Patrón fotoestimulación con dispositivos digitales de Micromirror encargado de investigar la integración a través de puntos dendríticas Poder

Summary

Dispositivos digitales de microespejos (DMD) pueden generar patrones complejos en tiempo y espacio con el que el control de la excitabilidad neuronal. Temas relevantes para el diseño, construcción y operación de sistemas de DMD se discuten. Dicho sistema permitió a la demostración de la no-lineal de integración a través de los puntos de ramificación distal dendríticas.

Abstract

La luz es un medio versátil y preciso para el control de la excitabilidad neuronal. La reciente introducción de la luz efectores sensibles tales como el canal-rodopsina y los neurotransmisores enjaulados han llevado a los intereses en el desarrollo de mejores medios para controlar los patrones de luz en el espacio y el tiempo que son útiles para la neurociencia experimental. Una de las estrategias convencionales, empleados en microscopía confocal y dos fotones, es para enfocar la luz hacia un punto de difracción limitada y luego buscar ese lugar único secuencial a lo largo de la región de interés. Este enfoque se vuelve problemático si grandes áreas tienen que ser estimulado dentro de una ventana de tiempo breve, un problema más aplicable a la fotoestimulación de la imagen. Una estrategia alternativa consiste en proyectar el patrón espacial completo en el destino con la ayuda de un dispositivo digital de microespejos (DMD). El enfoque de DMD es atractiva porque los componentes de hardware son relativamente baratos y con el apoyo de intereses comerciales. Debido a que este sistema no está disponible para microscopios verticales, vamos a discutir los temas críticos en la construcción y operación de un sistema de DMD. A pesar de que serán los principales que describen la construcción del sistema de fotólisis UV, las modificaciones para la construcción del sistema mucho más simple la luz visible para los experimentos optogenetic también se proporcionará. El sistema de fotólisis UV se utilizó para llevar acabo experimentos para estudiar una cuestión fundamental en la neurociencia, ¿cómo son distribuidos espacialmente entradas integradas a través de los puntos de ramificación distal dendríticas. Los resultados sugieren que la integración puede ser no lineal en los puntos de ramificación y el supralinearity es en gran parte mediada por los receptores NMDA.

Protocol

Consideraciones generales de diseño

Si la longitud de onda de la estimulación de fotos está en el rango visible, por ejemplo, para experimentos optogenetic, el diseño del sistema será mucho más sencillo que para los experimentos de fotólisis UV. Uno sólo tiene que comprar un módulo de cámara de doble puerto que está disponible en todas las empresas microscopio. El avión de DMD se puede colocar en el plano de la imagen conjugada de uno de los dos puertos de la cámara. Sin embargo, en la fotólisis UV la luz procedente de la DMD deben ser llevados a través de la vía epi-iluminación (Fig. 3A), ya que la lente del tubo de imagen que lleva a la cámara no se corrige la longitud de onda UV en cualquiera de los microscopios disponibles en el mercado. La aberración esférica de la lente del tubo de imagen a 350 nm es lo suficientemente grave como para evitar que la capacidad para enfocar la luz de una situación difícil y para generar suficiente resolución espacial. Este problema no se encuentra en la microscopía confocal, porque el lente del tubo se retira cuando un rayo láser colimado se trae a lo largo del eje óptico misma. El problema de la luz UV puede ser resuelto por traer la luz a través de la vía epi-fluorescencia debido a que el tubo de lentes que son parcialmente corregido la aberración esférica en la longitud de onda UV. Podemos ampliar la óptica de los microscopios en cualquier grado, los deseos de revistas. La comunidad científica es, en general, interesados ​​en este tema rápido y no hay muchas fuentes que se enseña bien.

Con el fin de reducir al mínimo las modificaciones del microscopio y debido a limitaciones de espacio reducido en la unidad de epifluorescencia, la DMD se coloca en un plano de la imagen recién creada conjugado creado por una lente de relé (señalar la posición de la unidad de DMD en relación con la microscopio). Una lente con corrección UV comerciales relevo fue comprado (Óptica Especialidad) (punto en el diagrama y en el microscopio).

Iluminación de la DMD

Al recibir su entrada binaria una micromirror puede cambiar entre un positivo y un negativo de 12 ° de inclinación respecto al plano del chip. El eje de rotación a lo largo de las esquinas de cada espejo diagonal (45 ° a los lados del chip). La orientación de la rotación del espejo es designado por un triángulo de color oro en una esquina en la superficie frontal del chip. El ángulo de inclinación de la micromirror dicta la alineación de la cancha y azithmus del haz de iluminación de entrada. El tono del haz de iluminación debe ser de 24 ° desde el eje perpendicular del chip DMD y necesidades azithmus ser perpendicular al eje de rotación del espejo. Alineación del haz precisa es esencial para un funcionamiento eficiente. En el sistema prototipo que hemos diseñado varios ajustes de inclinación manual que nos ha permitido corregir las insuficiencias de diseño y mecanizado. Esto dio lugar a un sistema que es mucho más voluminoso que es necesario. Disposición alternativa, más compacto para traer a la luz es posible (muestra de diseño alternativo, si se considera útil).

Para los experimentos de fotólisis una fuente de láser se requiere para generar el haz de luz de alta intensidad necesaria para uncaging rápida. Para los experimentos optogenetic donde la luz de alta intensidad muy concretos no es necesario, una fuente de luz no coherente sería adecuado. En el experimento de fotólisis se describe aquí se empleó un diodo casi continuo bombeo de estado sólido (DPSS) triplicó la frecuencia NdVO4 láser (1 W, 355 nm). (Para una discusión detallada de las opciones de fuentes de luz para la fotólisis ver referencia 2). Un láser de potencia relativamente alta se requiere en los experimentos descritos aquí, ya que sólo una pequeña fracción de la potencia del láser se entrega realmente a la muestra cuando se utiliza un sistema de DMD. La cantidad de luz entregada a la muestra es proporcional a la relación entre el número de ON / OFF espejos dentro de la región iluminada por el rayo láser.

Si una fuente de luz láser se requiere, lo mejor es poner en marcha la salida del láser en una fibra multimodo para que pueda ser fácilmente la posición y orientación a lo largo del eje correcto para la iluminación de la DMD. Transmitir la luz a través de la fibra óptica resuelve un segundo problema, la manera de eliminar los patrones de manchas propias de iluminación coherente. La fibra se enrolla alrededor de una camilla de fibras piezoeléctricas (modelo 915, de instrumentación y de Investigación de Canadá, Ltd), que oscila a ~ 40 kHz. (A destacar este hecho en la plataforma) El microscopio de estiramiento de la fibra es suficiente a los movimientos del patrón moteado veces muchos durante la duración de milisegundos de cada pulso de estimulación de fotos, por lo tanto eliminando el efecto de moteado. La salida de la fibra óptica es entonces colimado con un objetivo de microscopio UV (Olympus DApo20UV). (Señalarlo) La calibración de la resolución óptica del sistema se muestra en la figura. 3B. La resolución efectiva fisiológico medido por la amplitud del flujo de corriente en función de la posición del punto de la fotoLa estimulación se muestra en la figura. 3C. Las respuestas actuales a la fotoestimulación de diferentes intensidades se muestra en la figura. 3D.

Funcionamiento del sistema:

Co-registro de la CCD píxeles con los espejos de DMD

Un software de la casa estaba escrito que determina la correspondencia de cada uno de los espejos de DMD píxeles específicos de la cámara de imagen CCD. La interfaz gráfica de usuario (GUI) dentro de este software permite al usuario asignar los espejos DMD que corresponde a la región en la imagen CCD marcados por el ratón. Por lo tanto, la ubicación para la estimulación de fotos se pueden etiquetar con sólo mover el cursor sobre la imagen que aparece en la pantalla del ordenador y haciendo clic en la región de interés marcados. (Una imagen fluorescente de un cenador dendríticas se mostrará en la pantalla del ordenador. El estudiante marca una serie de lugares sobre la imagen en la pantalla del ordenador.)

Programación de los patrones para la entrega de la luz

El patrón marcado en la pantalla del ordenador por parte del operador se almacena como una serie de imágenes separadas. El tiempo de los pulsos del láser para cada patrón espacial se programa en el software que se integra con el programa de adquisición de datos (pCLAMP). (Demostrarlo).

La coordinación de los pulsos de láser a los patrones de DMD

El programa de adquisición de datos inicia y coordina los tiempos de la electrónica de DMD, la compuerta del láser, y la adquisición de la revisión fijada señal eléctrica de la neurona diana. (Simular la secuencia en la computadora)

Los datos experimentales:

No lineales a través de la suma distal puntos de ramificación dendrítica

Integración dendríticas con electrodos ha sido tradicionalmente llevada a cabo por la variación de la amplitud de la estimulación en lugares discretos en lugar de ampliar el área de estimulación, manteniendo una intensidad constante. Las cuestiones relativas a la saturación de electrogénesis y el reclutamiento de canales dependen de la ubicación puede influir en el resultado y la conclusión. Estimulación distribuidos dendríticas pueden ser fácilmente implementados usando un sistema basado en DMD (Fig. 4A). La intensidad de entrada se varió al aumentar el número de puntos de fotoestimulación. Podemos ver que la sumación espacial puede ser no lineal en los puntos de ramificación cada vez más supra-lineal con amplitudes de entrada cada vez que llegan a las dos ramas hija. El supra-linealidad está mediada fundamentalmente receptores NMDA y no a la tensión de los canales cerrada (Fig. 5)

Resultados representante

Figura 1. Funcionamiento de los microespejos en la DMD. (Vista lateral) Las fuerzas electrostáticas dirigido a espejos individuales causar el espejo que se inclina en uno de dos posibles orientaciones de 12 ° sobre la horizontal. En la posición en un haz incidente se dirige a lo largo del eje óptico perpendicular del chip. En la posición de apagado del haz incidente se dirige 48 ° fuera del eje. Luz que incide en las diferencias finas entre los espejos se dirige 24 ° fuera del eje. (Vista superior) la inclinación está orientado 45 º con respecto a los lados de los espejos y el chip.

Figura 2. Disposición básica del microscopio de fluorescencia moderna. El cubo de filtro se coloca en el "espacio infinito" entre el objetivo y la lente del tubo. Hay un camino que conduce a la imagen de la cámara y no es un camino de iluminación que lleva la luz a la muestra. La lente del tubo de paso de luz de estos dos suelen ser diferentes en el diseño y en la longitud focal. La iluminación, pero no la imagen, lente de tubo está diseñado para operar en el espectro UV.

Figura 3. Diseño de sistema de UV basados ​​en DMD. Si la iluminación está en el espectro UV, entonces debe ser llevado a través de la lente del tubo que se corrige por la radiación UV. La lente del tubo en el camino de imagen no está diseñado para UV. Un sistema de relevo que se necesita para crear un plano conjugado de la imagen de fácil acceso. Los planos conjugados diferentes imágenes en el microscopio se caracteriza por líneas de puntos rojos. Patrones brillantes en un plano de la imagen se proyecta en planos conjugados otros. Durante la exploración del patrón en el plano de la muestra se proyecta sobre el detector / cámara. Para la iluminación del patrón generado por la DMD se proyecta sobre la muestra.

Figura 4. Diseño de la luz visible sistema de proyección de DMD. Si la luz de la iluminación está en el rango visible, es posible hasta que la DMD patrón generado la luz a través de la trayectoria de la luz imágenes. Esto puede ser fácilmente implementado con commercial doble adjuntos puerto de la cámara y el espejo dicroico apropiado.

Figura 5. Resolución lateral del sistema. (A) La resolución óptica en el blanco fluorescente ~ 2 micras. (B) Resolución efectiva, medida por fotólisis de glutamato enjaulado a través de una dendrita es de ~ 5 micras. El aumento de la distancia se debe a una combinación de difusión de glutamato y la anchura finita de la dendrita. (C) fotólisis puede simular la cinética de los eventos sinápticos. La familia de la tensión de sujetar las respuestas actuales se debe a las variaciones en la energía de la luz entregada a la dendrita.

Figura 6. No lineal a través de la suma los puntos de ramificación dendrítica. (A) los insumos distribuidos se aplica a dos ramas dendríticas por separado. Sus respuestas respectivas de tensión se muestran a continuación. (B) Los estímulos se le dan al mismo tiempo. La respuesta medida (rojo traza) es diferente a la suma aritmética de las dos respuestas individuales (gris traza).

Suma la figura 7. Supralineal es dependiente de los receptores NMDA. (A) APV, un antagonista selectivo del receptor de NMDA bloquea la suma supralineal. (B) La relación de la intensidad del estímulo y su sensibilidad a los antagonistas de los receptores NMDA se ha trazado.

Discussion

La ventaja del enfoque basado en DMD fotoestimulación es más evidente en situaciones donde el objetivo ocupa un área relativamente grande. Si el objetivo de interés es muy pequeño, como una las espinas dendríticas pocos sistemas secuenciales confocal de barrido y dos fotones es probable que sean el mejor enfoque. Una debilidad importante del enfoque de DMD es el uso ineficiente de la luz disponible. La mayor parte de la luz disponible es necesariamente dirigida a los espejos OFF y no se utiliza.

El sistema basado en DMD es el más adecuado para la operación en el rango visible. Nos anticipamos a los sistemas DMD fotoestimulación base tendrá un impacto significativo cuando se emplea con los experimentos optogenética.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modern upright fluorescent microscope
CCD camera and image acquisition software
Computer and data acquisition/interface system
DLP Discovery Developer Kit
ALP3 USB interface
S2 + Optics w/LED
Dual camera port unit
355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)	DPSS Laser Inc.
Laser shutter Model LS6	Uniblitz
Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915	Canadian Instrument and Research, Ltd		100 um core multimode fiber
Multimode Fiber launcher	Oz Optics
Signal generator			up to 50 kHz
Beam collimator	Olympus Corporation	DApo20UV340
UV relay lens	Special Optics	#: 54-25-60-355