图案与数字微镜装置Photostimulation调查跨分支点的树突状融合

Summary

数字微镜器件（DMD），可以在时间和空间产生复杂的图案，用以控制神经元的兴奋性。的DMD系统的设计，施工，操作的有关问题进行了讨论。这样一个系统，使在远端树突分支点非线性一体化的示范。

Abstract

Light是一个通用和精确的手段来控制神经元的兴奋性。近期出台的通道的视紫红质和笼中的神经递质，如光敏感效应，导致以利益在开发更好的手段来控制光的模式，在空间和时间是有用的实验神经科学。一个传统的战略，在共聚焦和双光子显微镜就业，是集中光线的衍射有限点，并在感兴趣的区域，然后扫描顺序单点。这种方法就出现了问题，如果大面积必须在很短的时间窗口，一个问题比成像更适用photostimulation的刺激。另一种方法是数字微镜器件（DMD）的援助项目的完成对目标的空间格局。 DMD的做法是有吸引力，因为硬件组件都相对便宜，而且是由商业利益的支持。因为这种制度是不是直立式显微镜，我们将讨论在这样一个DMD系统的建设和运营的关键问题。即使我们将主要描述紫外光解的制度建设，为建设optogenetic实验可见光系统简单得多的修改也将提供。紫外光解系统是用于结转库存实验，以研究在神经科学中的一个根本性的问题，如何在空间上分布在远端树突分支点综合投入。结果表明，一体化非线性跨分支点和supralinearity主要是由NMDA受体介导的。

Protocol

一般的设计考虑

如果照片刺激的波长在可见光范围内，如optogenetic实验，的，系统的布局，将大大高于简单紫外光解实验。人们只需要购买一个双摄像头端口模块，显微镜公司所有。 DMD的平面，可以放置在任何一个的两个摄像头端口的共轭平面图像。但在紫外线光解从DMD的光必须被通过的外延照明路径（图3A），因为相机的成像管镜头是没有任何市售显微镜紫外线波长纠正。在350 nm的成像管镜头的球面像差是严重到足以防止能力为重点的光紧点，并产生足够的空间分辨率。这个问题是没有遇到因为管取下镜头时沿同一光轴准直激光束带来，在激光共聚焦显微镜。因为管镜片也有部分在紫外线波长的球面像差纠正所带来的问题是可以解决的紫外光照射在通过外延荧光路径。我们可以扩展光学显微镜在任何程度杂志的愿望。科学界一般快速在这个主题感兴趣，并有许多来源，教得好。

为了尽量减少显微镜的修改，因为紧凑的空间限制，在落射荧光装置，DMD是放置在一个新创建的共轭影像平面创建一个中继镜头（相对于点出的DMD单元的位置显微镜）。商业紫外线纠正继电器镜头购（专业光学）（点图和显微镜）。

的DMD的照明

微镜可以在收到其二进制输入一个积极的和负12 °倾斜，相对于平面芯片之间切换。旋转轴是沿对角线角落每个镜像（45 °芯片的两侧）。镜像旋转的方向是指定的黄金在芯片表面上的一个角落的彩色三角形。微镜的倾斜角度决定传入照明光束的音调和azithmus对齐。照明光束的音调，需要24 ° DMD芯片和azithmus需要镜子旋转轴垂直的垂直轴。精确的光束对准高效运行的关键。在原型系统中，我们设计了多个手动倾斜调整，使我们能够正确的设计和加工的不足之处。这导致在一个系统中，是相当多的笨重的比是必要的。替代的，更紧凑带来光的安排是可能的（如果认为有用，显示替代设计）。

对于光解实验，激光源产生的高光强度聚焦光束快速uncaging必要。 optogenetic不需要高强度急剧聚焦光线的实验，一个非相干光源就足够了。在这里描述的光解实验，我们采用一个准连续二极管泵浦固态（DPSS）的频率增加了两倍NdVO4激光（1瓦，355纳米）。 （光解光源的选择，对于一个详细的讨论见参考文献2）。因为只有一个激光输出的一小部分是实际交付的标本时使用的DMD系统，需要一个相对高功率激光在这里所描述的实验。传递到试样的光量成正比的激光束照射的区域内的ON / OFF的镜子比。

如果激光光源是必需的，它是最好的发射到多模光纤激光的输出，所以，它可以容易沿着正确照亮DMD的轴的地位和的导向。光通过光纤传输解决第二个问题，如何消除斑点相干照明的固有模式。该纤维是伤口周围的压电纤维担架“（型号915，加拿大的仪器及研究有限公司）〜40千赫的振荡。 （点出在这些钻机）纤维的微观足够的移动散斑毫秒为单位的持续时间在每张照片的刺激脉冲模式多次，从而有效地消除斑点的效果。光纤输出，然后平行与紫外显微镜物镜（奥林巴斯DApo20UV）。 （指出这一点）校准系统的光学分辨率，如图所示。 3B。有效的生理功能的现场照片作为位置测量电流的流动幅度的决议如图刺激。 3C。对不同强度photostimulation的电流响应如图所示。 3D。

系统的操作：

联合登记与CCD像素的DMD反射镜

在内部软件的书面决定个别成像CCD相机的具体像素的DMD反射镜对应。然后在这个软件的图形用户界面（GUI），允许用户指定对应于该地区的鼠标标签的CCD图像的DMD反射镜。因此，照片刺激的位置，可以用来标记只需对计算机屏幕上显示的图像的光标移动和点击标签地区的利益。 （树突状乔木的荧光图像将显示在电脑屏幕上，学生将在计算机屏幕上的形象标志的一些地点。）

编程光交付模式

由操作员的电脑屏幕上标出的模式是一系列作为一个单独的图像存储。每个空间格局的激光脉冲的时间，然后到这是与数据采集程序（pClamp）集成的软件编程。 （说明这一点）。

协调的激光脉冲的DMD模式

数据采集​​程序发起和协调的DMD电子，激光浇注，和收购的补丁的时间夹住目标神经元的电信号。 （在计算机上模拟这个顺序）

实验数据：

在远端树突状的分支点的非线性求和

与电极的树突状融合传统上一直进行离散位置的不同幅度的刺激，而不是扩大面积的同时，保持恒定强度的刺激。 electrogenesis和依赖渠道的位置招聘饱和有关的问题可以影响的结果和结论。分布式树突状刺激可以很容易地使用一个DMD为基础的系统（图4A）。 photostimulation点的数量增加投入力度是不同的。我们可以看到，可以跨越空间的总和分支点越来越成为到达的两个女儿分行加大投入幅度超线性非线性。超线性主要是介导NMDA受体，而不是电压门控通道（图5）

代表性的成果

图1：在DMD微镜的运作。 （侧视）针对个别镜子的静电引力导致两个可能的方向从横向12 °倾斜的镜子。在ON位置时，入射光的指示沿垂直于光轴的芯片。在OFF位置，入射光是针对48 °离轴。光打薄的镜子之间的差距是针对24 °离轴。 （顶视图）的倾斜是面向45 °两侧的反光镜和芯片。

图2。现代的荧光显微镜的基本布局。过滤器的多维数据集是定位在“无限空间”的目标和管镜头之间。是导致相机的成像路径，有一个样品带来的光的照明路径。这两个光路的管镜头通常是在设计和焦距的不同。照明，但不成像，管镜头的目的是在紫外光谱的操作。

图3。紫外线基于DMD的系统布局。如果照明是在紫外光谱，那么它必须通过管镜头，纠正紫外线带来。管镜头在成像路径是不是设计的紫外线。一个中继系统是需要创造一个方便的共轭平面图像。不同的共轭显微镜图像平面标志是红色虚线的线条。预计在其他的共轭平面在一个平面图像的明亮模式。在成像过程中，在样品平面图案投射到探测器/相机。由DMD生成的模式用于照明投射到样品。

图4。可见光DMD投影系统的布局。如果在可见光范围内的照明灯，它是可能带来的DMD产生通过成像光路的光纹。这可以方便地实现与commerci人的双摄像头端口附件和相应的分色镜。

图5系统的横向分辨率。 （一）荧光靶上的光学分辨率为1〜2微米。 （b）有效解决跨枝蔓测量光解笼谷氨酸〜5微米。距离增加是由于结合谷氨酸和扩散的有限宽度的枝蔓。 （三）光解可以模仿的突触活动的动力学。家庭的电压钳位电流的反应，是因为在交付的枝蔓光能量的变化。

图6。非线性跨树突分支点的总和。 （一）适用于分布式输入两个树突分支分开。他们各自的电压响应如下所示。 （二）刺激，然后同时进行。测量响应（红色曲线）是不同的两个个体反应（灰色跟踪）的算术总和比。

图7。Supralinear求和是NMDA受体依赖性。 （一），有选择性的NMDA受体拮抗剂APV块supralinear的总和。 （二）绘制刺激强度的关系及其NMDA受体拮抗剂的敏感性。

Discussion

基于DMD的photostimulation方法的优点是最明显的目标中占有相对大面积的情况下。如果利益的目标是非常小的，如几个树突棘，的，连续扫描共聚焦和双光子系统可能是更好的方法。 DMD的方法的一个重大弱点是其低效利用现有的光。大部分可用的光必然是向关镜，不使用。

基于DMD的制度是最适合在可见光范围内操作。我们期望与光遗传学实验时，DMD的基础photostimulation系统将作出重大的影响。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modern upright fluorescent microscope
CCD camera and image acquisition software
Computer and data acquisition/interface system
DLP Discovery Developer Kit
ALP3 USB interface
S2 + Optics w/LED
Dual camera port unit
355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)	DPSS Laser Inc.
Laser shutter Model LS6	Uniblitz
Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915	Canadian Instrument and Research, Ltd		100 um core multimode fiber
Multimode Fiber launcher	Oz Optics
Signal generator			up to 50 kHz
Beam collimator	Olympus Corporation	DApo20UV340
UV relay lens	Special Optics	#: 54-25-60-355