Padronizada fotoestimulação com dispositivos Digital Micromirror para Investigar Integração dendríticas em pontos Branch

Summary

Digital micromirror dispositivos (DMD) pode gerar padrões complexos em tempo e espaço com o qual o controle da excitabilidade neuronal. Questões relevantes para a concepção, construção e operação de sistemas de DMD são discutidos. Tal sistema permitiu a demonstração de não-linear integração entre distal pontos de ramificação dendrítica.

Abstract

A luz é um meio versátil e precisa para o controle da excitabilidade neuronal. A recente introdução da luz effectors sensíveis, tais como canais de rodopsina e neurotransmissores enjaulado levaram a interesses no desenvolvimento de melhores meios para controlar os padrões de luz no espaço e no tempo que são úteis para fins experimentais da neurociência. Uma estratégia convencional, empregada na microscopia confocal e 2-fóton, é para focalizar a luz para um ponto de difração limitada e, então, verificar que o único ponto em seqüência sobre a região de interesse. Esta abordagem torna-se problemática se grandes áreas devem ser estimuladas dentro de uma janela de tempo breve, um problema mais aplicável a fotoestimulação do que para a imagem latente. Uma estratégia alternativa é projetar o padrão completo espacial no alvo com o auxílio de um dispositivo de microespelhos digitais (DMD). A abordagem DMD é atraente porque os componentes de hardware são relativamente baratos e é apoiado por interesses comerciais. Porque esse sistema não está disponível para microscópios verticais, vamos discutir as questões críticas na construção e operação de um tal sistema DMD. Mesmo que será principalmente descrevendo a construção do sistema de fotólise UV, as modificações para a construção do sistema de luz visível muito mais simples para os experimentos optogenetic também serão fornecidas. O sistema de fotólise UV foi usada para carryout experimentos para estudar uma questão fundamental em neurociência, como estão espacialmente distribuídos insumos integrada através de pontos de ramificação distal dendríticas. Os resultados sugerem que a integração pode ser não-linear em pontos de ramificação eo supralinearity é largamente mediada por receptores NMDA.

Protocol

Considerações gerais de projeto

Se o comprimento de onda de estimulação foto está na faixa do visível, como para experiências optogenetic, o layout do sistema será consideravelmente mais simples do que para os experimentos de fotólise UV. Um só precisa comprar um módulo de porta dupla câmara que está disponível a partir de todas as empresas microscópio. O avião DMD pode ser posicionado no plano da imagem conjugada de qualquer uma das duas portas da câmara. Mas, na fotólise UV a luz proveniente da DMD devem ser levados em pelo caminho epi-iluminação (Fig. 3A), porque a lente do tubo de imagem de liderança para a câmera não for corrigido para comprimento de onda UV em qualquer um dos microscópios comercialmente disponíveis. A aberração esférica da lente do tubo de imagem em 350 nm é grave o suficiente para impedir a capacidade de focalizar a luz para um local apertado e gerar resolução espacial suficiente. Este problema não é encontrado em microscopia confocal porque a lente do tubo é removido quando um feixe de laser colimado é trazido ao longo do mesmo eixo óptico. O problema da iluminação UV pode ser resolvido por trazer à luz através do caminho epi-fluorescente porque as lentes do tubo existem todos os parcialmente corrigida para aberração esférica no comprimento de onda UV. Podemos expandir a ótica dos microscópios em qualquer grau, os desejos do jornal. A comunidade científica é, em geral, interessados ​​rápida neste tópico e não há muitas fontes que ensina-lo bem.

A fim de minimizar modificações do microscópio e devido a restrições de espaço apertado na unidade de epi-fluorescência, a DMD é colocado em um plano de imagem recém-criada conjugado criado por uma lente relay (ponto a posição da unidade de DMD em relação ao microscópio). A UV comercial corrigido lente relay foi comprado (Optics Especialidade) (ponto-a no diagrama e no microscópio).

Iluminação da DMD

Ao receber a sua entrada binária um micromirror pode alternar entre um positivo e um negativo 12 ° de inclinação em relação ao plano do chip. O eixo de rotação é ao longo da diagonal cantos de cada espelho (45 ° para os lados do chip). A orientação da rotação do espelho é designado por um triângulo dourado em um canto na superfície frontal do chip. O ângulo de inclinação dos microespelhos dita o alinhamento do campo e azithmus do feixe de iluminação de entrada. A afinação do feixe de iluminação precisa ser 24 ° do eixo perpendicular do chip DMD e necessidades azithmus ser perpendicular ao eixo de rotação do espelho. Alinhamento do feixe preciso é fundamental para uma operação eficiente. No sistema protótipo nós projetamos múltiplos ajustes de inclinação manual que nos permitiu corrigir inadequações de projeto e usinagem. Isto resultou em um sistema que é consideravelmente mais volumoso do que o necessário. Arranjo, alternativo mais compacto para trazer à luz é possível (show projeto alternativo, se for considerado útil).

Para experimentos de fotólise uma fonte de laser é necessária para gerar o feixe de alta intensidade de luz focada necessários para uncaging rápida. Para experimentos optogenetic onde a luz de alta intensidade focalizados não é necessária, uma fonte de luz não coerente seria adequada. No experimento descrito aqui fotólise empregados um diodo semi-contínua bombeado de estado sólido (DPSS) freqüência triplicou NdVO4 laser (1 W, 355 nm). (Para uma discussão detalhada sobre as opções de fontes de luz para fotólise ver referência 2). Um laser de potência relativamente alta é necessário nos experimentos descritos aqui porque apenas uma pequena fração da saída do laser é efectivamente entregue ao espécime quando se utiliza um sistema de DMD. A quantidade de luz entregues ao modelo é proporcional à razão entre o número de ON / OFF espelhos na região iluminada pelo feixe de laser.

Se uma fonte de luz laser é necessário, é melhor para lançar a saída do laser em uma fibra multimodo para que ele possa ser facilmente posição e orientada ao longo do eixo correto para iluminar a DMD. Transmissão da luz através da fibra óptica resolve um segundo problema, como eliminar os padrões speckle inerentes à iluminação coerente. A fibra é enrolada em torno de uma maca de fibra piezoelétrico (modelo 915, Instrumentação Canadian & Research, Ltd), que oscila em ~ 40 kHz. (Ponto estas no rig) O microscópicas alongamento da fibra é suficiente para move o speckle pattern muitas vezes durante a duração de cada pulso milissegundos foto estimulação, assim, efetivamente eliminando o efeito de manchas. A saída da fibra óptica é então colimados com uma objetiva de microscópio UV (Olympus DApo20UV). (Apontar isso) A calibração da resolução óptica do sistema é mostrado na figura. 3B. A resolução efetiva fisiológica medida pela amplitude do fluxo de corrente em função da posição do local da fotoestimulação é mostrado na figura. 3C. Respostas atual para fotoestimulação de diferentes intensidades são ilustrados na fig. 3D.

Funcionamento do sistema:

Co-registro do pixels CCD com os espelhos DMD

Um software in-house foi escrito que determina a correspondência de cada um dos espelhos DMD para pixels específicos da câmera CCD de imagem. O usuário interface gráfica (GUI) dentro deste software, permite que o usuário atribua os espelhos DMD que corresponde à região na imagem CCD marcados pelo mouse. Assim, o local para a estimulação da foto pode ser marcado simplesmente movendo o cursor sobre a imagem exibida na tela do computador e clicar na região com a tag de interesse. (A imagem fluorescente de um mandril dendríticas será exibido na tela do computador. Student vai marcar um número de posições sobre a imagem na tela do computador.)

Programação dos padrões para a entrega de luz

O padrão marcado na tela do computador pelo operador é armazenado como uma série de imagens separadas. O tempo dos pulsos de laser para cada padrão espacial é então programado para o software que está integrado com os dados do programa de aquisição (pClamp). (Demonstrar isso).

Coordenar os pulsos de laser para os padrões de DMD

O programa de aquisição de dados inicia e coordena o tempo da eletrônica DMD, a propagação do laser, ea aquisição do patch preso sinal elétrico do neurônio alvo. (Simular esta seqüência no computador)

Dados experimentais:

Não-linear através de somatório distal pontos de ramificação dendríticas

Integração dendríticas com eletrodos tem sido tradicionalmente realizado através da variação da amplitude da estimulação em locais discretos, em vez de expandir a área de estimulação, mantendo uma intensidade constante. Questões relacionadas com a saturação do eletrogênese e recrutamento de canais dependentes da localização pode influenciar o resultado e conclusão. Distribuídos estimulação dendríticas pode ser facilmente implementado usando um sistema baseado DMD (Fig. 4A). Intensidade de entrada foi variado, aumentando o número de pontos de fotoestimulação. Podemos ver que soma espacial pode ser não-linear ao longo pontos de ramificação cada vez mais supra-linear, com amplitudes de entrada aumentando chegando em dois ramos filha. O supra-linearidade é largamente mediada receptores NMDA e não a tensão de canais fechados (Fig. 5)

Resultados representante

Figura 1. Operação da microespelhos na DMD. (Vista lateral) forças eletrostáticas dirigida a espelhos individuais causam o espelho para ser inclinado em uma das duas orientações possíveis 12 ° da horizontal. Na posição ON um feixe incidente é direcionado ao longo do eixo óptico perpendicular do chip. Na posição OFF o feixe incidente é direcionado 48 ° fora do eixo. Luz que atinge as lacunas fina entre os espelhos é direcionado 24 ° fora do eixo. (Vista de cima) a inclinação é orientada 45 ° com relação aos lados dos espelhos e chip.

Figura 2. Arranjo básico de um microscópio fluorescente moderna. O cubo de filtro está posicionado no "espaço infinito" entre o objetivo ea lente do tubo. Há um caminho que leva a imagem da câmera e não há um caminho de iluminação que traz a luz para a amostra. A lente do tubo para estas caminho da luz dois são tipicamente diferentes no projeto e no comprimento focal. A iluminação, mas não a imagem, lente do tubo é projetado para operação no espectro UV.

Figura 3. Layout para sistema baseado UV DMD. Se a iluminação está no espectro UV, então ele deve ser trazido através da lente do tubo que é corrigida por UV. A lente do tubo no caminho de imagem não é projetada para UV. Um sistema de revezamento é necessária para criar um plano de imagem facilmente acessível conjugado. Os planos diferentes de conjugado imagem no microscópio é marcada por linhas pontilhadas vermelhas. Padrões brilhantes em um plano de imagem são projetadas em planos conjugados outros. Durante a gravação do padrão no plano da amostra é projetada sobre o detector / câmera. Para a iluminação do padrão gerado pela DMD é projetada na amostra.

Figura 4. Layout para sistema de projeção de luz visível DMD. Se a luz de iluminação é na faixa do visível, é possível trazer o padrão de luz DMD gerado através do caminho da luz de imagem. Isso pode ser facilmente implementado com commercial câmera dupla anexos porta eo espelho apropriado dicróicas.

Figura 5. Resolução lateral do sistema. (A) Resolução óptica no alvo fluorescente é ~ 2 micra. (B) resolução efetiva medida por fotólise de glutamato enjaulado em um dendrito é de aproximadamente 5 mm. A distância maior é devido a uma combinação de difusão de glutamato ea largura finita do dendrito. (C) Fotólise podem imitar a cinética de eventos sinápticos. A família de tensão preso respostas atual se deve a variações na energia da luz entregue ao dendrito.

Figura 6. Non-linear através de somatório pontos de ramificação dendrítica. (A) entradas distribuídas são aplicadas a dois ramos dendríticas separadamente. Suas respostas tensão respectivas são mostradas abaixo. (B) Os estímulos são dadas simultaneamente. A resposta medida (vermelho trace) é diferente do que a soma aritmética das duas respostas individuais (cinza traço).

Figura 7. Somatório supralinear é dependente do receptor NMDA. (A) APV, um antagonista do receptor NMDA seletivo bloqueia o somatório supralinear. (B) A relação intensidade do estímulo e sua sensibilidade para antagonista do receptor NMDA é traçado.

Discussion

A vantagem da abordagem baseada fotoestimulação DMD é mais aparente para situações em que o alvo ocupa uma área relativamente grande. Se o alvo de interesse é muito pequeno, como um espinhas dendríticas, sistemas de digitalização seqüencial confocal e 2-fótons são susceptíveis de ser a melhor abordagem. Uma fraqueza significativa da abordagem DMD é o uso ineficiente da luz disponível. A maior parte da luz disponível é necessariamente direcionado para os espelhos OFF e não utilizados.

O sistema baseado DMD é o mais adequado para a operação na faixa do visível. Prevemos DMD sistemas baseados fotoestimulação vai ter um impacto significativo quando empregado com experimentos optogenética.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modern upright fluorescent microscope
CCD camera and image acquisition software
Computer and data acquisition/interface system
DLP Discovery Developer Kit
ALP3 USB interface
S2 + Optics w/LED
Dual camera port unit
355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)	DPSS Laser Inc.
Laser shutter Model LS6	Uniblitz
Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915	Canadian Instrument and Research, Ltd		100 um core multimode fiber
Multimode Fiber launcher	Oz Optics
Signal generator			up to 50 kHz
Beam collimator	Olympus Corporation	DApo20UV340
UV relay lens	Special Optics	#: 54-25-60-355