos. Arabidopsis contiene 10 proteínas atrás con funciones especializadas o redundantes. Entre ellos, AGO1 actúa principalmente en los microRNA (miRNA) y pequeños ARN interferentes (siRNA vías) para el silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS), mientras que AGO4 regula el silenciamiento génico transcripcional (TGS) a través de endógenos de 24 nucleótidos (nt) smRNAs. Para caracterizar completamente smRNAs asociados con AGO1 y AGO4, hemos desarrollado un protocolo de dos pasos para purificar AGO / smRNA complejos de flores, hojas, raíces y plantas con la mayor pureza, y la secuencia de los smRNAs por la tecnología de iluminación. Además de la recuperación de smRNAs más comentadas anteriormente, también se identificaron algunos miRNAs adicionales, por etapas y grupos smRNA pequeña interferencia ARN derivados de la región de superposición de pares de naturales de transcripción antisentido (NAT) (nat-siRNAs). También se identificó una característica de la distribución smRNA sobre los precursores de miRNA que pueden ayudar a identificar miRNAs auténticos. Órgano-específica secuenciación proporcionan perfiles digitales de expresión de todos smRNAs obtenidos, especialmente miRNAs. La presencia y conservación de los miRNAs colaterales sobre los precursores miARN conocidos también fueron investigados. Curiosamente, el 30% de AGO1 asociados smRNAs eran de 24 nt de longitud y sin relación con la especie de 21 nt. Un análisis posterior mostró que el ADN-polimerasa dependiente de ARN IV (Pol IV)-dependientes smRNAs eran principalmente 24 nt y asociado con AGO4, mientras que la mayoría de los potenciales Pol V-dependientes seres eran 21-nt smRNAs y obligado a AGO1, lo que sugiere la posibilidad participación de AGO1 de Pol V-relacionados con las vías.

Secuencia De MicroARN Y Análisis De Expresión En Tumores De Mama Mediante La Secuenciación Profunda

Cancer Research. Jul, 2011  |  Pubmed ID: 21586611

Los microARN (miRNA) regular muchos genes críticos para la tumorigénesis. Hemos perfilado miRNAs de 11 tejidos normales de mama no invasivos, 17, 151 carcinomas de mama invasivo, y 6 líneas celulares por en-casa-desarrollado con código de barras secuenciación Solexa. miRNAs se organizaron en grupos genómicos que representan promotora controlada por la expresión de miRNA y secuencia de las familias que representa la semilla secuencia que dependen de la regulación de destino miRNA. Agrupamiento no supervisado de las muestras de secuencia de las familias miARN refleja mejor la agrupación sobre la base de la expresión del ARNm disponible para este conjunto de muestras. Agrupación y el análisis comparativo de las frecuencias de miARN leer mostraron que las muestras normales de mama fueron separados de carcinoma ductal invasivo más en los carcinomas in situ e invasivos por el aumento de miR-21 (el más abundante de miRNA en los carcinomas) y la disminución de varias familias miARN (incluyendo miR-98/let -7), con la mayoría de miRNA cambios aparentes ya en los carcinomas no invasivos. Además, los pacientes que iban a desarrollar metástasis mostraron una mayor expresión de miR-423, y el triple negativo carcinomas de mama fueron los más distintos de otros subtipos de tumores debido a la regulación al alza de los mir ~ 17-92 clúster. Sin embargo, los niveles absolutos miARN entre los carcinomas de mama normal y no se observaron diferencias significativas. También hemos descubierto dos variantes polimórficas de nucleótidos entre los miRNAs más abundantes miR-181 (T19G) y miR-185 (T16G), pero no identificó a las variaciones de nucleótidos se espera para el clásico de la función supresora de tumores asociados con miRNAs. La diferenciación de los subtipos de tumores y la predicción de metástasis sobre la base de los niveles de miRNA es estadísticamente posible, pero no impulsada por la desregulación de los miRNAs abundantes, lo que implica un número mucho menor de miRNAs en los procesos tumorales que se había sugerido.

Pequeña Secuenciación De ARN Y La Caracterización Funcional Revela MicroARN-143 Del Tumor Supresor De La Actividad En El Liposarcoma

Cancer Research. Sep, 2011  |  Pubmed ID: 21693658

Liposarcoma sigue siendo el cáncer mesenquimal más frecuente, con una tasa de mortalidad del 60% entre los pacientes con esta enfermedad. Para hacer frente a la actual falta de opciones terapéuticas, nos embarcamos en un estudio de microRNA (miRNA) las alteraciones de expresión asociados con liposarcomagenesis con el objetivo de la explotación de miRNAs expresados ​​diferencialmente y los productos de los genes que regulan como posibles dianas terapéuticas. Expresión de microARN se perfila en las muestras de tejido adiposo normal, liposarcoma bien diferenciado y liposarcoma dediferenciado por tanto la secuenciación profunda de las pequeñas bibliotecas de ARN y basados ​​en la hibridación de microarrays de Agilent. Los perfiles de expresión discriminado liposarcoma de tejido adiposo normal y bien diferenciada de la enfermedad de dediferenciado. Se habla de más de 40 miRNAs que fueron alteradas en los liposarcomas indiferenciadas, tanto en la secuenciación y el análisis de microarrays. Los miRNAs upregulated incluyen dos relacionados con el cáncer de la misma especie (miR-21 y miR-26a), y los miRNAs downregulated incluye dos especies que fueron muy abundantes en el tejido adiposo (miR-143 y miR-145). Restauración de miR-143 la expresión en células indiferenciadas liposarcoma inhibe la proliferación, la apoptosis inducida, y la disminución de la expresión de BCL2, 2A topoisomerasa, proteína reguladora de la citocinesis 1 (PRC1), y el polo-quinasa como 1 (Plk1). La regulación a la baja de PRC1 y su socio de acoplamiento Plk1 sugiere que el miR-143 inhibe la citocinesis en estas células. En apoyo de esta idea, el tratamiento con un inhibidor potente Plk1 inducida G (2)-M detención del crecimiento y la apoptosis en células de liposarcoma. En conjunto, nuestros resultados sugieren que miR-143 re-expresión de los vectores o agentes selectivos dirigidos a miR-143 o de sus objetivos puede tener valor terapéutico en el liposarcoma dediferenciado.

Mapeo De Regulación Integrativa Indica Que La Unión Al ARN Hur Familia De Proteínas Pre-mRNA De Procesamiento Y La Estabilidad Del MRNA

Molecular Cell. Aug, 2011  |  Pubmed ID: 21723170

ARN-proteínas de unión a coordinar los destinos de los RNAs múltiples, pero los principios que subyacen a estas interacciones a escala mundial siguen siendo poco conocidos. Hemos aclarado los mecanismos de regulación de la Hur proteínas de unión al ARN, mediante la integración de datos provenientes de diferentes tecnologías de alto rendimiento destinados, específicamente CLIP PAR-, RIP-chip, y de todo el expediente académico de perfiles de expresión. El número de sitios de unión por la transcripción, el grado de asociación de Hur, y el grado de Hur-dependiente del RNA de estabilización se correlacionaron positivamente. Pre-ARNm y ARNm maduro que contiene tanto intrónica y 3 'UTR sitios de unión eran más altamente estabilizada que las transcripciones con sólo 3' UTR o sitios de unión sólo intrónicas, lo que sugiere que las parejas Hur pre-ARNm de procesamiento con la estabilidad del mRNA maduro. También se observó Hur cambios dependientes de empalme y la unión sustancial de Hur en el tracto polypyrimidine de pre-ARNm. La comparación de los patrones espaciales que rodean Hur y miARN sitios de unión proporcionan evidencia funcional de Hur-dependiente antagonismo de proximal miARN mediada por la represión. Llegamos a la conclusión de que HuR coordina los resultados de expresión génica en múltiples etapas interconectadas de procesamiento del ARN.

ARN-ligasa Que Dependen De Los Sesgos En La Representación MiRNA En El Fondo-secuenciados Pequeñas Bibliotecas De ADNc De ARN

RNA (New York, N.Y.). Sep, 2011  |  Pubmed ID: 21775473

La secuenciación de las pequeñas bibliotecas de cDNA de RNA es una herramienta importante para el descubrimiento de ARN nuevos y el análisis de su estado mutacional, así como los cambios de expresión a través de muestras. Se requiere múltiples catalizadas por enzimas, incluyendo los pasos secuenciales ligaciones adaptador de oligonucleótidos a los 3 'y 5' extremos de los RNAs pequeños, transcripción inversa (RT) y PCR. Se evaluó el sesgo en la representación de miRNAs en relación con su concentración de entrada, con una piscina de 770 miRNAs sintéticos y 45 oligorribonucleótidos calibrador, y la prueba de la influencia de Rnl1 y dos variantes de Rnl2, Rnl2 (1-249) y (1-249 Rnl2) K227Q, para la ligadura 3'-adaptador. El uso de las variantes de la ligadura de Rnl2 adaptador dado muchos menos productos secundarios en comparación con Rnl1, sin embargo, los beneficios de usar Rnl2 permanecido oculto por los sesgos adicionales en el 5'-adaptador de la ligadura de paso, pasos de RT y la PCR no tuvo un impacto significativo en las frecuencias de leer. Intramoleculares estructuras secundarias de miRNA y / o miRNA / adaptador de 3'-productos contribuido a estas tendencias, que son altamente reproducibles en condiciones experimentales definidas. Se utilizó el cóctel miARN sintético y obtener los factores de corrección para la aproximación de los niveles absolutos de miRNAs individuales en muestras biológicas. Finalmente, se evaluó la influencia de la terminal 5 '5-nt extensiones de código de barras para un conjunto de 20 códigos de barras 3' adaptadores y observó tendencias similares en la distribución de miRNA leer, lo que permite ahorro de costes análisis multiplex para el perfil de miARN a gran escala.

Genoma Toda La Identificación De Los Objetivos De MicroARN En Células Madre Embrionarias Humanas Revela Un Papel Para MIR-302 En La Modulación De La Respuesta BMP

Genes & Development. Oct, 2011  |  Pubmed ID: 22012620

Los microARN son reguladores importantes en muchos procesos celulares, incluyendo células madre auto-renovación. Estudios recientes han demostrado su función como factores pluripotencia con la capacidad de reprogramación de células somáticas. Sin embargo, su papel en la madre embrionarias humanas (ES) células (hESCs) sigue siendo poco conocida, en parte debido a la falta de estrategias de todo el genoma para identificar sus objetivos. En este sentido, hemos realizado perfiles de microARN integral en hESCs y purificada derivados neurales y mesenquimales. Usando una combinación de AGO entrecruzamiento y experimentos de perturbación de microARN, junto con la predicción computacional, hemos identificado los objetivos de la agrupación miR-302/367, los microARN más abundantes en hESCs. Los estudios funcionales identificados nuevos roles de miR-302/367 en el mantenimiento de la pluripotencia y la regulación de la diferenciación hESC. Se demuestra que además de su papel en el TGF-β señalización, miR-302/367 promueve la proteína morfogenética ósea (BMP) de señalización BMP apuntando a los inhibidores de TOB2, DAZAP2 y SLAIN1. Este estudio amplía nuestro entendimiento de la función microARN en hESCs y es un recurso valioso para futuros estudios en esta área.

Nuevos Conocimientos En El Mecanismo De La Represión Mediada Por Objetivo MicroARN

Nature Structural & Molecular Biology. Nov, 2011  |  Pubmed ID: 22056803

Los Objetivos De ARN De La Familia De Proteínas De Tipo Salvaje Y Mutante FET

Nature Structural & Molecular Biology. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22081015

FUS, EWSR1 y TAF15, lo que constituye la familia de proteínas FET, son abundantes y muy conservadas ARN-proteínas de unión con un importante papel en la oncogénesis y la enfermedad neuronal, sin embargo, sus objetivos y elementos de reconocimiento de ARN son desconocidos. Utilizando el RAP-CLIP, que define las metas globales de ARN para todas las proteínas humanas FET y dos ELA mutantes causantes de FUS humanos. Miembros de la FET mostraron similares perfiles de unión, mientras que los mutantes FUS mostró un patrón alterado drásticamente vinculante, de conformidad con los cambios en la localización subcelular.

Targetome Micro ARN Viral De Los Infectados Por HVSK Líneas Celulares De Linfoma Primario De Cavidades

Cell Host & Microbe. Nov, 2011  |  Pubmed ID: 22100165

Linfoma de derrame primario (PEL) es causada por el sarcoma de Kaposi asociado a virus del herpes (HVSK) y con frecuencia también los puertos de Epstein-Barr (VEB). La expresión de KSHV-y EBV-codificados microARN (miRNA) en los PEL sugiere un papel de estos miRNAs en la latencia y linfomagénesis. Utilizando el RAP-CLIP, una tecnología que permite la identificación directa y transcriptoma amplio de objetivos miARN, que se delimiten los lugares de destino para todos los miRNAs virales y celulares expresadas en líneas celulares de ABP. El conjunto de datos resultante reveló que los miRNAs HVSK se dirige directamente a más de 2000 mRNAs celulares, muchos de ellos involucrados en las vías correspondientes a la patogénesis de HVSK. Por otra parte, el 58% de estos mRNAs también son blanco de miRNAs del VEB, a través de distintos sitios de unión. Además de un análogo conocido virus de la telefonía celular miR-155, se muestra que HVSK codifica un miRNA viral que imita celular MIR-142-3p función. En resumen, este estudio identifica una extensa lista de objetivos miARN HVSK, que puedan influir en la replicación viral y patogénesis.

Identificación De Las Redes De Interacción Proteína-ARN Mediante PAR-CLIP

Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22213601

Todas las moléculas de mRNA están sujetos a cierto grado de regulación de genes post-transcripcional (PTGR) que implica secuencia que dependen de la modulación de empalme, escisión y poliadenilación, edición, transporte, estabilidad, y la traducción. La reciente introducción de las tecnologías de secuenciación profunda permitido el desarrollo de nuevos métodos para el mapeo de los sitios en términos generales la interacción entre proteínas de unión a ARN (las prácticas comerciales restrictivas) y sus sitios de destino de ARN. En este artículo hacemos una revisión de entrecruzamiento e inmunoprecipitación (CLIP) métodos adaptados a gran escala de la identificación de la diana de ARN-sitios de unión y de los respectivos elementos de ARN de reconocimiento. CLIP métodos tienen el potencial para detectar cientos de miles de sitios de unión en los experimentos individuales, aunque la separación de la señal de ruido puede ser un reto. Como consecuencia, cada método CLIP ha desarrollado estrategias diferentes para distinguir los objetivos verdaderos de fondo. Nos centramos en fotoactivable ribonucleósido mejorada CLIP, que se basa en la incorporación intracelular de los análogos de ribonucleósido fotoactivables en la naciente transcripciones, y los rendimientos de los cambios característicos de la secuencia sobre la reticulación que facilitan la separación de la señal del ruido. El conocimiento preciso de la posición y la distribución de los sitios de unión a través de transcripciones de ARNm maduros y primaria permite una visión crítica en la localización celular y la función reguladora de la RBP examinados. Cuando se combina con otros sistemas de los enfoques de medición de la transcripción y la abundancia de proteínas, la generación de mapas de alta resolución del sitio de unión a través de las prácticas comerciales restrictivas, el transcriptoma ampliará nuestra comprensión de PTGR y por lo tanto dar lugar a nuevas estrategias para el tratamiento terapéutico de enfermedades genéticas perturbadores estos procesos. HILOS RNA 2011. doi: 10.1002/wrna.1103 Para más recursos sobre este artículo, por favor visite el sitio web de LOS CABLES.

El Micro ARN Viral Y Celular Targetome En Líneas Celulares Linfoblastoides

PLoS Pathogens. Jan, 2012  |  Pubmed ID: 22291592

Virus de Epstein-Barr (VEB) es un herpesvirus ubicuo humana ligada a un número de cánceres de células B y trastornos linfoproliferativos. Durante la infección latente, expresa VEB 25 virales pre-microARN (miRNA) e induce la expresión de miRNAs de acogida específicos, tales como miR-155 y miR-21, lo que potencialmente jugar un papel en la oncogénesis viral. Hasta la fecha, sólo un número limitado de objetivos miARN EBV han sido identificados, por lo que el papel de los miRNAs del VEB en la patogénesis viral y / o linfomagénesis no está bien definido. En este caso, hemos utilizado fotoactivable ribonucleósido mejorada entrecruzamiento e inmunoprecipitación (PAR-CLIP) en combinación con la secuencia de profundidad y análisis computacional para examinar exhaustivamente el targetome miARN viral y celular en la cepa VEB B95-8-infectados de líneas celulares linfoblásticas (LCLS). Se identificaron 7.827 interacciones miRNA-sitios en los 3.492 3'UTRs celulares. 531 de estos sitios contenían partidos de semillas de miRNAs virales. 24 PAR-CLIP- miARN identificados: las interacciones 3'UTR fueron confirmados por los ensayos de reportero. Nuestros resultados revelan que los miRNAs del VEB predominantemente objetivo transcripciones celulares durante la infección latente, por lo tanto la manipulación del entorno de acogida. Además, los objetivos de miRNAs del VEB están involucrados en múltiples procesos celulares que están directamente relacionadas a la infección viral, incluyendo la inmunidad innata, la supervivencia celular y la proliferación celular. Finalmente, se presentan evidencias de que-myc reguladas miRNAs host del clúster miR-17/92 puede regular la expresión de genes virales latentes. Este estudio exhaustivo de la targetome miRNA de las células B infectadas con EBV representa un paso clave hacia la definición de las funciones de VEB-miRNAs codificados y, potencialmente, la identificación de nuevas dianas terapéuticas para enfermedades malignas asociadas al VEB.