Patroon fotostimulering met Digital Micromirror Apparaten voor het Dendritische Integratie Onderzoek Across Branch Punten

Summary

Digitale Micromirror apparaten (DMD) kan genereren complexe patronen in ruimte en tijd om mee te neuronale prikkelbaarheid te controleren. Die relevant zijn voor het ontwerp, de bouw en de exploitatie van het DMD-systemen worden besproken. Een dergelijk systeem kon de demonstratie van niet-lineaire integratie tussen distale dendritische tak punten.

Abstract

Licht is een veelzijdige en nauwkeurige manier om neuronale prikkelbaarheid te controleren. De recente invoering van het licht gevoelige effectoren, zoals kanaal-rhodopsine en gekooide neurotransmitters hebben geleid tot belangen in het ontwikkelen van betere middelen om patronen van licht controle in ruimte en tijd die nuttig zijn voor experimentele neurowetenschappen. Een conventionele strategie, werkzaam in confocale en twee-foton microscopie, is aan het licht focus naar een diffractie beperkte plek en vervolgens opeenvolgend scan die enkele plek over de regio van belang. Deze aanpak wordt problematisch als grote gebieden moeten worden gestimuleerd binnen een korte tijd venster, een probleem dat meer van toepassing is op fotostimulatie dan voor de beeldvorming. Een alternatieve strategie is om het project de volledige ruimtelijk patroon op het doel met behulp van een digitaal Micromirror apparaat (DMD). De DMD aanpak is aantrekkelijk omdat de hardware componenten zijn relatief goedkoop en wordt ondersteund door commerciële belangen. Omdat een dergelijk systeem is niet beschikbaar voor rechtop microscopen, bespreken we de kritische punten in de bouw en de exploitatie van een dergelijk systeem DMD. Ook al zullen we in de eerste plaats de bouw van het systeem beschrijft voor UV fotolyse, zullen de wijzigingen voor de bouw van het veel eenvoudiger zichtbare licht voor optogenetic experimenten worden verstrekt. De UV fotolyse systeem werd gebruikt om de experimenten Carryout op een fundamentele vraag in de neurowetenschappen bestuderen, hoe ruimtelijk verdeeld ingangen geïntegreerd in distale dendritische tak punten. De resultaten suggereren dat de integratie kunnen niet-lineair zijn over de tak punten en de supralinearity is grotendeels tot stand door de NMDA-receptoren.

Protocol

Algemene overwegingen bij het ontwerp

Als de golflengte van foto stimulatie is in het zichtbare gebied, zoals voor optogenetic experimenten zal de lay-out van het systeem aanzienlijk eenvoudiger is dan voor UV fotolyse experimenten. Men hoeft alleen maar de aanschaf van een dubbele camera poort module die is verkrijgbaar bij alle van de microscoop bedrijven. De DMD vliegtuig kan worden gepositioneerd op de geconjugeerde beeldvlak van een van de twee camera poorten. Maar in UV fotolyse het licht afkomstig van de DMD moet in worden gebracht door middel van de epi-verlichting pad (Fig. 3A), omdat de beeldvorming buis lens die leidt tot de camera is niet gecorrigeerd voor UV golflengte in een van de commercieel beschikbare microscopen. De sferische aberratie van de beeldvorming buis lens bij 350 nm is ernstig genoeg om het vermogen om licht te concentreren op een krappe plek en voldoende ruimtelijke resolutie te genereren te voorkomen. Dit probleem is niet aangetroffen in confocale microscopie, omdat de buis lens wordt verwijderd wanneer een gecollimeerde laserstraal wordt aangevoerd langs dezelfde optische as. Het probleem van de UV-belichting kan worden opgelost door te brengen in het licht door de epi-tl-pad, omdat de buis lenzen zijn er al gedeeltelijk gecorrigeerd voor sferische aberratie bij de UV-golflengte. We kunnen uitbreiden op de optiek van microscopen in enigerlei mate het tijdschrift wensen. De wetenschappelijke gemeenschap is in het algemeen snel geïnteresseerd in dit onderwerp en er zijn niet veel bronnen die hij leert goed.

Met het oog op wijzigingen van de microscoop te minimaliseren en vanwege de krappe ruimte beperkingen op het epi-fluorescentie-eenheid, is de DMD geplaatst op een nieuwe conjugaat beeldvlak gemaakt door een relais lens (wijzen op de positie van de DMD-eenheid in relatie tot de microscoop). Een commerciële UV gecorrigeerd relais lens werd aangekocht (Specialty Optics) (punt het uit in het diagram en op de microscoop).

Verlichting van het DMD

Na ontvangst van de binaire ingang een Micromirror kan schakelen tussen een positieve en een negatieve 12 ° kantelen ten opzichte van het vlak van de chip. De rotatie-as is langs de diagonale hoeken van elke spiegel (45 ° naar de zijkant van de chip). De oriëntatie van de spiegel rotatie wordt aangeduid met een goudkleurige driehoek in een hoek aan de voorzijde van de chip. De hellingshoek van de Micromirror dicteert de uitlijning van de toonhoogte en azithmus van de inkomende verlichting balk. De toonhoogte van de verlichting balk moet worden 24 ° ten opzichte van de loodrechte as van de DMD-chip en azithmus moet loodrecht op de as van rotatie-spiegel. Precieze lichtbundel is van cruciaal belang voor een efficiënte werking. In het prototype systeem dat we ontworpen meerdere handmatige tilt aanpassingen die liet ons toe om te corrigeren voor het ontwerp en de bewerking onvolkomenheden. Dit resulteerde in een systeem dat is aanzienlijk meer volumineuze dan nodig is. Alternate, compactere regeling voor het binnenhalen van het licht mogelijk is (toon alternatieve ontwerp indien nuttig geacht).

Voor fotolyse experimenten een laserbron nodig is om het genereren van de hoge lichtintensiteit gefocusseerde bundel nodig voor een snelle uncaging. Voor optogenetic experimenten waarbij hoge intensiteit scherp licht niet nodig is, zou een niet-coherente lichtbron voldoende zijn. In de fotolyse experiment hier beschreven we gebruik van een quasi-continue diodegepompte solid state (DPSS) frequentie verdrievoudigd NdVO4 laser (een W, 355 nm). (Voor een gedetailleerde bespreking van de keuzes van lichtbronnen voor fotolyse zie referentie 2). Een relatief hoog vermogen laser nodig is in de experimenten die hier worden beschreven, omdat slechts een klein deel van de laser output is feitelijk worden geleverd met het model bij het gebruik van een DMD-systeem. De hoeveelheid licht geleverd waarvan het model is evenredig aan de verhouding van het aantal ON / OFF-spiegels binnen de regio verlicht door de laserstraal.

Als een laser lichtbron nodig is, is het het beste om de uitgang van de laser te lanceren in een multimode fiber, zodat het gemakkelijk positie en georiënteerd langs de juiste as voor het verlichten van de DMD worden. Het doorgeven van de licht door de optische vezel lost een tweede probleem, hoe het elimineren van de speckle patronen die inherent zijn aan coherent verlichting. De vezel is gewikkeld rond een piëzo-elektrische fiber brancard (model 915, Canadese Instrumentatie & Research, Ltd), die oscilleert op ~ 40 kHz. (Punt deze uit in de opstelling) De microscopische rekken van de vezel is voldoende om het patroon beweegt vele malen speckle tijdens de milliseconden duur van elke foto stimulatie puls, dus effectief het effect van de vlekjes te elimineren. De uitgang van de optische vezel wordt dan gecollimeerd met een UV-microscoop doelstelling (Olympus DApo20UV). (Punt dit uit) Een calibratie van de optische resolutie van het systeem is weergegeven in Fig. 3B. De effectieve resolutie van fysiologische zoals gemeten door de amplitude van de stroom als functie van de positie van de plek van de fotostimulatie is getoond in Fig. 3C. De huidige maatregelen tegen fotostimulatie van verschillende intensiteiten zijn weergegeven in Fig. 3D.

De werking van het systeem:

Co-registratie van de CCD pixels met de DMD spiegels

Een in-house software is geschreven, dat is bepalend voor de correspondentie van de individuele DMD spiegels aan specifieke pixels van de beeldvormende CCD-camera. De grafische user interface (GUI) binnen deze software kan de gebruiker vervolgens toewijzen van de DMD spiegels die in de regio komt op de CCD getagged door de muis. Zo kan de locatie voor foto stimulatie worden gelabeld door simpelweg het verplaatsen van de cursor over het beeld wordt weergegeven op het computerscherm en te klikken op de gelabelde regio van belang. (Een TL-beeld van een dendritische prieel wordt weergegeven op het computerscherm. Student zal een aantal locaties markeren over het beeld op het computerscherm.)

Het programmeren van de patronen voor lichte aflevering

Het patroon aangegeven op het computerscherm door de operator wordt opgeslagen als een reeks afzonderlijke beelden. De timing van de laserpulsen voor elk ruimtelijk patroon wordt vervolgens geprogrammeerd in de software die is geïntegreerd met data-acquisitie-programma (pClamp). (Dit aantonen).

De coördinatie van de laserpulsen aan de DMD patronen

De data-acquisitie programma initieert en coördineert de timing van de DMD elektronica, de gating van de laser, en de overname van de patch geklemd elektrische signaal van het doel neuron. (Simuleren deze volgorde op de computer)

Experimentele gegevens:

Niet-lineaire sommatie over distale dendritische vertakkingspunten

Dendritische integratie met elektroden is van oudsher uitgevoerd door het variëren van de amplitude van de stimulatie op discrete locaties in plaats van uit te breiden op het gebied van stimulering met behoud van een constante intensiteit. Kwesties met betrekking tot verzadiging van electrogenesis en de aanwerving van de locatie afhankelijk kanalen kan invloed hebben op de resultaten en conclusie. Distributed dendritische stimulatie kan gemakkelijk worden geïmplementeerd met behulp van een DMD gebaseerd systeem (Fig. 4A). Input intensiteit werd gevarieerd door het verhogen van het aantal plekken van fotostimulering. We kunnen zien dat de ruimtelijke sommatie kan non-lineair zijn over vertakkingspunten steeds supra-lineair met de toenemende inbreng amplitudes aankomst op de twee dochter takken. De supra-lineariteit is grotendeels tot stand NMDA-receptoren en niet aan gated kanalen (Fig. 5) spanning

Representatieve resultaten

Figuur 1. Werking van de microspiegels in het DMD. (Zijaanzicht) elektrostatische krachten gericht op individuele spiegels ervoor zorgen dat de spiegel te worden gekanteld in een van de twee mogelijke richtingen 12 ° met de horizontaal. In de stand een invallende bundel is gericht langs de optische as loodrecht van de chip. In de UIT-stand van de invallende bundel is gericht 48 ° van de as. Licht dat de dunne openingen tussen de spiegels hits is gericht 24 ° van de as. (Bovenaanzicht) het kantelen is georiënteerd 45 ° ten opzichte van de zijkanten van de spiegels en chip.

Figuur 2. Basic lay-out van de moderne fluorescentiemicroscoop. Het filter kubus is gepositioneerd in de "oneindige ruimte" tussen de objectieve en de buis lens. Er is een imaging pad dat leidt naar de camera en er is een verlichting pad dat het licht brengt het monster. De buis lens voor deze twee lichtpad zijn meestal verschillend in ontwerp en in de brandpuntsafstand. De verlichting, maar niet de beeldvorming, is buis lens die ontworpen is voor gebruik in het UV-spectrum.

Figuur 3. Lay-out voor UV op basis van DMD-systeem. Als de verlichting wordt in het UV-spectrum, dan moet worden gebracht door middel van de buis lens die is gecorrigeerd voor UV. De buis lens in de beeldvorming pad is niet ontworpen voor UV. Een relais systeem is nodig om een ​​gemakkelijk toegankelijk conjugaat beeldvlak te creëren. De verschillende conjugaat beeldvlakken in de microscoop wordt gemarkeerd door gestippelde rode lijnen. Bright patronen in een beeldvlak worden geprojecteerd in andere conjugaat vliegtuigen. Tijdens beeldvorming van het patroon in de steekproef vlak is geprojecteerd op de detector / camera. Voor verlichting van de patroon gegenereerd door de DMD is geprojecteerd op het monster.

Figuur 4. Lay-out voor zichtbaar licht DMD projectie systeem. Als de verlichting licht is in het zichtbare gebied, is het mogelijk om de DMD opgewekte licht patroon door de beeldvorming lichtpad. Dit kan gemakkelijk worden geïmplementeerd met commercial dual camera poort bijlagen en de juiste dichroic spiegel.

Figuur 5. Laterale resolutie van het systeem. (A) Optische resolutie over tl-doel is ~ 2 micrometer. (B) Effectieve resolutie zoals gemeten door fotolyse van gekooide glutamaat in een dendriet is ~ 5 micrometer. De toegenomen afstand is te wijten aan een combinatie van de verspreiding van glutamaat en het eindige breedte van de dendriet. (C) Fotolyse kan nabootsen de kinetiek van synaptische gebeurtenissen. De familie van de spanning geklemd huidige reacties is te wijten aan variaties in het licht energie geleverd aan de dendriet.

Figuur 6. Niet-lineaire sommatie over dendritische tak punten. (A) Distributed ingangen worden toegepast op twee dendritische takken afzonderlijk. Hun respectievelijke spanning reacties worden hieronder weergegeven. (B) De prikkels worden vervolgens gelijktijdig gegeven. De gemeten respons (rood trace) is anders dan de rekenkundige som van de twee individuele antwoorden (grijze spoor).

Figuur 7. Supralinear sommatie is NMDA receptor afhankelijk. (A) APV, een selectieve NMDA receptor antagonist blokkeert de supralinear optelling. (B) De stimulus intensiteit relatie en de gevoeligheid voor NMDA receptor antagonist is uitgezet.

Discussion

Het voordeel van DMD gebaseerd fotostimulatie aanpak is het meest zichtbaar voor situaties waarin de doelgroep heeft een relatief groot gebied. Als het doel van belang is zeer klein, zoals een paar dendritische spines, sequentiële scanning confocale en twee-foton systemen zijn waarschijnlijk de betere aanpak zijn. Een belangrijke zwakte van de DMD aanpak is het inefficiënt gebruik van het beschikbare licht. Het grootste deel van het beschikbare licht is per definitie gericht op de OFF spiegels en niet gebruikt.

Het DMD gebaseerd systeem is het meest geschikt voor gebruik in het zichtbare gebied. We verwachten op basis van DMD fotostimulering systemen zullen een belangrijke impact te maken bij het in dienst met optogenetics experimenten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modern upright fluorescent microscope
CCD camera and image acquisition software
Computer and data acquisition/interface system
DLP Discovery Developer Kit
ALP3 USB interface
S2 + Optics w/LED
Dual camera port unit
355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)	DPSS Laser Inc.
Laser shutter Model LS6	Uniblitz
Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915	Canadian Instrument and Research, Ltd		100 um core multimode fiber
Multimode Fiber launcher	Oz Optics
Signal generator			up to 50 kHz
Beam collimator	Olympus Corporation	DApo20UV340
UV relay lens	Special Optics	#: 54-25-60-355