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Articles by Philipp Berninger in JoVE
JoVE General
PAR-Clip - un método para identificar transcriptoma en todo los sitios de unión de las proteínas de unión a ARN
1Howard Hughes Medical Institute, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, 2Berlin Institute for Medical Systems Biology, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 3Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 4Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 5Genomics Resource Center, Rockefeller University
Transcripciones de ARN están sujetas a numerosas normas posttranscriptional que está mediada por una multitud de trans-acción ARN-proteínas de unión (prácticas comerciales restrictivas). Aquí presentamos un método generalizable para identificar con precisión y en una escala de transcriptoma en todo los sitios de unión a ARN de las prácticas comerciales restrictivas.
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Análisis Computacional De ARN Pequeño Clonación De Datos
Clonación y secuenciación es el método de elección para la identificación normativa pequeña del RNA. Utilizando tecnologías de secuenciación profundo ahora se puede obtener hasta 1 billón de nucleótidos--y decenas de millones de pequeños RNAs--de una sola biblioteca. Cuidadosos Análisis computacionales de esas bibliotecas permitieron el descubrimiento de miRNAs, rasiRNAs, piRNAs y RNAs 21U. Dado el gran número de secuencias que pueden ser obtenidos de cada muestra individual, secuenciación profundo pronto puede ser una alternativa a la tecnología de microarrays de oligonucleótidos para perfiles de expresión de mRNA. En este informe presentamos los métodos que hemos desarrollado para la anotación y el perfil de expresión de RNAs pequeños obtenidos a través de la secuenciación a gran escala. Se trata de un algoritmo rápido para encontrar coincidencias casi perfectas de RNAs pequeños en bases de datos de secuencia, un sistema de software accesible desde la web para la anotación de pequeñas bibliotecas de RNA y un método bayesiano para comparar pequeña expresión de RNA a través de las muestras.
Los MicroRNA Controlan De Novo Metilación Del ADN a Través De La Regulación De Represores Transcripcionales En Células Madre Embrionarias De Ratón
Pérdida de microARN (miARN) vía componentes afecta negativamente la diferenciación de células madre embrionarias (ES), pero los mecanismos moleculares subyacentes siguen mal definidos. Aquí se caracterizan los cambios en las células madre embrionarias falta Dicer (Dicer1). Análisis de transcriptoma de Dicer-/-células indica que el cúmulo de miR-290 ES específico tiene una importante función reguladora en células madre embrionarias no diferenciadas. Constantemente, muchos de los defectos en las células deficientes Dicer pueden revertirse por la transfección con miRNAs familia miR-290. Demostramos que Oct4 (también conocido como Pou5f1) silenciamiento en diferenciar las células Dicer-/-ES es acompañado por acumulación de histona represivo marcas pero no por la metilación del ADN, lo que impide la represión estable de Oct4. El defecto de metilación se correlaciona con la regulación a la baja de novo DNA metiltransferasas (Dnmts). La regulación a la baja está mediada por Rbl2 y posiblemente otros represores transcripcionales, objetivos potenciales directos de miRNAs racimo de miR-290. La metilación de ADN defectuosa puede ser rescatada por la expresión ectópica de novo Dnmts o por la transfección de la miR-290 racimo miRNAs, indicando que de novo metilación del ADN en células madre embrionarias es controlado por miRNAs.
MIRNA Hibridación in Situ En Formaldehído Y Los Tejidos Fijados Con EDC
Los microARNs son pequeños ARNs reguladores con muchas funciones biológicas y las asociaciones de la enfermedad. Hemos demostrado que en la hibridación in situ (ISH) utilizando convencionales resultados fijación de formaldehído en la pérdida de microARN sustancial de las secciones de tejido de ratón, lo que puede prevenirse mediante la fijación con carbodiimida 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) que irreversiblemente inmoviliza el microARN en su 5 'fosfato. Se determinó los parámetros óptimos de hibridación para 130 sondas de ácidos nucleicos bloqueados mediante el registro de la temperatura de fusión nucleico ácido durante la ISH.
MirZ: Integrado MicroRNA Expresión Atlas Y Destino Predicción Recurso
MicroRNAs (miRNAs) son RNAs cortos que actúan como guías para la degradación y la represión traduccional de mRNAs proteína-codificación. Un gran cuerpo de trabajo demostró que los miRNAs están implicados en la regulación de una amplia gama de funciones biológicas, desde el desarrollo hasta la función cardiaca y el sistema inmunológico, cáncer del metabolismo. Para la mayoría de los 500 miRNAs que están codificadas en el genoma humano las funciones aún permanecen ser descubierto. Identificación de miRNAs cuya expresión cambia entre tipos de células o entre condiciones normales y patológicas, es un paso importante para caracterizar su función como es la predicción de mRNAs que podrían ser blanco de estos miRNAs. Para proveer a la comunidad la posibilidad de explorar interactivamente los patrones de expresión de miRNA y los objetivos del candidato de miRNAs en un entorno integrado, desarrollamos el servidor de web de MirZ, que es accesible en www.mirz.unibas.ch. El servidor proporciona a los biólogos experimentales y computacionales con análisis estadístico y herramientas de minería de datos en bases de datos actualizadas de perfiles de expresión de miRNA basadas en la secuenciación y de sitios de destino de miRNA prevista en especies que van desde Caenorhabditis elegans al Homo sapiens.
Se Suprime La Actividad De MicroRNA En Ovocitos De Ratón
MicroRNAs (miRNAs) son pequeños RNAs endógenos que típicamente imperfectamente pares con 3' sin traducir las regiones (3' incoe) y mediar degradación traslacional de la represión y mRNA. Dicer, que genera pequeños RNAs miRNA y vías de RNA de interferencia (ARNi), es esencial para la maduración meiótica de ovocitos de ratón. Encontramos que los 3' genoma de alza de transcripciones en ovocitos de Dicer1(-/-) no se enriquece en sitios de unión de miRNA, implicando un impacto débil de miRNAs en el transcriptoma materna. Por lo tanto, hemos probado la capacidad de miRNAs endógeno para mediar RNA-como escote o represión traduccional de los mRNAs del reportero. En contraste con las células somáticas, endógeno miRNAs en ovocitos mal reprimidos traducción de reporteros de mRNA, mientras que su actividad de ARNi-como fue mucho menos afectada. Reportero mRNA con sitios de Unión dejó-7 no se pudo localizar a P cuerpo-como las estructuras en ovocitos. Nuestros datos sugieren que la función de miRNA es regulada durante el desarrollo de ovocitos, una idea apoyada por maduración meiótica normal de ovocitos falta Dgcr8, que se requiere para la miRNA pero no la vía RNAi (Suh et al [1], este número de Current Biology). Supresión de la función de miRNA durante el crecimiento del ovocito es probable que un acontecimiento temprano en la reprogramación de la expresión génica durante la transición de un ovocito diferenciado en pluripotentes blastómeras del embrión.
Transcriptoma En Toda La Identificación De La Proteína De Unión Al ARN Y Los Sitios De Destino MicroARN Por PAR-CLIP
Las transcripciones de ARN están sujetos a la regulación de genes postranscripcional que participaron cientos de ARN-proteínas de unión a las prácticas comerciales restrictivas () y que contienen complejos de microARN-ribonucleoproteína (miRNPs) expresados en forma de células de tipo dependiente. Hemos desarrollado un enfoque reticulación a base de células para determinar en alta resolución y en todo el transcriptoma de los sitios de unión de las prácticas comerciales restrictivas y miRNPs celulares. Los sitios reticuladas son reveladas por timidina a las transiciones de citidina en los ADNc preparadas a partir de immunopurified RNPs de 4-tiouridina células tratadas. Se determinaron los sitios de unión y las consecuencias reglamentarias para varias prácticas comerciales restrictivas intensamente estudiados y miRNPs, incluyendo PUM2, QKI, IGF2BP1 3, AGO/EIF2C1-4 y TNRC6A-C. Nuestro estudio reveló que estos factores se unen miles de sitios que contengan la secuencia de motivos definidos y tienen distintas preferencias de exonic contra intrónica o codificación en comparación con las regiones no traducidas de transcripción. La asignación exacta de los sitios de unión de todo el transcriptoma será fundamental para la interpretación de los datos que emergen rápidamente sobre la variación genética entre los individuos y cómo estas variaciones contribuyen a enfermedades genéticas complejas.
Conservado Generación De Productos Cortos En PiRNA Lugares Geométricos
La vía de piRNA opera en líneas de germen animal para asegurar la integridad del genoma a través de retrotransposon silenciamiento. Los Pío proteína asociada pequeños RNAs (piRNAs) guían de proteínas Piwi retrotransposon transcripciones, que son degradadas y así post-transcriptionally silenciadas a través de un proceso de amplificación de ping-pong. Escote de la transcripción de retrotransposon define al mismo tiempo el extremo 5' de una secundaria piRNA que guiará a su vez una proteína Piwi a un precursor primario piRNA, amplificando así piRNAs primaria. Aunque varios estudios proporcionan evidencia que este mecanismo se conserva entre los metazoa, cómo se inicia el proceso y qué actividades enzimáticas son responsables de generar las piRNAs primaria y secundaria no son totalmente claros.
Miwi Catálisis Se Requiere Para PiRNA Amplificación Independiente LINE1 Transposon Silenciamiento
Repetitivo-elemento-deriva del Pío-interactuando RNAs (piRNAs) actúan junto con las proteínas Piwi Mili (también conocido como Piwil2) y Miwi2 (también conocido como Piwil4) en un mecanismo de defensa del genoma que inicia transposon silenciamiento mediante metilación del ADN en la línea de hombre germinales embrionarias de ratón. Este silenciamiento depende de la participación de las proteínas de Pío en una vía de amplificación de piRNA dependiente de la máquina de cortar y es esencial para la fertilidad masculina. Un tercer miembro de la familia del Pío, Miwi (también conocido como Piwil1), se expresa en células de germen postnatales específicas y asociados con un conjunto único de piRNAs de función desconocida. Aquí mostramos que Miwi es una RNasa guiada por RNA pequeño (cortar) que requiere amplia complementariedad para escote blanco in vitro. Interrupción de su actividad catalítica en ratones por una sola mutación de punto causa infertilidad masculina, y las células germen mutantes muestran mayor acumulación de transcritos de retrotransposon LINE1. Proporcionamos la evidencia para la actividad de la máquina de cortar de Miwi directamente hendiendo transposon mensajero ARN, que ofrece una explicación para el mantenimiento continuo de repetición derivados piRNAs largo después de silenciamiento del transposón se establece en las células madre de línea germinal. Además, nuestro estudio apoya un mecanismo de silenciamiento de cortadora-dependiente que funciona sin amplificación de piRNA. Así, las proteínas Piwi parecen actuar en un transposón mamífero doble estrategia de silenciamiento: uno promueve la represión transcripcional en el embrión, el otro refuerza silenciar a nivel post-transcripcional después del nacimiento.
